兰秀夫[1]2003年在《兔跟腱缓慢牵伸延长的实验研究》文中认为肌腱缺损一直是肌腱外科的一大难题，制约了手外科功能重建的进一步发展，虽然近年来取得了很大的进步，但到目前为止仍没有一种理想的治疗方法。肌腱移植是目前临床上最常用的方法，但存在着一定的局限性。随着组织工程的发展，人们开始把目光投向组织工程,但由于实验所用材料（细胞外基质）的孔隙率过大，细胞易于流失，加上体外构建的肌腱缺乏应有的应力刺激，故其生物力学强度达不到正常肌腱的生理需求，目前该方法应用于临床还有很长的路要走。为了寻找一种治疗肌腱缺损的新方法，我们从肢体延长的动物模型中得到启发，肢体延长主要是靠骨断端的骨痂生长而达到延长的目的，而肌腱切断后首先在其断端形成肉芽组织，有人将其称之为肌腱痂，为此，我们设想在体内将肌腱切断并修复好腱周膜，使其中间形成肌腱痂，通过缓慢牵伸刺激其生长而达到延长的目的，并对其延长区进行相关研究，来探讨治疗肌腱缺损的可行性。本实验以兔跟腱为研究对象，首次将兔跟腱切断并修复好腱周膜，使其断端形成肌腱痂，应用缓慢牵伸应力作用于兔体内的肌腱痂，观察其在缓慢牵伸应力作用下发生的变化。自行设计肌腱牵伸延长器(TE)，应用该延长器作用于兔跟腱断端的肌腱痂使其缓慢延长。选择健康成年日本大耳白兔48只，随机分为实验组和对照组，分为3、6、9、12周4个时相点进行实验观察，每个时相点分别12只兔，方法是显露出右后肢跟腱并用钢尺测量其长度，切开腱周组织并横行切断跟腱，采用显微技术用0／8无创伤缝合线修复腱周膜，肌腱断端置入不锈钢丝作为标记点，将TE安放在兔的右后肢，缝合皮肤前先用1#丝线于跟腱两侧贯穿皮肤及跟腱缝合，以防止跟腱断端分离过大，术后7天将这两针线拆除。实验组自术后第7日开始对跟腱进行牵伸延长，共延长3周，预计延长2cm，按1mm/日的速度进行延长，对照组不作牵伸。术后不同时相点取材大体观察跟腱延长后长度、直径、色泽的改变。通过拍摄X光片了解两标记点间的距离，以此确定跟腱牵伸长度的变化。手术放大镜下观察腱周膜表面血液循环的改变及跟腱与周围组织粘连的情况。同时应用德国Leica Q500图像分析系统测量<WP=8>腱周膜的厚度。并通过光镜、电镜对延长区的组织结构进行观察，了解缓慢牵伸应力对跟腱延长区组织学结构的影响。应用深圳REGER生物力学测试仪对跟腱延长区进行力学测试。结果显示：1．大体观察跟腱在缓慢牵伸应力作用下能够逐渐被延长。2．跟腱延长区腱周膜随着时间的推移逐渐变薄，与周围组织的粘连程度逐渐减轻。3．跟腱延长区腱周膜中的血管含量随着时间的推移逐渐减少。4．组织学观察可见3周时实验组跟腱延长区的组织无变性、坏死，内部结构主要是较多的细胞、少量的胶原纤维和丰富的毛细血管，其内浸润的细胞主要是炎性细胞、淋巴细胞、浆细胞、纤维母细胞，胶原纤维含量少且排列紊乱。电镜观察见纤维母细胞形态规则，内部胞浆较多，线粒体丰富，与对照组比较无显着性差异。6周时实验组内部的细胞数量和毛细血管减少，纤维母细胞不断成熟。胶原组织含量明显增加，而对照组的细胞数量仍较多，胶原纤维含量较其3周时亦增加，毛细血管仍丰富。透射电镜显示纤维母细胞内的线粒体及内质网较多，胶原原纤维的形成较多，与对照组比较无显着性差异。9、12周可见实验组跟腱延长区纤维母细胞进一步趋向成熟，向腱细胞的方向发展，毛细血管数量进一步减少，未见炎性细胞，胶原含量进一步增加，对照组同6周时变化不显着。实验组电镜见纤维细胞形态变的极为不规则，有伪足出现，胞浆含量减少，细胞器不丰富，对照组内未见到此类细胞。5．生物力学测试见同一时相点实验组较对照组的力学强度明显增加（除3周外）。