导读:本文包含了表面蛋白抗原论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:分子印迹,抗原表位,碳纳米管,Bt蛋白
表面蛋白抗原论文文献综述
杜亚媚[1]（2016）在《多壁碳纳米管表面Bt蛋白抗原表位分子印迹聚合物研制及性能表征》一文中研究指出分子印迹技术(Molecularly imprinted technique,MIT)是一类模拟抗原-抗体相互作用原理,采用人工方法合成对模板分子具有专一性结合能力聚合物的技术。而抗原表位分子印迹(epitopeimprinting)是最近几年发展起来的一种应用前景较好的分子印迹技术。该方法借鉴生物体中抗体在识别抗原时只需要与抗原的某一特定部分,即抗原决定簇发生作用,即可识别整个抗原的原理,合成的分子印迹聚合物既可以对该抗原表位代表的多肽,又可以对含有该抗原表位的生物大分子具有特异性识别能力,应用在蛋白质分子印迹领域,可以解决蛋白质构象多变,价格昂贵,结合位点过多等缺点,应用前景较好。Bt蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在芽孢形成过程中产生的一类具有特异性杀虫毒性的蛋白质伴孢晶体,可以通过转基因植物残体、根系分泌物等途径进入土壤生态系统,并与矿物以及腐殖质等牢固结合,长时间保持杀虫活性,影响土壤生物多样性和生态学过程,从而产生巨大的生态风险。因此,对生态系统中Bt蛋白释放、迁移的监控是十分必要的。BtCry1Ac蛋白是Cry家族中的重要一员,其抗原决定区中的Domain Ⅱ loop 2位于晶体结构的最顶端,该抗原表位代表的氨基酸序列几乎完全暴露在外。鉴于此,本文以BtCry1Ac蛋白抗原表位Domain Ⅱ loop 2代表的多肽368RRPFNIGINNQQ379(RQ-12)为模板,以丙烯酰胺修饰碳纳米管为基质,以异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸(AAc)、1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([AMIM][PF6])等为功能单体,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(NNMBA)为交联剂,过硫酸铵(AP)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)为引发剂和催化剂,采用自由基引发聚合法(free radical polymerization)和表面分子印迹技术合成Bt蛋白抗原表位分子印迹聚合物,并对影响分子印迹效果的条件进行了优化,对材料的表面形貌、选择性和特异性等进行了评价,主要内容如下:(1)在丙烯酰胺修饰碳纳米管表面接一层preMBA,以降低分子印迹聚合物形成过程中丙烯酰胺修饰碳纳米管自身对模板分子的不可逆吸附,并对preMBA的加入量进行了优化,经过性能评价,将preMBA定为20mg。后续如无特别说明,均将丙烯酰胺修饰碳纳米管表面接枝20mgMBA,然后再合成分子印迹聚合物。(2)在超纯水体系中,以RQ-12为模板分子,以NIPAm,[AMIM][PF6]、以及AAc和NIPAm的混合物作为功能单体,以MBA作为交联剂,采用表面分子印迹技术制备RQ-12分子印迹聚合物,然后以10%AcOH(v/v)溶液对模板分子进行洗脱。在该体系中,使用单一或者混合功能单体,对各组分的含量进行优化,均无明显印迹效果,这可能是因为在该体系中功能单体和模板多肽之间形成的作用力较强,采用10%AcOH(v/v)溶液作为洗脱剂对模板多肽的洗脱效果不理想。(3)在超纯水体系中,以RQ-12为模板分子,以亲水性NIPAm为功能单体,以MBA为交联剂,合成表面分子印迹聚合物。对洗脱条件进行了优化,结果发现以SDS-AcOH混合溶液为洗脱剂,能够洗脱出更多的模板分子,形成更多的印迹空穴,提高分子印迹聚合物的印迹效果。对模板分子及交联剂的含量进行了优化,其最佳合成条件为RQ-12 18mg,NIPAm120mg,MBA1OOmg。对分子印迹聚合物的吸附条件进行了优化,结果发现,pH值为5.5时吸附容量和印迹效果最佳,其对模板RQ-12的吸附量可达218.76mg/g,印迹因子为1.39。合成抗原表位分子印迹聚合物对AE-9,FS-11,RQ-12,FR-14,RQ(O),NK-12等六种不同的多肽分别进行吸附实验,结果发现该材料对RQ-12的印迹效果最好,而对其他几种多肽均无明显的印迹效果。将AE-9、FS-11、RQ-12、FR-14和RQ-12(O)五种多肽混合在一起进行竞争性吸附实验,结果发现合成的抗原表位分子印迹聚合物对RQ-12的印迹因子可以达到2.14,而对其他多肽均无明显印迹效果。