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MtENOD20在蒺藜苜蓿共生固氮过程中的功能研究

2020-12-08阅读(170)

MtENOD20在蒺藜苜蓿共生固氮过程中的功能研究

论文摘要

本试验以蒺藜苜蓿为研究对象,对实验室前期筛选出的Phytocyanins基因家族中的早期结瘤素基因MtENOD20（MTR4g130800）进行组织定位、亚细胞定位、RNA干扰和过量表达等分析,探究其在共生固氮中的功能。研究结果简述如下:1、目的基因的表达模式分析利用qPCR方法分析了早期结瘤素基因MtENOD20的两个可变剪接MtENOD20-1、MtENOD20-2在蒺藜苜蓿共生结瘤过程中的时空表达情况,结果表明（1）MtENOD20-1与MtENOD20-2在接菌的根中均被强烈诱导但表达谱不同,在不接菌对照根中不表达或仅有低水平的表达;（2）MtENDO20-1在不接菌和接菌植物的去瘤根、茎、叶中几乎不表达,只在根瘤中表达,为结瘤特异性表达;MtENDO20-2在接菌植物的去瘤根、茎、叶表达量较低,在根瘤中高水平表达,为结瘤增强性表达。推测MtENOD20的两个可变剪接在根瘤发育中可能行使着不同的功能。2、MtENOD20的组织特异性表达构建MtENOD20启动子与GUS融合表达载体,通过发根农杆菌介导的转化体系,对转化根进行GUS染色观察。结果显示,目的基因主要在侵染根的皮层细胞（即根瘤原基起始的部位）、含有侵染线的根毛细胞以及根瘤侵染区表达。3、MtENOD20的亚细胞定位构建MtENOD20基因的亚细胞定位载体,利用根癌农杆菌介导的烟草叶片细胞瞬时转化体系明确了MtENOD20定位在质膜、内质网和细胞核上;发根农杆菌介导的蒺藜苜蓿根部转化体系试验表明,MtENOD20定位于共生体上。这些结果表明MtENOD20可能通过内质网的分泌途径靶向共生体。4、MtENOD20基因RNA干扰和过量表达转化植株的表型分析对MtENOD20进行干扰处理,结果显示:干扰植株的株高、根长减少,根瘤数目、固氮酶活和豆血红蛋白含量降低,且根瘤多为小的白色无效根瘤;接菌后7d的侵染事件统计结果表明,干扰植株中卷曲根毛、延伸的侵染线、侵染线和根瘤原基的数目均降低与对照相比;根瘤石蜡切片和透射电镜观察结果表明,与野生型相比,干扰根瘤中的类菌体分化程度低,为不具有固氮活性的I类或者II类类菌体,共生关系过早终止。共生相关基因的表达分析显示,与对照相比,干扰根中与侵染相关的基因MtNSP1、MtERN1、MtERN2和MtERN3没有变化,MtNIN、MtENOD11和MtENOD40表达量下降,推测目的基因可能在MtNSP和MtERN下游发挥作用;与类菌体分化相关的基因RSD、DNF2、NCR001和NCR035,在干扰根中均显著降低。以上结果表明,MtENOD20可能与根瘤菌的侵染过程及类菌体的释放、分化有关。过表达分析结果显示,MtENOD20过表达植株的株高、根长、根部的干重和鲜重及叶绿素的含量均增加,根瘤的数目、固氮酶活和豆血红蛋白含量上升;侵染事件统计分析结果表明,接菌后7d,过表达根中根毛卷曲、延伸侵染线、侵染线和根瘤原基的数目与对照相比均增加;接菌后45d根瘤石蜡切片和透射电镜观察结果显示,过量表达根瘤细胞中的类菌体形态规则,排列紧密,对照组根瘤中的类菌体数量减少且出现融合现象,表明对照的根瘤细胞开始衰老。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 共生固氮概述
  •     1.1.1 生物固氮
  •     1.1.2 豆科植物—根瘤菌共生关系的建立
  •     1.1.3 Phytocyanin基因家族在豆科植物中的研究现状
  •   1.2 研究目的及意义
  •   1.3 技术路线
  • 第二章 MtENOD20时空表达及组织定位
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料、试剂和仪器
  •     2.2.1 材料、载体、菌株
  •     2.2.2 试剂及培养基
  •     2.2.3 试验仪器
  •     2.2.4 基因的生物信息学分析
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 系统发育树的构建
  •     2.3.2 时空表达模式分析
  •     2.3.3 蒺藜苜蓿的栽培与采样
  •     2.3.4 RNA的提取及反转录
  •     2.3.5 基因的定量分析
  •     2.3.6 基因组织定位载体构建
  •   2.4 结果与分析
  •     2.4.1 系统发育分析
  •     2.4.2 RNA的检测与纯化
  •     2.4.3 目的基因时空表达结果
  •     2.4.4 MtENOD20启动子载体构建结果
  •     2.4.5 MtENOD20组织表达特异性
  •   2.5 讨论
  • 第三章 MtENOD20的亚细胞定位
  •   3.1 引言
  •   3.2 试验材料、试剂及仪器
  •     3.2.1 试验材料与试剂
  •     3.2.2 试验仪器
  •   3.3 试验方法
  •     3.3.1 烟草叶片亚细胞定位载体的构建
  •     3.3.2 根癌农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化
  •     3.3.3 发根农杆菌介导的蒺藜苜蓿根部的转化体系
  •   3.4 结果与分析
  •     3.4.1 亚细胞定位载体的构建
  •     3.4.2 亚细胞定位结果
  •   3.5 讨论
  • 第四章 MtENOD20的RNA沉默和过量表达
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料、试剂和仪器
  •     4.2.1 材料、载体、菌株
  •     4.2.2 试剂及培养基
  •     4.2.3 试验仪器
  •   4.3 试验方法
  •     4.3.1 RNA干扰载体的构建
  •     4.3.2 构建MtENOD20过量表达载体
  •     4.3.3 蒺藜苜蓿发根转化体系
  •     4.3.4 实验结果的鉴定
  •   4.4 结果与分析
  •     4.4.1 MtENOD20目的片段的扩增
  •     4.4.2 RNA沉默载体的构建
  •     4.4.3 构建过量表达载体
  •     4.4.4 转化苗植株表型的观察
  •     4.4.5 检测RNA干扰及过量表达的效率
  •     4.4.6 转化植株的表型
  •     4.4.7 RNA干扰植株中相关基因的表达
  •     4.4.8 根瘤的显微及超显微结构观察
  •     4.4.9 冷冻切片和扫描电镜对干扰的根瘤显微及超显微结构的观察
  •   4.5 讨论
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王玉洁

    导师: 丑敏霞

    关键词: 共生固氮,干扰,基因过表达,基因表达分析

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家自然基因基金(编号:31172252),陕西省自然基金(编号:2016JM3004)

    分类号: Q945.13

    总页数: 88

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