致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定及对雏鹅的致病性

论文摘要

自2017年2月份以来,我国山东、江苏、安徽、河南、辽宁、广东等主要养鹅地区暴发了一种以痛风为主要特征的急性传染病。该病主要侵害2周龄以内的雏鹅,病鹅内脏器官表面和关节腔内有大量的尿酸盐沉积,死亡率最高可达50%,给我国养鹅业造成了巨大的经济损失。为尽快确定雏鹅发病的原因,本研究在发病地区开展流行病学调查。流行病学调查结果显示:不同地区、不同品种的雏鹅使用的饲料品种和药物种类各不相同,但发病日龄都集中在520日龄,剖检症状基本一致。对采集的病料进行细菌分离和PCR检测,均未分离到细菌,而PCR检测结果星状病毒为阳性,且阳性率高达93%（316/340）,在此基础上开展病毒的分离鉴定工作。无菌采集患病雏鹅肾脏组织,处理后接种11日龄鹅胚和鹅肾细胞进行病毒分离,病毒接种鹅胚三代以后开始稳定,能导致鹅胚死亡,死亡时间大多集中在4872h,25d内鹅胚死亡率可达90%,胚体表现为尿囊膜增厚,全身皮肤和腹膜表面有点状出血斑,肾脏、肝脏、肺脏等器官均有出血点;GKC感染72h后开始皱缩、变圆、脱落。尿囊液和细胞液经PCR鉴定为阳性且无杂毒后,便分离到一株鹅源星状病毒,并命名为AstV/SDPY/Goose/1116/17。将SDPY株全基因序列与其他各属共26株AstV进行序列分析,同源性分析结果表明,SDPY株与其他火鸡源、鸡源、鸭源和鹅源AStV同源性均较低,核苷酸同源性仅为51.8%63.2%;但与TAstV分离株的同源性相对较高,核苷酸的同源性为63.2%63.3%。遗传进化分析结果表明,SDPY株处于一个独立的分支,是一种新型AstV。动物回归试验结果显示,1日龄健康雏鹅人工感染SDPY株后,第6天开始出现死亡,剖检发病死亡雏鹅可见内脏器官表面有大量尿酸盐沉积,部分死亡雏鹅关节腔内有白色尿酸盐沉积,与自然感染症状一致。以上试验结果表明,本研究成功分离一株鹅源星状病毒,并证明该病毒是导致雏鹅痛风的致病原。根据GAstV ORF2基因序列设计一对引物和一条特异性探针,扩增长度为89bp。将扩增的片段连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、测序鉴定后,倍比稀释作为标准品,优化反应条件后构建标准曲线,建立针对GAstV的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。该方法标准曲线有良好的线性关系,线性回归方程为y=-2.9779x+37.196,相关系数R2为0.9977;敏感性良好,最小检出模板浓度为10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;特异性良好,与其他病毒无交叉反应现象;批间和批内间变异系数均在0.7%以下,重复性良好。以上试验表明,本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强、重复性好,可用于GAstV的临床检测。将150只1日龄健康雏鹅随机分为3组,颈部皮下攻毒组、口服攻毒组和对照组各50只,皮下和口服攻毒组每只接种0.2mL病毒液(ELD50为10-5.25/0.2mL),对照组每只接种0.2mL生理盐水,观察各组临床症状及剖检变化。每隔2d称重监测体重增长变化,采集泄殖腔棉拭子、非抗凝和抗凝血各3份,分别用于监测雏鹅排毒规律、血液中病毒含量变化和血清中各项生化指标;于攻毒后2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d,每组随机剖杀3只,收取各组织进行病毒载量的测定。结果显示,口服和皮下攻毒组均出现痛风症状,其中皮下攻毒组较早出现死亡;攻毒组雏鹅的体重较正常对照组增长缓慢,以皮下攻毒组最为显著;棉拭子排毒规律结果显示,攻毒组均在感染早期出现排毒;血液中病毒含量变化结果显示,攻毒组均在感染早期检测到病毒存在,且病毒含量变化与棉拭子排毒规律基本一致;血液生化指标结果显示,血清中尿素氮、尿酸、谷草转氨酶、谷丙转氨酶的含量显著高于对照组;组织器官病毒载量结果显示,人工感染SDPY株后,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺、胰脏、脑、胃、十二指肠中均能检测到病毒,皮下攻毒组和口服攻毒组中病毒含量最高的器官均为肾脏;结合泄殖腔棉拭子、血液和各组织器官的排毒规律,可得出在人工感染雏鹅SDPY株病毒后,第6天雏鹅体内病毒含量达到高峰,第8天含量有所降低,第10天又开始上升,达到第二个高峰,但第二个高峰载量普遍低于第一个高峰期。综合GAstV在雏鹅体内的动态分布,可为预防和控制雏鹅痛风病提供可靠的理论依据。