以上研究表明合成的抗原表位分子印迹聚合物对Bt蛋白抗原表位代表的多肽具有较好的印迹效果和选择性吸附能力。(4)考察上述(3)合成的抗原表位分子印迹聚合物对目标BtCry1Ac蛋白的吸附容量、印迹效果和选择性,结果发现:在pH 8.9和9.9的碱性条件下,该抗原表位分子印迹聚合物对BtCry1Ac蛋白具有稳定的印迹效果。与BSA、BHb、HSA、LZM和Try等蛋白相比,其对BtCry1Ac蛋白的印迹效果最好,体现出对Bt蛋白较强的选择性吸附能力。最后,采用分子印迹和空白分子印迹聚合物对苏云金芽孢杆菌培养液中的BtCry1Ac蛋白进行了纯化,采用SDS-PAGE对吸附后及洗脱后溶液进行了分析,结果发现该分子印迹聚合物对BtCry1Ac蛋白的吸附容量更大,其洗脱液中BtCry1Ac蛋白的纯度较高,洗脱总量更大,证实在实际样品中,该分子印迹聚合物对BtCry1Ac蛋白也表现出较强的选择性。(本文来源于《华中农业大学》期刊2016-06-01）
戴茜茜[2]（2016）在《以CotB为分子载体表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草杆菌重组芽孢的研究》一文中研究指出本研究将猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白COE1保护性抗原片段与枯草杆菌芽孢衣壳蛋白CotB基因进行融合,通过同源双交叉构建表面展示S蛋白COE1保护性抗原片段的枯草杆菌重组芽孢。以小鼠为动物模型,通过灌胃及拌料方式给予重组芽孢,观察重组芽孢对小鼠的免疫反应及部分微生态益生效应,以期依靠枯草杆菌天然的益生作用结合PEDV保护性抗原表位刺激的特异性黏膜免疫反应,用于预防猪流性型腹泻病以降低其对畜牧业带来的影响。试验内容与结果如下：(1)本试验参考PEDV S蛋白抗原表位现有研究,选择PEDV S基因的保护性抗原片段(COE1),通过枯草杆菌穿梭整合质粒pDG364分别将目的片段CotB、COE1依次连接到质粒pDG364多克隆位点,构建重组质粒pDG364-CotB-COE,。对重组质粒分别进行PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明CotB、COE1基因片段成功地载入质粒pDG364多克隆位点,成功构建重组质粒pDG364-CotB-COE1。(2)重组质粒pDG364与枯草杆菌染色体通过同源双交叉,使得CotB-COE1重组于枯草杆菌染色体,构建重组枯草芽孢杆菌(PBE)。通过淀粉酶活性分析与PCR鉴定,结果表明CotB-COE1融合基序成功整合于枯草杆菌染色体；Western-blot分析结果在67.78kDa处获得一条特异性蛋白条带,表明融合基序CotB-COE1获得了表达；使用生物素标记抗体进行免疫荧光显微镜观察,重组芽孢具有特异性荧光信号,结果表明PEDVS蛋白的COE1保护性抗原片段成功地在枯草杆菌芽孢表面获得表达。(3)选用ICR雌性小鼠120只,随机平均分成5组,即枯草杆菌重组芽孢灌胃组(gb)、枯草杆菌重组芽孢拌料组(bb)、野生型枯草杆菌168芽孢灌胃组(g1)、野生型枯草杆菌168芽孢拌料组(b1)、PBS对照组(K)。g1与gb组小鼠每次每只灌服芽孢悬液100μ1(芽孢量为1.0×1010CFU); b1与bb组则以拌料饲喂的方式给予小鼠芽孢,饲料含芽孢量为1.0×106CFU/g; K组为PBS对照组,仅饲喂基础日粮。采集血液、小肠内容物,测定血清中抗PEDV特异性IgG抗体水平及小肠内容物中sIgA抗体水平。结果表明,重组芽孢灌胃或拌料组小鼠血清及小肠内容物中均检测到PEDV特异性抗体,且各组在21d后可检测到明显的抗体水平,第35d抗体水平达到最高峰,至49天仍能检测到较高水平的抗体：重组芽孢灌胃或拌料组与野生型芽孢灌胃或拌料组、对照组抗体水平相比,差异极显着(P<0.01);另重组芽孢拌料组所诱导的血清IgG与肠粘膜sIgA抗体水平均高于灌胃组,但差异不显着(P>0.05)。(4)采用MTT法检测脾细胞增殖及采用ELISA检测IL-4、IFN-γ分泌情况。结果,各组间小鼠脾细胞增殖刺激指数(SI)差异不显着(P>0.05)：重组芽孢灌胃组IL-4和IFN-γ水平极显著高于野生型芽孢灌胃组、对照组(P<0.01)；重组芽孢拌料组IL-4和IFN-γ水平极显著高于野生型芽孢拌料组和PBS对照组(P<0.01),重组芽孢拌料组IL-4水平极显着高于重组芽孢灌胃组(P<0.01),但重组芽孢灌胃组所分泌IFN-γ水平则略高于重组芽孢拌料组(P>0.05)。(5)对试验49d小鼠盲肠内容物进行活菌计数及PCR-DGGE分析。