本研究结果表明，跟腱切断后修复好腱周膜，在缓慢外加牵伸应力作用下，跟腱断端内形成的肉芽组织能随应力作用不断延长，随时间的推移，延长区的腱周膜逐渐变薄，粘连程度逐渐减轻，血管数量逐渐减少，组织学结构也在不断发生变化，其内部的胶原含量不断增加，早期主要是以纤维母细胞分泌的III型胶原为主，后期主要是成熟的纤维细胞分泌的I型胶原为主，通过检测生物力学强度发现，跟腱延长区内的生物力学强度随时间推移不断增强。应力能促进细胞的迁移和增殖，通过大体观察、组织学检查及生物力学强度检测发现，跟腱延长区内的胶原纤维含量取决于承受的应力和时间两种因素。通过本实验研究证实缓慢牵伸应力作用下延长出来的肌腱其最大断裂载荷超过了其正常肌腱的1／4，能够满足其日常生活需要，以此推断该方法可用于修复肌腱缺损，对临床应用有一定的指导意义。
王继宏[2]2015年在《兔跟腱急性损伤修复术后持续牵张应力刺激促进肌腱修复及其作用机理研究》文中进行了进一步梳理背景肌腱是连接骨和肌肉的致密结缔组织,其在肌肉和骨之间具有传递动能的作用,由于肌腱细胞周围包裹有纵行排列的胶原纤维束,因此肌腱具有较强的抗拉强度。但是肌腱组织鉴于这种力学强度较高的组织结构,其血管比例较少,因此损伤后不利于组织的修复和再生。临床上治疗肌腱急性断裂或损伤常常采用外科手术来修复。随着缝合方法的不断改进,以及缝合材料的迅猛发展,肌腱缝合后的再断裂率显着下降。但对于肌腱损伤修复后的固定方法,以往的临床经验则是采用非功能位的固定,即松弛位,主要考虑到缝合后早期受力会使得缝合处的肌腱再断裂或者近端和远端链接较差。但随着科学技术的发展,功能位固定的提出也是对传统方法的一种挑战。功能位固定使得肌腱修复后处于持续的温和牵张刺激中。以往的实验研究表明,体外离体对跟腱、髌腱等进行牵拉刺激后,其胶原含量较未施加牵拉刺激的水平高。那么功能位固定的这种能够对修复后的肌腱产生持续牵张应力刺激能否对肌腱的修复带来益处,它加速肌腱组织修复的机制则是本文研究的重点。阐明其潜在的机理,有利于将功能位固定更广泛的应用于肌腱损伤修复后,为临床提供新的治疗方法和手段。目的探讨兔跟腱急性离断修复后功能位固定对其修复效果的影响以及其潜在的作用机理。方法本研究分两部分进行。第一部分为探讨兔跟腱急性损伤修复术后持续牵张应力刺激对跟腱的生物力学和相关生长因子表达影响。第二部分为探讨持续牵张应力刺激对肌腱干细胞向肌腱细胞定向分化的研究。第一部分,研究对象为成年健康雄性新西兰白兔,随机分为4组,每组42只,即A、B、C和D组。A组给予跟腱离断缝合术后踝关节功能位固定。B组给予松弛位固定。C组不给于固定,自由活动。D组为正常对照组。选择术后第7d、14d、28d叁个时间点检测各组兔跟腱修复组织力学性能,HE、苦味酸-一天狼猩红染色观察修复的肌腱组织形态及胶原分布,彩超观察各组跟腱组织的术后7d,14d和28d的相关指标。透射电镜观察各组跟腱组织术后28d时的超微结构。采用实时定量PCR和ELISA法检测修复肌腱组织的相关基因和蛋白的水平。第二部分,体外分离培养兔跟腱肌腱干细胞,采用成骨、成软骨、成脂肪等诱导液进行诱导并染色鉴定其多向分化潜能。采用流式细胞术检测分离的肌腱干细胞特征性蛋白水平。采用持续牵张应力刺激仪对体外分离培养的肌腱干细胞进行2% strain、4% strain和6% strain的持续牵张应力刺激。在施加刺激后24h和48h时检测细胞成肌腱分化相关基因和蛋白表达水平。结果第一部分,术后28d时A组跟腱损伤处可见大量胶原纤维形成,纤维排列较整齐,炎性细胞较少见到。C组兔跟腱修复处也可见有大量胶原纤维形成,纤维结构排列比A组较差。术后第7d、14、28d时,四组兔跟腱最大载荷、抗拉刚度、最大断裂应力差异均具有统计学差异(P<0.05),A组均优于B组和C组(P<0.05)。第28d时A组最大载荷、抗拉刚度、最大断裂应力的值分别为269.32±28.43(N),25.63±1.43(N/mm)和9.78±2.53(Mpa)。