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产纤溶酶凝结芽孢杆菌的筛选及其纤溶酶酶学性质研究

2020-12-02阅读(299)

产纤溶酶凝结芽孢杆菌的筛选及其纤溶酶酶学性质研究

论文摘要

凝结芽孢杆菌兼具芽孢杆菌属和乳杆菌属的特征,已广泛用于各种商业食品及保健品中。血栓性疾病（thrombotic disease,TD）是目前严重影响人类健康甚至导致死亡的疾病之一,且近年来发病率呈不断上升的趋势。利用纤溶酶溶解形成血栓的纤溶蛋白是预防和治疗血栓性疾病的主要方法。微生物因其种类丰富、易培养且繁殖快等特点成为开发新的纤溶酶的重要资源。因此,从传统发酵食品中筛选出产纤溶酶的凝结芽孢杆菌,并对其产生纤溶酶进行研究,具有重要的意义。本研究从豆豉等传统发酵食品中分离到一株产较高活性纤溶酶的菌株,对该菌株进行菌种鉴定、基本生物学特性的研究,并对其所产纤溶酶BCF进行基础酶学性质初步分析及氨基酸序列测定等研究,主要研究结果如下:（1）从豆豉等传统发酵食品中采用脱脂乳平板初筛和纤维蛋白平板复筛方法分离到8株产纤溶酶的菌株,并从中筛选出一株具有较高活性的菌株,命名为HQ-1,测得其发酵上清液酶活力为383.1 U/mL。根据形态观察、生理生化鉴定结果和16S rDNA序列的测定比对结果,确定菌株HQ-1为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。并将其所产纤溶酶命名为BFC。（2）菌株HQ-1部分生物学特性研究结果表明:菌株HQ-1对阿莫西林等11种常见抗生素敏感,对利福平和红霉素为中间敏感,对青霉素具有耐药性;对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有一定抑菌活性,其抑菌圈直径分别达19.3±0.2 mm、18.8±0.4 mm和16.6±0.1 mm;HQ-1对人工模拟肠胃液具有较好的耐受能力,在pH2.0的人工模拟胃液中培养存活率达64.3%,活菌数为5.1×109CFU/mL,随后经人工肠液处理后存活率为85.7%,活菌数为4.0×109CFU/mL。（3）菌株HQ-1发酵上清液经50%80%硫酸铵饱和度分级沉淀进行粗蛋白提取,再经过DEAE-Sephadex A-25阴离子交换柱层析等手段处理,获得纤溶酶BCF浓缩粗酶液,结合Native-PAGE与SDS-PAGE结果表明浓缩粗酶液中具有纤溶活性组分为一种。以此粗酶液进行基础酶学特性研究表明:纤溶酶BCF通过激活纤溶酶原方式降解纤维蛋白;且该酶的最适反应温度为45℃,最适pH为6.0,Ca2+及Mg2+对纤溶酶BCF酶活有激活作用,K+、Na+、Fe2+、Cu2+和Ba2+对其活性有轻微的抑制作用;抑制剂PMSF能完全抑制纤溶酶BCF的活性,EDTA纤溶酶BCF活性较明显,而β-巯基乙醇和胃酶抑素A对该酶活性无明显影响,说明纤溶酶BCF可能是丝氨酸蛋白酶类。（4）回收纤溶酶BCF活性电泳条带,送生物公司测定其氨基酸序列。测定结果表明纤溶酶BCF由245个氨基酸残基组成,氨基酸序列同源比对结果表明BCF氨基酸序序列结与果已设报计道简的并其引他物生,物以来凝源结的芽纤孢溶杆酶菌基因片本段论b文cf分并离送筛测选序到,一测株序产结纤果溶表酶明的基新因型片凝序HQ列-1不同菌段结b,液是为一模种板新扩型增芽cf孢全杆长菌（73B5a）纤纤溶溶酶酶cbipll。us co。agulaB根CF据n[sHQ-1氨对基应酸编测码。÷对该菌进行基础生物学性质研究;对其所产纤溶酶BCF进行初步浓缩和基础酶学性质研究;测定纤溶酶BCF氨基酸序列并根据该测序结果预测其编码基因序列,以期为该菌及其所产纤溶酶的进一步开发和利用提供必要的理论依据。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 主要英汉及缩略词对照
  • 1 前言
  •   1.1 凝结芽孢杆菌研究进展
  •     1.1.1 凝结芽孢杆菌生物学性质
  •     1.1.2 凝结芽孢杆菌的应用
  •   1.2 血栓类疾病概述
  •     1.2.1 血栓性疾病的形成