结果表明,枯草杆菌重组芽孢灌胃或拌料组较对照组增重显着(p<0.05),其中灌胃组增重略低于拌料组,但各组间差异不显着(p>0.05);对照组盲肠内容物中大肠杆菌数量较其它组高,灌胃、拌料重组与非重组芽孢组盲肠内容物中乳酸杆菌数量则明显高于对照组；PCR-DGGE分析显示饲喂枯草杆菌芽孢组小鼠盲肠内菌群数量和密度均得到增加。各组间胸腺指数差异不显着(p>0.05),重组芽孢组小鼠脾脏指数极显着高于野生型芽孢组、对照组(p<0.01)；综上所述,本试验成功地将猪流行性腹泻病毒的S蛋白保护性抗原片段COE1整合于枯草芽孢杆菌基因组。经免疫荧光显微镜观察及Western-Blot鉴定枯草杆菌重组芽孢具有较好的免疫原性。动物试验结果表明枯草杆菌重组芽孢可诱导小鼠产生一定水平的抗猪流行性腹泻病毒的体液免疫反应和细胞免疫反应。另枯草杆菌重组芽孢能促进小鼠生长,提高盲肠优势菌群数量,增加肠道菌群结构的多样性、丰度和菌群的稳定性,提高脾脏指数。(本文来源于《四川农业大学》期刊2016-06-01）
汪鹏程,熊小路,焦俊,龚文平,杨小梅[3]（2015）在《贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析》一文中研究指出目的使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性。另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%,GroEL为25.0%,Mip为25.0%,OmpH为25.0%,RplL为13.9%。结论这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断。(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2015年12期）
古文雅,梁雪清,麦璟莹,马长玲,袁竹青[4]（2015）在《肺炎链球菌表面粘附素A蛋白抗原表位的预测筛选及确定》一文中研究指出【目的】确定肺炎链球菌表面粘附素A(Psa A)蛋白抗原的B细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞表位。【方法】通过生物信息学方法预测肺炎链球菌Psa A蛋白分子小鼠B细胞线性表位、MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)及MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)并人工合成相应肽段;克隆重组质粒BL21/p ET/Psa A并得到纯化的r Psa A蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组和对照组小鼠的血清分别与人工合成的候选B细胞表位肽段进行间接ELISA检测,筛选B细胞表位;分离小鼠脾及淋巴结细胞并分别与人工合成的T细胞候选表位肽段体外共培养,取上清进行双夹心ELISA检测IFN-γ的量进行初步筛选。用初筛到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式检测,确定Psa A蛋白分子T细胞表位。【结果】分析Psa A蛋白分子的B细胞表位及MHC-Ⅰ结合肽、MHC-Ⅱ结合肽;得到候选B细胞表位肽10条,MHC-Ⅰ结合肽21条,MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成。利用分子生物学技术获得了r Psa A蛋白并成功免疫了小鼠。间接ELISA结果显示:肽段PB2、PB6,PB7与r Psa A免疫小鼠的血清发生反应,其OD450nm读数比相应的阴性对照小鼠显着升高;双夹心ELISA结果初步提示:肽段PⅠ10、PⅠ14、PⅠ17、PⅠ18、PⅠ21以及肽段PⅡ2、PⅡ5、PⅡ6刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高。细胞流式结果进一步确定:经肽段PⅡ2、PⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性细胞百分比较对照小鼠细胞显着升高;经肽段PⅠ14、PⅠ17、PⅠ21刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性细胞的百分比较对照小鼠细胞显着升高。【结论】确定了肺炎链球菌Psa A蛋白分子的3个B细胞线性表位;2个CD4 T细胞表位;3个CD8 T细胞表位。(本文来源于《中山大学学报(医学科学版)》期刊2015年01期）