在第28d时,A组兔跟腱Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的比例均已非常接近正常兔跟腱,然而C组的Ⅰ型胶原比例略低于A组,B组最低,仅为86.32%。术后第7d时,A组兔跟腱组织中,COL Ⅰ、COL Ⅲ、TGF-β1、bFGF、PDGF和IGF-1基因表达水平显着升高。高于B组、C组和D组,而A组VEGF表达量较B组和C组低(P<0.05)。在术后第28d时,各组COLⅠ、 COL Ⅲ、TGF-β1、bFGF、PDGF、VEGF和IGF-1基因表达水平均有不同程度的下降,但仍高于D组水平(P<0.05)。ELISA检测蛋白水平结果显示术后第7d时,A组COL Ⅰ、TGF-β1、bFGF、PDGF蛋白水平显着高于B组和C组(P<0.05)。而四组VEGF口IGF-1蛋白水平差异则无统计学意义(P>0.05)。术后第14d时,A组和C组COLⅠ、bFGF和PDGF蛋白水平又有所上升,且显着高于B组(P<0.05)。第二部分,肌腱干细胞呈鹅卵石样平铺于培养瓶底,并且呈克隆样生长。番红O、茜素红和油红O染色显示肌腱干细胞具有向成软骨、成骨和成脂分化的潜能。2%牵张应力下,肌腱干细胞在24h时Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因表达有明显的上升,然而在48h时,其这两个基因表达未见明显变化(P>0.05),而TNC和SCX两个肌腱细胞标志性基因及蛋白在48h时反而表达水平下降。在4%持续牵张应力刺激下COL Ⅰ COL Ⅲ、TNC和SCX均有显着的上升,并且48h时表达水平也高于24h时(P<0.05)。而6%的持续牵张应力刺激未能使肌腱干细胞的COL Ⅰ、COL Ⅲ、TNC和SCX基因及蛋白表达显着升高,显着低于2%和4%持续牵张应立组(P<0.05)。结论1、兔跟腱急性断裂修复后功能位固定较非功能位固定更能够促进肌腱组织胶原含量的增加以及纤维结构的恢复。2、兔跟腱急性断裂修复后功能位固定较非功能位固定更能够促进修复跟腱组织生物力学性能的提高。3、兔跟腱急性断裂修复后功能位固定较非功能位固定更能够促进修复跟腱组织的肌腱相关生长因子基因和蛋白水平的提高。4、体外分离培养兔肌腱干细胞,其可呈克隆样生长,具有多向分化潜能。5、4%持续牵张应力刺激能够有效的诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化。
杨运发[3]2013年在《富血小板血浆（PRP）对肌腱干细胞生物学影响的研究》文中研究说明肌腱病(Tendinopathy)的发病率极高,是骨科、运动医学、康复医学、职业病防治和老年医学的常见疾病。肌腱病严重影响人们的工作与生活,特别影响运动员竞技水平的发挥,常迫使优秀运动员提早退役。肌腱病的主要临床表现为肌腱或肌腱-骨胳连接处的疼痛、压痛甚至断裂、关节活动度受限。肌腱腱病最常见的发病部位依次为髌腱、跟腱、冈上肌腱肩袖、指深屈肌腱及肱骨外上髁伸肌总腱止点。足底筋膜炎、跟腱炎、髌腱炎、网球肘、高尔夫肘、冈上肌腱炎都是肌腱病。虽然肌腱病如此常见,其发病机制仍不清楚,常认为与肌腱韧带的急慢性损伤有关。新近发现的肌腱干/祖细胞(Tendon stem/progenitor cells, TSPCs),也称为肌腱干细胞(tendon stem cells, TSCs)或肌腱源性干细胞(tendon-derived stem cells, TDSCs),经传代培养后可直接成为腱细胞,具有成体干细胞的自我复制和诱导成脂、成软骨、成骨分化的潜能,是腱细胞的前体细胞。研究表明,TSCs参与肌腱的急慢性损伤修复,是肌腱急慢性损伤修复过程中的关键效用细胞。