  •     1.2.2 血栓性疾病的分类及危害
  •     1.2.3 血栓性疾病的预防和治疗
  •   1.3 微生物源纤溶酶产生菌的分离
  •   1.4 微生物源纤溶酶及其酶学性质的研究
  •   1.5 研究目的与意义
  •   1.6 研究内容和技术路线
  •     1.6.1 研究内容
  •     1.6.2 技术路线
  • 2 材料与方法
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 样品
  •     2.1.2 指示菌
  •     2.1.3 主要试剂与培养基
  •     2.1.4 试验仪器与设备
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 产纤溶酶凝结芽孢杆菌的分离与鉴定
  •     2.2.2 产纤溶酶凝结芽孢杆菌的生物学特性
  •     2.2.3 纤溶酶BCF粗酶液制备
  •     2.2.4 纤溶酶BCF酶学性质的初步研究
  •     2.2.5 纤溶酶BCF氨基酸序列测序与基因扩增
  •   2.3 数据处理
  • 3 结果与分析
  •   3.1 产纤溶酶凝结芽孢杆菌的分离与鉴定
  •     3.1.1 产纤溶酶凝结芽孢杆菌的分离
  •     3.1.2 纤溶酶活力的测定
  •     3.1.3 产纤溶酶凝结芽孢杆菌的鉴定
  •   3.2 菌株HQ-1 生物学性质研究
  •     3.2.1 生长曲线的测定
  •     3.2.2 菌株HQ-1 药敏性试验
  •     3.2.3 菌株HQ-1 的抑菌试验
  •     3.2.4 人工胃液耐受性试验
  •     3.2.5 人工肠液耐受性试验
  •   3.3 纤溶酶BCF粗酶液制备
  •     3.3.1 纤溶酶BCF盐析粗蛋白提取
  •     3.3.2 DEAE-Sephadex A-25 离子交换层析分离效果
  •     3.3.3 浓缩粗酶液中纤溶酶活性成分分析
  •     3.3.4 纤溶酶BCF粗酶液浓缩效果评价
  •   3.4 纤溶酶BCF酶学性质的初步研究
  •     3.4.1 纤溶酶BCF组分激酶活性检测
  •     3.4.2 不同作用温度对纤溶酶BCF活性的影响
  •     3.4.3 不同pH对纤溶酶BCF活性的影响
  •     3.4.4 不同金属离子对纤溶酶BCF活性的影响
  •     3.4.5 不同酶抑制剂对纤溶酶BCF活性的影响
  •   3.5 纤溶酶BCF序列预测
  •     3.5.1 样品切胶回收活性验证
  •     3.5.2 纤溶酶BCF氨基酸序列测定及分析
  •     3.5.3 纤溶酶BCF基因bcf扩增
  • 4 讨论
  •   4.1 产纤溶酶凝结芽孢杆菌的筛选
  •   4.2 产纤溶酶凝结芽孢杆菌生物学性质的研究
  •   4.3 凝结芽孢杆菌HQ-1 纤溶酶BCF酶学性质的研究
  •   4.4 凝结芽孢杆菌HQ-1 纤溶酶BCF氨基酸序列和基因bcf序列预测
  • 5 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 创新点
  •   5.3 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 周倩

    导师: 胡欣洁

    关键词: 凝结芽孢杆菌,纤溶酶,筛选,生物学性质,酶学性质,序列预测

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,有机化工,轻工业手工业

    单位: 四川农业大学

    分类号: TS201.3;TQ464.8

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000527

    总页数: 67

    文件大小: 2025K

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