BsPif1解旋酶作用于G-四链体DNA的特异性位点研究

论文摘要

解旋酶是一类以ATP依赖的方式来催化破坏DNA或RNA之间的氢键的分子马达蛋白,参与细胞内多种代谢过程。Pif1解旋酶是广泛存在于病毒、原核和真核生物中的5’-3’方向解旋的SF1B解旋酶成员,近年来关于Pif1解旋酶的研究成果逐渐增多,得到了很多结构方面的数据,为理解Pif1解旋酶的工作机理和生物学功能提供了很多依据。2016年本实验室Chen et al.发表来自物种Bacteroides spp的Pif1解旋酶的BsPif1-AMPPNP,BsPif1-ADP,BsPif1-ADP-AlF3-ssDNA复合体三级晶体结构,建立了BsPif1-dsDNA复合体结构模型并提出BsPif1解旋dsDNA的工作机理。但是BsPif1作为一种特异性的G-四链体DNA（G4 DNA）解旋酶,它是如何解开G4 DNA,解旋G4 DNA的区域在何处,与G4 DNA相互作用的特异性位点有哪些,这些信息都是未知的。故我们对BsPif1继续进行深入研究,期望能够得到BsPif1与G4 DNA的复合体结构,深入研究BsPif1与G4 DNA之间的相互作用,找到BsPif1与G4 DNA相互作用的特异性位点,为理解Pif1解旋酶在细胞内发挥的生物学功能提供更多的数据支撑。首先通过原核表达及纯化得到纯度达到95%的BsPif1解旋酶,通过体外退火、Mono-Q离子交换层析方法纯化得到纯度较高且性质稳定的核酸底物,进而采用凝胶过滤层析、动态激光散射等方法,筛选到能够与BsPif1形成稳定的复合体的核酸底物,进行复合体结晶初筛实验。分别选择了5’端带尾链长度>6nt的两种G4 DNA（7T 3G4、6T TelG4）及一种dsDNA（7T11bp）尝试了复合体结晶筛选。在分别尝试了1152种结晶条件以后,目前还没有得到一个复合体晶体。因此本课题通过分子动力学模拟建立了BsPif1-G4 DNA复合体的三维结构,利用点突变实验分析BsPif1作用于G4 DNA的特异性位点。此外,荧光各向异性（FA）、快速停留荧光共振能量转移（stopped-flow FRET）、单分子荧光共振能量转移（smFRET）等3种方法分析BsPif1作用于G4 DNA的特异性氨基酸位点。最终得出以下结论:1.荧光各项异性分析位点突变对DNA结合活性的影响。结果表明,K92、R120、K121、K292、K341这5个位点对混合构型的TelG4 DNA的结合起到非常重要的作用,而R83、K87、K92、R120、K121、K292、K341这7个位点均对平行构型的3G4DNA以及dsDNA的结合起到非常重要的作用。2.快速停留荧光共振能量转移技术测定BsPif1突变体蛋白对G4 DNA和dsDNA的解旋活性,从解旋速率和解旋幅度这两个参数来分析位点突变的影响。结果表明,位于1B结构域的R83位点是特异性解旋G4 DNA的重要位点,其对dsDNA的解旋没有直接作用;而位于2B结构域的K341位点是特异性解旋dsDNA的重要位点,其对G4 DNA的解旋没有直接作用;K92、R120、K121、K292这4个位点是同时参与解旋G4 DNA和dsDNA的重要位点,其中R120的突变对G4 DNA的解旋产生较大影响。3.单分子荧光共振能量转移技术进一步分析BsPif1位点突变对解旋G4 DNA的活性的影响,结果表明R83、K92、R120、K121、K292这5个位点参与G4 DNA的解旋,与stopped-flow FRET分析得出的结论一致。最终发现位于1B结构域的R83是特异性地参与G4 DNA解旋的位点,其对dsDNA的解旋没有影响,并且位于1A结构域的R120位点对G4 DNA的解旋有重要作用。同时点突变实验结果也证明运用分子动力学手段建立的BsPif1-G4 DNA复合体结构模型对理解BsPif1与G4 DNA相互作用提供了重要的参考价值,这将会对后续指导我们研究BsPif1解旋酶的机理有很大的价值。

论文目录

摘要

ABSTRACT

主要符号对照表

第一章文献综述

1.1 解旋酶

1.1.1 解旋酶概述

1.1.2 解旋酶的分类

1.2 Pif1 解旋酶及其研究进展

1.2.1 Pif1 解旋酶研究进展

1.2.2 BsPif1 解旋酶研究进展

1.3 G4 DNA概述

1.4 解旋酶的研究方法

1.4.1 电泳迁移凝胶阻滞（EMSA）

1.4.2 荧光各向异性（Fluorescence Anisotropy,FA）

1.4.3 快速停留荧光共振能量转移技术（stopped-flow FRET）

1.4.4 单分子荧光共振能量转移技术（smFRET）

1.5 本研究的目的与意义

第二章 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体结晶实验

2.1 实验材料、仪器、试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表达纯化

2.2.2 核酸底物的制备

2.2.3 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的检测

2.2.4 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的结晶

2.3 实验结果

2.3.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表达纯化结果

2.3.2 核酸底物的制备结果

2.3.3 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的检测

2.3.4 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/ds DNA的晶体初筛结果

2.4 讨论

第三章 BsPif1 解旋酶与G4 DNA互作的特异性位点研究

3.1 实验材料、仪器、试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂

3.2 实验方法

3.2.1 BsPif1 解旋酶特异性突变位点的设计

3.2.2 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的载体构建与表达纯化

3.2.3 核酸底物的制备

3.2.4 荧光各向异性法测定BsPif1 位点突变对DNA结合亲和力的影响

3.2.5 Stopped-flow FRET测定BsPif1 位点对DNA解旋活性的影响

3.2.6 smFRET测定BsPif1 位点突变对DNA解旋活性的影响

3.3 实验结果

3.3.1 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的载体构建结果

3.3.2 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的表达纯化结果

3.3.3 核酸底物的制备结果

3.3.4 荧光各向异性法分析BsPif1 位点突变对DNA结合亲和力的影响

3.3.5 Stopped-flow FRET分析BsPif1 位点突变对解旋G4 DNA活性的影响

3.3.6 smFRET分析BsPif1 位点突变对解旋G4 DNA活性的影响

3.4 讨论

讨论与展望

附录

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张倩

导师: 奚绪光

关键词: 解旋酶,蛋白质表达纯化,荧光各向异性,快速停留荧光检测,单分子荧光共振能量转移

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金(编号:31370798)

分类号: Q75

总页数: 77

文件大小: 5035K

下载量: 86

BsPif1解旋酶作用于G-四链体DNA的特异性位点研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