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符号说明

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1 前言

1.1 家禽痛风病研究进展

1.1.1 痛风的分类

1.1.2 痛风的发病原因

1.1.2.1 营养性因素

1.1.2.2 中毒因素

1.1.2.3 传染性因素

1.2 星状病毒分类及生物学特征

1.2.1 病毒分类

1.2.2 星状病毒理化性质及培养特征

1.2.3 分子生物学特征

1.3 禽星状病毒感染概述

1.3.1 鸡星状病毒感染

1.3.2 鸭星状病毒感染

1.3.3 火鸡星状病毒感染

1.4 检测方法

1.4.1 电镜法

1.4.2 血清学检测方法

1.4.3 分子生物学检测方法

1.5 荧光定量检测方法的研究进展

1.5.1 实时荧光定量PCR技术原理

1.5.2 实时荧光定量PCR分类及特点

1.5.2.1 染料法

1.5.2.2 探针法

1.5.3 荧光定量PCR检测方法在畜牧生产中应用

1.6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病料采集

2.1.2 毒株

2.1.3 鹅胚与试验动物

2.1.4 主要仪器与设备

2.1.5 主要试剂

2.1.6 主要溶液及培养基的配制

2.2 方法

2.2.1 致雏鹅痛风病原的确定

2.2.1.1 流行病学调查

2.2.1.2 细菌分离

2.2.1.3 引物设计与合成

2.2.1.4 病毒核酸的提取

2.2.1.5 PCR反应

2.2.1.6 目的片段的琼脂糖凝胶回收与纯化

2.2.1.7 连接与转化

2.2.1.8 阳性克隆鉴定与测序

2.2.1.9 致雏鹅痛风病原的分离

2.2.1.10 鹅肾细胞原代（GKC）的制作

2.2.1.11 病原形态学观察

2.2.1.12 病原半数致死量（ELD50）的测定

2.2.1.13 病原纯净度检测

2.2.1.14 动物回归试验

2.2.2 TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

2.2.2.1 引物及探针的设计

2.2.2.2 SDPY株病毒液总RNA的提取

2.2.2.3 目的基因的扩增及克隆测序

2.2.2.4 阳性质粒标准品的制备

2.2.2.5 TaqMan探针荧光定量PCR反应条件的优化

2.2.2.6 荧光定量PCR标准曲线的建立

2.2.2.7 敏感性试验

2.2.2.8 特异性试验

2.2.2.9 重复性试验

2.2.2.10 临床样品检测

2.2.3 致雏鹅痛风的致病性研究

2.2.3.1 病毒增殖与培养

2.2.3.2 试验分组与攻毒

2.2.3.3 攻毒后的体重监测

2.2.3.4 病理组织切片的制备和观察

2.2.3.5 攻毒后血液生化指标变化情况

2.2.3.6 攻毒后血液中排毒规律的测定

2.2.3.7 攻毒后泄殖腔棉拭子中排毒规律的测定

2.2.3.8 攻毒后各组织器官中病毒载量的变化

3 结果

3.1 流行病学调查结果

3.2 细菌分离结果

3.3 病原检测结果

3.4 致雏鹅痛风病原的分离鉴定

3.4.1 鹅胚分离结果

3.4.2 鹅胚肾细胞分离结果

3.4.3 病原形态的观察

50)测定'> 3.4.4 病原毒力(ELD₅₀)测定

3.4.5 病原全基因遗传进化分析

3.4.6 病毒纯净度检测结果

3.4.7 动物回归试验

3.5 TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立结果

3.5.1 重组质粒的PCR鉴定及其测序鉴定

3.5.2 荧光定量PCR反应条件的优化

3.5.3 标准曲线的建立

3.5.4 敏感性试验结果

3.5.5 特异性试验结果

3.5.6 重复性试验结果

3.5.7 临床样本检测结果

3.6 致雏鹅痛风的致病性研究

3.6.1 人工感染雏鹅后临床症状和剖检变化

3.6.2 人工感染雏鹅后病理组织学变化

3.6.3 人工感染雏鹅后血液生化指标变化情况

3.6.4 人工感染雏鹅后血液中排毒规律的测定

3.6.5 人工感染雏鹅后泄殖腔棉拭子中排毒规律的测定

3.6.6 人工感染雏鹅后各组织器官中病毒载量的变化

4.讨论

4.1 致雏鹅痛风病原的确定

4.2 TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与分析

4.3 致雏鹅痛风的致病性研究

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 田家军

导师: 刁有祥

关键词: 雏鹅,痛风,星状病毒,动态分布,排毒规律

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家水禽产业技术体系项目(CARS-42-19)

分类号: S852.65

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致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定及对雏鹅的致病性

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