张剑英,凌均棨[5]（2015）在《表面蛋白抗原P及其在变异链球菌生物膜形成中的作用》一文中研究指出变异链球菌表面蛋白抗原(SPA)P是一类介导细菌黏附和生物膜形成的重要的黏附毒力因子,具有高度保守性。SPAP含有1 561个氨基酸残基,其线性结构氨基酸序列由前导肽区、N端、A区、V区、P区、C端和细胞壁锚着端组成。SPAP具有的淀粉样纤维特性,在细菌生物膜形成中十分重要。SPAP可与牙面获得性膜中的唾液成分结合,介导变异链球菌对牙面的初始黏附。SPAP通过分选酶转移肽共价结合到细菌胞壁表面,在内源性的表面蛋白释放酶作用下又可从细菌胞壁表面释放出来,从而使变异链球菌生物膜降解。本文就SPAP的结构、淀粉样纤维特性,变异链球菌黏附,SPAP各区在生物膜形成中的作用等研究进展作一综述,明确其生物学特性,对于龋病病因学和龋病防治的意义不言而喻。(本文来源于《国际口腔医学杂志》期刊2015年01期）
张雅岭,王凯,陈芳玲,曾晓飞,吴文德[6]（2014）在《伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用》一文中研究指出试验旨在建立一种能鉴定水牛临床感染伊氏锥虫的方法。试验以纯化的伊氏锥虫3D7腹水单抗作为包被抗体,HRP标记的伊氏锥虫5B9单抗作为第2抗体,建立了检测伊氏锥虫变异表面糖蛋白(variant surface glucoprotein,VSG)抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行了灵敏度、特异性试验及初步检测应用试验。结果显示,用该法检测阳性血清,1∶3200稀释时其D450nm值仍大于阴阳临界值;交叉反应试验结果显示,其不与泰勒虫、弓形虫、衣原体、大片吸虫等抗原发生交叉反应,表明该法具有良好的检测特异性;用该法检测了当地82份水牛血清,阳性率为9.76%。结果表明本研究建立的伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心ELISA方法检测灵敏度高、特异性好,能作为检测水牛临床感染伊氏锥虫的有效方法,对于临床伊氏锥虫病的诊断和防控具有重要意义。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2014年02期）
杨宁宁,何奎芳[7]（2013）在《口腔链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ的叁维结构和相关功能》一文中研究指出表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(AgⅠ/Ⅱ、P1、PAc、SpaP、SspA、SspB等)广泛存在于口腔链球菌细胞壁表面,介导变异链球菌、表兄链球菌、格登链球菌等口腔链球菌与牙表面的黏附,影响牙菌斑的形成,是影响龋病形成和发展的主要毒力因子之一。自有研究报道了变异链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ的V区(SpaP-V)晶体结构之后,陆续有其AgⅠ/Ⅱ的叁维结构、格登链球菌V区(SspB-V)的叁维结构和C末端(SspB-C)的叁维结构见诸报道,逐步揭示了口腔链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ的叁维立体结构,进一步解释了其功能机制。本文就口腔链球菌表面蛋白抗原的叁维结构和相关功能表位的研究情况作一综述。(本文来源于《国际口腔医学杂志》期刊2013年05期）
布日额[8]（2011）在《牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白抗原性研究》一文中研究指出(本文来源于《第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集》期刊2011-09-01）
刘霄卉[9]（2011）在《JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备》一文中研究指出研究背景:绵羊肺腺癌(ovine pulmonary adenocarcinoma, OPA)是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病,世界动物卫生组织将其列为B类传染病。目前国内对该病的诊断主要依靠常规病理学方法检测,严重障碍了我国对OPA的防控。主要目的:建立快速特异的实验室及适用于基层的诊断方法,为临床及基层检测诊断提供技术支持,为进一步分析表面蛋白( surface protein,SU)蛋白的功能、疫苗设计及对JSRV的生物学特性研究提供素材。