拟南芥温度响应突变体的筛选与基因鉴定

论文摘要

环境压力限制了植物的生长和发育,并显著降低了农业重要作物的产量。在各种非生物胁迫中,温度是限制植物生长,降低生产力和质量的主要环境因素之一。当植物受到机械刺激、激素、病原体和低温等非生物胁迫,[Ca2+]cyt升高,Ca2+作为第二信使,参与低温响应中的信号转导。EMS突变体分析是使用正向遗传学鉴定特定的生物过程或信号传导途径。近年来,已研究了植物温度胁迫耐受的机制和涉及温度胁迫信号的基因。几种信号通路参与温度应激信号传导。植物如何通过钙离子介导途径将环境温度变化信号转变为生物信号的研究并不多。本课题通过利用对Ca2+敏感的水母发光蛋白,将钙成像技术与正向遗传学结合,以拟南芥EMS诱变库为材料,从库中筛选温度胁迫下胞内钙离子浓度降低的突变体,试图找到植物感受温度胁迫信号通路中Ca2+相关的特异离子通道或相关调控基因,来揭示拟南芥对温度胁迫响应的钙信号分子机制。取得的成果如下:1.从EMS库中经过筛选得到温度胁迫诱导的钙信号缺失突变体,并通过图位克隆找到突变基因。将突变体与野生型AQ杂交,逐步筛选到F2代,然后测序,根据测序结果进行精细定位,得到目的基因。2.进行生理特性研究,得到突变体的下胚轴长度在较高温度下受到抑制,以及在较高温度条件下突变体的开花时间比野生型晚,证明该突变体是温度敏感型突变体。3.我们克隆了目的基因,构建了突变体基因载体,通过农杆菌侵染法转化到突变体植株中,将收获的T0代种子用含有Hyg抗性的培养基进行筛选,经过两代筛选,得到T2代种子,并进行了互补鉴定,得出该目的基因很有可能是温度响应的相关基因。通过上述研究,有望揭示植物中钙离子介导的环境温度感受器及其作用机理,为完善和建立植物响应环境温度变化的分子机制提供有力的理论依据,同时在实践上为采用基因工程方法提高作物耐受全球气候变化提供理论基础。

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Abstract

缩略词表

1 前言

1.1 植物抵御温度胁迫的分子机制

1.1.1 低温胁迫

1.1.2 高温胁迫

1.2 植物钙信号

1.2.1 钙离子通道和转运体

1.2.2 钙调蛋白

1.2.3 钙信号对温度胁迫的响应

1.2.4 水母发光蛋白

1.3 图位克隆

1.4 研究的目的和意义

2 拟南芥低温诱导钙信号缺失突变体的筛选

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 植物材料

2.1.2 植物生长条件

2.1.3 实验试剂与实验仪器

2.1.4 培养基和实验溶液配方

2.2 实验方法

2.2.1 以AEQUORIN生物发光系统为基础的植物钙信号成像

2.2.2 突变体的筛选

2.2.2.1 筛选候选突变体

2.2.2.2 突变体确定

2.2.3 突变体的特异性验证

2.2.4 F2 代群体构建

2.2.5 全基因组重测序和基因定位

2.2.5.1 CTAB法提取DNA

2.2.5.2 酶切位点引物设计和PCR反应

2.3 实验结果与分析

2.3.1 突变体筛选

2.3.1.1 筛选候选突变体

2.3.1.2 突变体确定

2.3.1.3 特异性结果分析

2.3.2 F2 群体构建与挑选结果

2.3.3 基因定位结果

2.4 结果讨论

3 突变体响应温度变化的生理特性研究

3.1 实验材料与方法

3.1.1 实验材料和生长条件

3.1.2 实验方法

3.2 实验结果与分析

3.3 结果讨论

4 突变体基因重组载体的构建与农杆菌转化

4.1 实验材料与方法

4.1.1 实验材料与试剂

4.1.2 实验方法

4.1.2.1 目的基因片段的获得与扩增

4.1.2.2 酶切反应

4.1.3 T4 连接与转化

4.1.4 LR反应体系

4.1.5 农杆菌侵染法转化拟南芥

4.1.5.1 重组载体转入农杆菌

4.1.5.2 农杆菌侵染植株

4.1.6 钙表型恢复互补鉴定

4.2 结果与分析

4.2.1 目的基因片段的获得与酶切

4.2.2 T4 连接菌液PCR

4.2.3 质粒酶切鉴定

4.2.4 LR菌液PCR

4.2.5 质粒酶切鉴定

4.2.6 钙表型恢复鉴定

4.3 结果讨论

5 讨论

参考文献

附录

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王梦云

导师: 裴真明,滕一波

关键词: 拟南芥,温度胁迫,水母发光蛋白,钙信号转导,图位克隆

来源: 杭州师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 杭州师范大学

分类号: Q943.2

总页数: 70

文件大小: 1452K

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