不同剂量的反复循环机械应力刺激可影响肌腱干细胞力学生物学行为,进一步导致肌腱内环境的稳态和肌腱病的发生。应用体外循环机械牵伸系统模拟细胞在体反复机械应力状态,证明4%的机械拉伸能增加TSCs增殖、促进TSCs成为腱细胞,然而8%的机械拉伸可诱导TSCs分化为脂肪、软骨和骨细胞。可见,小的机械拉伸(有序和适度的体育锻炼)可促进TSCs增殖并成为腱细胞,有利于肌腱的强壮及肌腱的健康；而持续较大的机械负荷(如过度劳损)是有害的,它促使肌腱干细胞分化为非腱细胞,导致脂肪堆积、黏液形成和肌腱钙化,表现为肌腱病的典型病理变化。可见,TSCs可能是探索肌腱病的突破口。因为对肌腱病还没有本质认识,临床治疗还往往是经验性的。治疗方法包括：局部制动休息、减负训练、按摩冷疗、离心型运动、口服非甾体类抗炎药物、局部注射富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)、细胞疗法、体外冲击波术、严重时可给予糖皮质激素等治疗。对于保守治疗无效、临床症状持续较重者,可给予外科手术治疗。在这些治疗方法中,PRP局部注射具有自体来源、制作简单、可制作成凝胶状、临床使用安全、方便、经济等优点,倍受医生和患者的欢迎。因此,临床应用PRP局部注射治疗“肌腱病”值得我们关注。PRP是全血经过梯度离心分离获得的、含有超过基线水平的浓缩血小板血浆。一般而言,血小板含量至少要达到正常血的3-5倍才能称之为PRP。当PRP被激活后,其血小板释放出大量的生长因子,包括血小板衍生生长因子(PDGF),转化生长因子p(TGF-p),血管内皮细胞生长因子(VEGF),纤维生长因子(FGF),内皮细胞生长因子(EGF),血小板衍生内皮细胞生长因子(PDEGF),胰岛素样生长因子(IGF)等。这些生长因子对细胞的增殖和分化有着重要的作用,能够刺激损伤组织血管神经化、为细胞修复或再生损伤组织提供血供和营养。体外研究已经发现PRP能促进TSCs增殖和成腱细胞形成,动物实验研究也已证实这一结果,一些临床试验也已经验证PRP能够促进肌腱和韧带急慢性损伤的愈合和有效治疗肌腱病。然而,PRP局部注射治疗肌腱和韧带的急慢性损伤和肌腱病并不总是令人满意,有一些临床试验却发现PRP对肌腱和韧带急慢性损伤的修复和肌腱病的治疗无益。因此,应用PRP治疗肌腱病仍需进一步基础与临床研究。我们知道,临床应用的PRP是个体化准备的,没有明确的定义。因而,每一个人的PRP都可能不一样,并且在某些情况下,有些病人不能成功获得PRP。仔细分析PRP的制备过程及其组成成份,我们发现只有两类(共有4种)不同的PRP在临床使用：其中一类含白细胞(L-PRP和L-PRF),另一类不含白细胞(P-PRP、P-PRF)。有研究发现应用富含白细胞的PRP有较乏白细胞的PRP更为严重的急性炎症反应。因为TSCs是肌腱急慢性损伤修复的关键效用细胞,我们假设L-PRP不利于肌腱和韧带的愈合是因为L-PRP会抑制TSCs的正常活性。本课题为证实上述假设共分为3章,即肌腱干细胞的分离、培养和鉴定；P-PRP和L-PRP的制备和鉴定；P-PRP和L-PRP对TSCs增殖、分化和细胞力学的影响。研究目的是为临床合理应用PRP局部注射治疗肌腱病提供理论依据。第一章兔肌腱干细胞的分离、培养及鉴定目的：分离和鉴定兔肌腱干细胞(TSCs)并评估其干细胞特性为下一步实验做准备。研究内容包括：(1)TSCs的分离及培养；(2)TSCs的克隆形成能力及增殖能力检测；(3)TSCs的流式细胞仪及免疫荧光鉴定；(4)TSCs的成脂、成软骨、成骨分化能力测定。方法：从新西兰大白兔中获取TSCs已经匹兹堡大学实验动物应用学会批准(IACUC批准号：1105545A)。选用3月龄健康雄性新西兰大白兔。兔处死后从后肢的跟腱取细胞并进行TSCs培养,观察克隆形成、进行干细胞鉴定和到P3后行成脂、成软骨、成骨诱导。