研究方法:以获得的叁株抗JSRV-SU蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗,应用噬菌体展示结合肽探针扫描技术,鉴定叁株单抗所识别的线性表位;并应用非竞争性ELISA法测定叁株单抗的功能性亲和常数;以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本,以纯化的多抗和单克隆抗体为基本检测试剂,建立双抗体夹心ELISA检测方法;针对外源性JSRV U3区设计特异性引物,建立JSRV的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothennalamplification ,LAMP)检测方法,并以700ng健康羊基因组DNA为背景进行敏感性和特异性试验;通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定;运用基因重组方法构建JSRVenv重组真核表达质粒,并通过脂质体转染建立稳定表达细胞系。研究结果:1.叁株单抗3B3、3D6、1D6的亲和常数分别为5.06×10~9 L/mol﹑5.82×10~9 L/mol﹑ 2.91×10~9 L/mol ;且其所对应的抗原表位分别为W~(156)APEGTPD~(163),F~(71)SYQSQHPHCI~(81),D98EKTGKR~(104);2.首次基于JSRV-SU蛋白的单抗建立了夹心ELISA法,并建立了阴性与阳性的判定标准(当P/N≥2.21时判为阳性;当P/N<1.85时判为阴性;当2.21>P/N≥1.85时判为可疑);3.在国内首次基于内外源性病毒长末端重复序列( long terminal repeat ,LTR)的差异建立了LAMP诊断方法,所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对内源性JSRV的扩增结果为阴性,该方法对JSRV前病毒DNA的最小检测限为10拷贝,灵敏性高于一步PCR方法。LAMP和特异性PCR及套式PCR方法检测临床样品的符合率分别为92 %和100%;4.通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定,结果发现,本研究克隆的pMD-exJSRVenv1属于Ⅱ型exJSRV;而pMD-exJSRVenv2属于Ⅰ型exJSRV;在exJSRV氨基酸序列中存在“YXXM”基序;绵羊ras基因与已知其他物种的该段基因作比对差异率较小,基本保守,且与牛的ras基因同源性最高;5.成功构建了含有env及tm基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-env及pcDNA3.1-TM-HA,并建立了稳定表达JSRV囊膜蛋白(Env)及其TM亚基的HepG2细胞系。结论:本研究建立了特异性检测JSRV的夹心ELISA法和LAMP法,对于我国养羊业的健康发展,具有重要的实用价值,对研究OPA防制措施等均有重要意义。另外,JSRV env基因的克隆和表达及对绵羊ras基因的序列分析,对于丰富JSRV的分子发病机理以及为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系搭建了重要的实验平台。(本文来源于《内蒙古农业大学》期刊2011-04-01）
曾晓飞,陈汉忠,韦英益,何木荣,李晓栩[10]（2009）在《抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制》一文中研究指出用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白(variant surface glucoprotein,VSG)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次克隆和间接ELISA方法筛选,获得3D7、5B9 2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小鼠腹水效价,其中细胞培养上清效价分别为1∶6400和1∶12800,腹水效价分别为1∶105和1∶106。单抗的亚型鉴定结果表明,3D7、5B9分泌的抗体都为IgG1亚类κ链。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2009年10期）
