大熊猫源融合魏斯氏菌分离鉴定及其对小鼠肠黏膜屏障功能的影响

论文摘要

大熊猫是我国的珍稀物种,如何更好的保护大熊猫一直是研究的热点。融合魏斯氏菌作为潜在的益生菌,对其在动物上的应用效果研究报道较少。本研究从大熊猫粪样中分离得到一株融合魏斯氏菌,结合体内外试验,旨在探究融合魏斯氏菌的益生性能以及对动物肠黏膜屏障功能的影响。首先从大熊猫粪样中通过平板分离、划线纯化的方法初步分离得到乳酸菌菌株,再经体外拮抗病原菌试验、体外抗氧化试验等体外益生特性试验筛选出一株,经生理生化鉴定和16S rRNA序列测定确定为融合魏斯氏菌,并对其进行了初步的安全性检测,证明其没有致病菌特性后,用于进一步的动物试验。选取72只昆明小鼠,试验首先采用混合抗生素处理,造模伪无菌小鼠模型后,采用每日灌胃新鲜大熊猫粪样,持续4天的方法来构建大熊猫源化小鼠模型,小鼠造模成功后,采用ETEC进行攻毒处理,观察到小鼠出现腹泻症状后,停止攻毒,不同试验组分别采用不同浓度的融合魏斯氏菌悬液进行灌胃,持续5d,采集各组小鼠血清样本及空肠和回肠组织样本,采用qPCR技术检测小鼠空肠和回肠紧密连接蛋白相关基因mRNA水平以及小鼠肠道菌群中某些菌属的定量检测,ELISA检测小鼠血清中D-乳酸以及小鼠空肠、回肠黏膜SIgA浓度,PCR-DGGE技术检测采用融合魏斯氏菌治疗后小鼠肠道菌群的丰富度等变化情况。以全面探究大熊猫源融合魏斯氏菌对大熊猫源化小鼠肠黏膜屏障功能的影响。结果如下:从大熊猫粪样中分离得到一株融合魏斯氏菌,命名为Weissella confusa BSP201703,该菌株具有良好的拮抗病原菌的能力,对试验采用的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用均较好。同时该菌株同时具有良好的体外抗氧化能力,对DPPH等几种自由基均具有清除能力,能够在pH 3的环境以及0.3%胆盐环境中存活。通过PCR-DGGE技术检测小鼠大熊猫源化前后粪样中菌群的丰富度及相似性结果显示,采用抗生素混合饮水后,小鼠肠道微生物种类显著减少,有利于外来微生物的定植,在定植大熊猫粪样后,小鼠肠道微生物丰富度开始上升,且与大熊猫肠道菌群的相似性达到43%。证明构建大熊猫源化小鼠模型成功。小鼠在使用ETEC K88感染后,出现粪便稀薄,精神不振的现象,部分小鼠粪便中带有血丝,使用融合魏斯氏菌（W.confusa）BSP201703进行治疗后可缓解因攻毒ETEC引起的小鼠体重下降,同时可以增加粪样中拟杆菌门和乳杆菌属的数量（无统计学差异）,与攻毒对照组C3组相比,灌胃不同浓度W.confusa的W1、W2、W3组小鼠的回肠绒毛的炎性细胞浸润明显减轻,空肠、回肠黏膜中分泌型IgA（SIgA）分泌量增加,血清中D-乳酸的浓度降低。荧光定量PCR（qPCR）结果显示灌胃融合魏斯氏菌后小鼠空肠、回肠组织中紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin-1和Claudin-1表达量与攻毒组相比均有上升。PCR-DGGE分析显示经W.confusa灌胃治疗后小鼠肠道菌群的丰富度和多样性均有提升,qPCR检测厚壁菌门、乳杆菌属等特定菌群的结果显示,经W.confusa灌胃治疗后菌群数量有了一定的提升,但没有显著性差异。综上所述,大熊猫源融合魏斯氏菌具有较好的益生菌潜力,本试验首次研究了融合魏斯氏菌对动物肠黏膜屏障功能的影响,结果显示其对ETEC攻毒后产生的肠黏膜屏障功能受损具有保护作用,其可能的作用机理需要进一步的探究,本试验初步研究的结果显示融合魏斯氏菌BSP201703可能是通过促进肠黏膜屏障相关蛋白的基因表达,以及刺激SIgA分泌来增强肠黏膜屏障功能。

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摘要

ABSTRACT

缩略表（ABBREVIATIONS）

1.文献综述

1.1 大熊猫研究现状

1.2 益生菌

1.3 魏斯氏菌属概述

1.4 肠黏膜屏障组成

1.5 肠道菌群源化小鼠模型

2.目的和意义

3.材料和方法

3.1 试验材料与试验菌株

3.2 试验动物

3.3 主要试剂

3.4 主要仪器

3.5 魏斯氏菌的分离与筛选

3.5.1 菌株分离

3.5.2 病原菌拮抗试验

3.5.3 体外抗氧化试验

3.5.4 表面疏水性与自聚集能力

3.6 待测菌株的生理生化鉴定及16SR RNA序列测定

3.7 生长曲线测定与酸耐受性、胆盐耐受性试验

3.8 抗生素敏感性试验

3.9 溶血性检测

3.10 动物试验

3.10.1 伪无菌小鼠模型构建

3.10.2 大熊猫源化小鼠模型构建

3.10.3 产肠毒素大肠杆菌攻毒处理

3.10.4 融合魏斯氏菌灌胃处理

3.11 样品采集

3.12 血清D-乳酸浓度检测

3.13 QPCR检测小鼠肠道菌群丰度

3.14 QPCR检测紧密连接相关基因表达

3.15 ELISA检测小鼠肠黏膜SIGA分泌量

3.16 PCR-DGGE检测小鼠肠道菌群丰富度变化

3.17 数据分析

4.结果

4.1 乳酸菌的分离结果

4.2 病原菌拮抗试验

4.3 体外抗氧化能力

4.4 表面疏水性与自聚集能力

4.5 生理生化鉴定及16S RRNA序列测定结果

4.6 菌株X3 生长曲线

4.7 菌株X3 耐酸、耐胆盐能力测定

4.8 抗生素敏感性

4.9 溶血性检测

4.10 小鼠伪无菌、大熊猫源化处理结果

4.11 小鼠攻毒处理后症状及魏斯氏菌灌胃后症状

4.12 小鼠体重变化

4.13 小鼠血清D-乳酸浓度与空肠、回肠黏膜SIGA浓度

4.14 小鼠空肠、回肠紧密连接蛋白MRNA水平表达情况

4.15 小鼠肠道菌群变化情况

5.讨论

5.1 魏斯氏菌的益生性能

5.2 试验分离得到融合魏斯氏菌BSP201703 的体外益生性能

5.3 融合魏斯氏菌BSP201703 的抗生素耐受性与溶血性

5.4 益生菌对肠黏膜屏障功能的保护

5.5 魏斯氏菌对肠黏膜屏障功能的影响

6.结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 熊律晨

导师: 曾东

关键词: 大熊猫,益生菌,融合魏斯氏菌,小鼠,肠黏膜屏障

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000607

总页数: 56

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大熊猫源融合魏斯氏菌分离鉴定及其对小鼠肠黏膜屏障功能的影响

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