结果：体外培养7天后,肌腱来源细胞(Tendon-derived cells, TDCs)已经形成克隆。流式细胞术对细胞表面抗原标志进行了分析,结果显示TDCs表面抗原干细胞标志CD90、CD44均呈强阳性。免疫荧光的方法对干细胞特征性标志物(NS, Nanog, Oct-4, SSEA4)进行了检测,染色细胞经免疫荧光显微镜观察。结果显示80%的TDCs细胞均表达阳性。成脂诱导分化后,细胞增殖缓慢,细胞中出现脂滴,并逐渐增大、融合,油红-O染色可见细胞内大小不等的红色脂滴。成软骨诱导分化4周,固定细胞,经番红-O染色,细胞微团被染为红色。成骨诱导分化4周后,TDCs细胞呈层迭样生长,局部出现钙盐沉积,形成矿化结节,钙盐沉积处Alizarin red S染色成红色。小结：本研究获取的TDCs是肌腱干细胞(TSCs),具有克隆形成能力及快速增殖能力,细胞表面抗原CD90、CD44表达呈阳性,而CD34表达呈阴性,干细胞特异性标志物NS、Nanog、SSEA4和OCT-4表达阳性,在成骨、成脂和成软骨诱导条件下,可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等,具有多向分化潜能,可用于下一步研究。第二章P-PRP和L-PRP的制备及P-PRP及L-PRP对TSCs的影响为了明确是否是PRP中的白细胞影响了PRP的疗效,本研究将分别制备P-PRP和L-PRP及研究P-PRP与L-PRP对TSCs的作用,以进一步确定L-PRP对肌腱韧带修复的不利影响,明确P-PRP对肌腱韧带修复的积极作用。方法：选用3月龄、体重2.5kg的健康雄性新西兰大白兔8只(匹兹堡大学实验动物中心提供,IACUC Protocol number:1105545A),乙醚麻醉后,在严格无菌条件下,用预先含有3.8%ACD抗凝剂(sodium citrate)溶液的注射器从心脏采集新鲜抗凝血并置于冰水混合物中。小心缓慢地将6mL的新鲜血注入盛有6mL Polymorphprep (Accurate Chemical&Scientific Crop NY)的试管中,置4℃离心机中予以400g/m离心30分钟后手工分离出P-PRP和L-PRP,应用自动细胞计数仪(Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, Massachusetts)对P-PRP和L-PRP所含的白细胞进行计数。P-PRP和L-PRP均用22mM CaCL2进行激活并存于4℃冰箱中备下一步实验用。将准备好P-PRP和L-PRP培养基和普通培养基,培养基中除含或未含P-PRP或L-PRP外,其他成分一样(20%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、低糖DMEM),分析各培养基中的细胞因子；将兔来源的TSCs接种在含P-PRP、L-PRP (0%,2%,5%,10%)培养基或普通培养基的6孔培养板中(10000个细胞／孔)并在37℃、5%CO2条件下培养;培养至1、2、4天观察细胞形态,至第4天用自动细胞计数仪(Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, Massachusetts)行细胞计数并计算PDT,流式细胞仪检测其干细胞特征性细胞表面标志物;观察P-PRP组、L-PRP组和对照组TSCs经成脂、成软骨和成骨诱导28天后其多分化潜能；qRT-PCR分析P-PRP和L-PRP对TSCs基因表达的影响,PRP与白细胞对TSCs的相互影响；CTFM测定P-PRP和L-PRP对TSCs细胞力学的影响。结果：加入离心液一次梯度离心可制备高浓度的PRP。