表面蛋白抗原论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本研究将猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白COE1保护性抗原片段与枯草杆菌芽孢衣壳蛋白CotB基因进行融合,通过同源双交叉构建表面展示S蛋白COE1保护性抗原片段的枯草杆菌重组芽孢。以小鼠为动物模型,通过灌胃及拌料方式给予重组芽孢,观察重组芽孢对小鼠的免疫反应及部分微生态益生效应,以期依靠枯草杆菌天然的益生作用结合PEDV保护性抗原表位刺激的特异性黏膜免疫反应,用于预防猪流性型腹泻病以降低其对畜牧业带来的影响。试验内容与结果如下：(1)本试验参考PEDV S蛋白抗原表位现有研究,选择PEDV S基因的保护性抗原片段(COE1),通过枯草杆菌穿梭整合质粒pDG364分别将目的片段CotB、COE1依次连接到质粒pDG364多克隆位点,构建重组质粒pDG364-CotB-COE,。对重组质粒分别进行PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明CotB、COE1基因片段成功地载入质粒pDG364多克隆位点,成功构建重组质粒pDG364-CotB-COE1。(2)重组质粒pDG364与枯草杆菌染色体通过同源双交叉,使得CotB-COE1重组于枯草杆菌染色体,构建重组枯草芽孢杆菌(PBE)。通过淀粉酶活性分析与PCR鉴定,结果表明CotB-COE1融合基序成功整合于枯草杆菌染色体；Western-blot分析结果在67.78kDa处获得一条特异性蛋白条带,表明融合基序CotB-COE1获得了表达；使用生物素标记抗体进行免疫荧光显微镜观察,重组芽孢具有特异性荧光信号,结果表明PEDVS蛋白的COE1保护性抗原片段成功地在枯草杆菌芽孢表面获得表达。(3)选用ICR雌性小鼠120只,随机平均分成5组,即枯草杆菌重组芽孢灌胃组(gb)、枯草杆菌重组芽孢拌料组(bb)、野生型枯草杆菌168芽孢灌胃组(g1)、野生型枯草杆菌168芽孢拌料组(b1)、PBS对照组(K)。g1与gb组小鼠每次每只灌服芽孢悬液100μ1(芽孢量为1.0×1010CFU); b1与bb组则以拌料饲喂的方式给予小鼠芽孢,饲料含芽孢量为1.0×106CFU/g; K组为PBS对照组,仅饲喂基础日粮。采集血液、小肠内容物,测定血清中抗PEDV特异性IgG抗体水平及小肠内容物中sIgA抗体水平。结果表明,重组芽孢灌胃或拌料组小鼠血清及小肠内容物中均检测到PEDV特异性抗体,且各组在21d后可检测到明显的抗体水平,第35d抗体水平达到最高峰,至49天仍能检测到较高水平的抗体：重组芽孢灌胃或拌料组与野生型芽孢灌胃或拌料组、对照组抗体水平相比,差异极显着(P<0.01);另重组芽孢拌料组所诱导的血清IgG与肠粘膜sIgA抗体水平均高于灌胃组,但差异不显着(P>0.05)。(4)采用MTT法检测脾细胞增殖及采用ELISA检测IL-4、IFN-γ分泌情况。结果,各组间小鼠脾细胞增殖刺激指数(SI)差异不显着(P>0.05)：重组芽孢灌胃组IL-4和IFN-γ水平极显著高于野生型芽孢灌胃组、对照组(P<0.01)；重组芽孢拌料组IL-4和IFN-γ水平极显著高于野生型芽孢拌料组和PBS对照组(P<0.01),重组芽孢拌料组IL-4水平极显着高于重组芽孢灌胃组(P<0.01),但重组芽孢灌胃组所分泌IFN-γ水平则略高于重组芽孢拌料组(P>0.05)。(5)对试验49d小鼠盲肠内容物进行活菌计数及PCR-DGGE分析。结果表明,枯草杆菌重组芽孢灌胃或拌料组较对照组增重显着(p<0.05),其中灌胃组增重略低于拌料组,但各组间差异不显着(p>0.05);对照组盲肠内容物中大肠杆菌数量较其它组高,灌胃、拌料重组与非重组芽孢组盲肠内容物中乳酸杆菌数量则明显高于对照组；PCR-DGGE分析显示饲喂枯草杆菌芽孢组小鼠盲肠内菌群数量和密度均得到增加。各组间胸腺指数差异不显着(p>0.05),重组芽孢组小鼠脾脏指数极显着高于野生型芽孢组、对照组(p<0.01)；综上所述,本试验成功地将猪流行性腹泻病毒的S蛋白保护性抗原片段COE1整合于枯草芽孢杆菌基因组。经免疫荧光显微镜观察及Western-Blot鉴定枯草杆菌重组芽孢具有较好的免疫原性。动物试验结果表明枯草杆菌重组芽孢可诱导小鼠产生一定水平的抗猪流行性腹泻病毒的体液免疫反应和细胞免疫反应。另枯草杆菌重组芽孢能促进小鼠生长,提高盲肠优势菌群数量,增加肠道菌群结构的多样性、丰度和菌群的稳定性,提高脾脏指数。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
表面蛋白抗原论文参考文献
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