PRP中的血小板量为1.44×108±0.84×108/mL(P<0.05),与全血比较,其血小板浓缩率为3.25±0.73。P-PRP中的白细胞数为0.6625×105±0.36×105/mL,L-PRP中的白细胞数为3.2775×105±1.22×105/mL(P=0.019)(mean±SD, n=8)。所有培养基(P-PRP培养基、L-PRP培养基和普通培养基)均在配制好后即用ELISA法测定其生长因子(PDGF, EGF, TGF-β1, VEGF)的浓度。P-PRP培养基有较L-PRP培养基和普通培养基更高浓度的生长因子,特别是EGF和TGF-β1。L-PRP培养基中VEGF浓度较普通培养基还低,说明白细胞可能抑制PRP释放生长因子(P-PRP与L-PRP培养基比较,P<0.05,n=3)；L-PRP培养基组不贴壁细胞增加；其干细胞特征性细胞表面标志物CD44和CD90发生变化,经P-PRP处理,CD44和CD90都表达增加,经L-PRP处理则相反(P-PRP与L-PRP组比较,P<0.05,n=3)；PDT与PRP白细胞的浓度有关,当增加P-PRP的浓度或降低L-PRP浓度时,PDT缩短(组内和组间比较,P<0.05,n=3)：培养4天、14天后,L-PRP的浓度越高,Nang、Oct4基因表达越下调(L-PRP组内和L-PRP组与P-PRP组比较,P<0.05,n=3)；经28天的成脂、成软骨和成骨诱导后,P-PRP培养基组、L-PRP培养基组和普通培养基组的TSCs均被成功诱导。然而,L-PRP培养基组阳性细胞染色数明显较P-PRP培养基组和普通培养基组。与P-PRP培养基组和普通培养基组比较,L-PRP培养基组成脂、成软骨和成骨分化明显增加(组内比较,P<0.05,n=3)；各基因与P-PRP和L-PRP的浓度密切相关。L-PRP的存在,PPARγ、SOX-9、Runx-2、mPGEs基因表达就明显上调。(L-PRP组内和L-PRP组与P-PRP组比较,P<0.05,n=3)；L-PRP培养基组的最大细胞收缩力明显小于P-PRP培养基组和普通培养基组,组间比较有显着性差异(P=0.006、0.002,n=5),但P-PRP培养基组与普通培养基比较则未见显着性差异(P=0.609、0.002,n=5)；WBC组的COX-1和COX-2基因明显上调,但WBCs的这种作用可以明显被PRP抵消；PRP组Ⅰ型胶原基因(Col-Ⅰ)表达上调,但这种作用可以明显被WBC处理抑制；WBC组还明显有MMP-13基因表达的增加,这种表达增加可以被PRP抵消。小结：本研究中通过加入离心液一次梯度离心分离制备出P-PRP和L-PRP,其所含的白细胞有显着的差异。与P-PRP和空白对照比较,L-PRP会抑制TSCs的增生、加速TSCs的分化、并使TSCs脆性增加；经WBCs处理后,TSCs的炎症反应介质基因COX-1和COX-2表达增加,细胞分解代谢的基因Ⅰ型胶原表达减少但MMP-13表达增加。这些发现支持临床所见的肌腱病发病机制,因而,我们可以合理地推断P-PRP可以促进肌腱韧带的愈合而L-PRP可能抑制肌腱韧带的愈合。因此,我们应该用P-PRP而不是含有白细胞的L-PRP治疗肌腱病。第叁章P-PRP胶-TSCs复合物的构建及TSCs的体内、外示踪将P-PRP胶作为载体负载TSCs构建成P-PRP胶-TSCs复合物并植入目标部位,并监测TSCs植入体内后其生物学活性。方法：应用SPIO标记TSCs、分析SPIO对TSCs生物学功能的影响；构建P-PRP胶-TSCs复合物；体外MRI观察经SPIO标记的TSCs在P-PRP胶内的分布情况；建立兔髌韧带窗式缺损模型,用P-PRP胶-TSCs复合物进行修复,MRI连续检测追踪经SPIO标记的TSCs并检验P-PRP胶作为载体的可行性；免疫荧光检测评价P-PRP胶-TSCs植入体内3周后其TSCs的Ⅰ型胶原合成能力,以观察TSCs植入体内3周后的生物学性能；明确P-PRP胶作为TSCs载体用于治疗急慢性肌腱损伤和肌腱病的可行性。结果：我们发现TSCs经胞吞作用摄入SPIO,可见SPIO在细胞浆内并围绕在细胞核周围。细胞标记率约98%。经SPIO标记的TSCs细胞形态未见明显改变；细胞增殖也未见明显改变,表现为PDT与未标记TSCs比较无显着性统计学差异(P>0.05),说明SPIO标记不会影响细胞的增殖功能；分别于标记后2、4、7天检测细胞的活力,发现其活力都在90%左右,与未标记细胞比较也无明显差异,说明SPIO标记不会明显干扰TSCs的细胞活力(P>0.05)；经免疫组织化学方法证实SPIO标记组TSCs和未标记组nucleostemin和Nanog表达率都为约90%,没有明显差别(P>0.05)；经qRT-PCR检测,我们发现标记TSCs和未标记TSCs相比,在标记后4、7、14天,其Oct-4和Nanog基因表达都没有明显差别(P>0.05);经21天的成脂、成软骨和成骨分化,两组未见明确差异；其PPAR、Sox9和Runx2基因表达也无明显差异(P>0.05)。体夕P-PRP胶-TSCs复合物经3T MR扫描发现经SPIO标记的TSCs其MRI信号与标记细胞数呈线性改变,说明TSCs可均匀分散在P-PRP胶中；体内P-PRP胶-TSCs复合物经3T MR扫描发现经SPIO标记的TSCs连续3周其MRI信号没有明显变化。术后3周局部表现为肌腱缺损已有组织填充,经普鲁氏兰染色证实MRI显影的细胞就是经SPIO标记的TSCs,说明TSCs能持续停留在目标部位至少3周。从组织修复的角度考虑,3周的时间足于完成急性炎症期,目的细胞能停留在目标部位3周以上就可能发挥其生理功能,达到治疗目的。再次,经免疫组织化学染色证实P-PRP胶负载的TSCs在体内3周后出现明显的Ⅰ型胶原的表达,说明TSCs已经发挥生理作用。可见P-PRP胶可以作为TSCs细胞治疗或组织工程的载体。小结：用SPIO标记TSCs不会明显干拢其干性、负载TSCs的P-PRP胶修复兔髌韧带窗式缺损术后2周和3周连续经MRI观察均未见明显影像学改变、经普鲁氏兰染色证实MRI显影的细胞就是SPIO标记的TSCs,说明存在于P-PRP胶内作为目的细胞的TSCs可以稳定维持在目标部位,且TSCs植入体内3周后能合成Ⅰ型胶原,说明TSCs可用SPIO进行标记、P-PRP胶可作为TSCs的良好载体。结论：本研究成功地从兔跟腱分离培养出TDCs。这些细胞有克隆形成能力、快速增殖能力和多向分化潜能,经流式细胞仪证实干细胞表面特征性标志物阳性,经免疫荧光染色证实干细胞特征标志物染色阳性,从而确定为肌腱干细胞；经一次离心可简便制备出较高浓度的PRP并成功分离出P-PRP和L-PRP;发现L-PRP,这种含白细胞的PRP,会抑制。TSCs增殖、加速TSCs分化并使TSCs脆性增加、加大TSCs的细胞炎症反应及细胞分解代谢。或许,我们应该用P-PRP而不是含有白细胞的L-PRP来治疗肌腱病。P-PRP胶是TSCs细胞治疗和肌腱组织工程潜在的良好支架。
参考文献：
[1]. 兔跟腱缓慢牵伸延长的实验研究[D]. 兰秀夫. 第叁军医大学. 2003
[2]. 兔跟腱急性损伤修复术后持续牵张应力刺激促进肌腱修复及其作用机理研究[D]. 王继宏. 重庆医科大学. 2015
[3]. 富血小板血浆（PRP）对肌腱干细胞生物学影响的研究[D]. 杨运发. 南方医科大学. 2013
标签：外科学论文; 干细胞论文; 细胞生长因子论文; 跟腱周围炎论文; 跟腱论文; 胶原纤维论文; 细胞分化论文; 肌肉肌腱损伤论文; 生物技术论文;