PCV3贵州流行株基因组分析及其Cap蛋白的原核表达研究

论文摘要

猪圆环病毒（PCV）是圆环病毒科圆环病毒属单股环状DNA病毒。根据抗原性和基因型的不同,分为PCV1、PCV2和PCV3三种血清型。PCV1最早于1974年被发现,认为是传代细胞PK-15培养的污染物,对猪不具有致病作用,在很多国家的猪体内普遍存在,而不产生临床症状。PCV2常引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）为代表的猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）,给养殖业带来巨大的危害。2016年,美国的Phan T和Palinski R几乎同一时间在不同地区的农场中检测出新型圆环病毒（PCV3）。随后,PCV3在中国、韩国、巴西等10多个国家相继被检出并报道,现已成世界性分布,给养猪业带来了极大的威胁。贵州省关于PCV3的流行病学调查及相关基因研究尚未见详细报道。本研究对贵州省PCV3的流行情况进行了分子流行病学调查,基于基因组序列进行了遗传进化分析,并对PCV3唯一结构蛋白,即主要免疫原性蛋白Cap进行了原核表达研究,为血清学检测方法ELISA试剂盒的研究奠定了基础。1.贵州省猪圆环病毒3型病毒分子流行病学调查及流行株基因组分析针对PCV3 ORF2区域设计特异性引物,应用PCR扩增技术,对实验室20122018年间收集的贵州省92个规模化养殖场送检的427份样品进行了PCV3 ORF2基因的特异性扩增,并对检测结果进行了归类比较分析。结果显示在427份样品中,91份为PCV3呈阳性,并与CSFV、PRRSV、PCV2、PEDV、PRV等病毒形成双重或多重感染,其中与PRRSV双重感染率高达59.3%;贵州各个地州市均存在PCV3感染,20122018年的阳性率逐年上升;贵阳市送检样品中PCV3检出率最高,为26.1%;PCV3阳性检出率最高的猪群系保育猪群,为25%。同时,论文还对部分阳性样品进行了PCV3全基因组的克隆和序列测定,共获得11株PCV3基因组序列,基因组大小均为2 000 bp。遗传进化分析发现11株PCV3中,2株属于PCV3b型,9株属于PCV3c型,未发现有PCV3a存在;各毒株间核苷酸序列相似性在98.9%100%之间,与国外毒株核苷酸相似性在98.7%99.8%之间,与国内PCV3毒株相比核苷酸相似性在97.3%99.9%之间,与PCV2和PCV1相似性在40%左右,遗传关系较远。2.猪圆环病毒3型Cap蛋白原核表达研究为获得PCV3 Cap蛋白,通过设计特异性引物针对Cap基因进行扩增,并将其克隆至pMD19-T载体中,再通过基因工程技术酶切后亚克隆至原核表达载体pET-32a中,经质粒PCR、双酶切及测序鉴定比对正确后,转化入Rosseta（DE3）大肠杆菌表达系统中,对影响诱导的条件即时间、温度、IPTG进行优化,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹试验（Western-blotting）等对表达的PCV3 Cap蛋白进行检测。结果显示成功构建了PCV3 Cap蛋白的原核表达质粒,在最佳表达条件,即1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导4 h后,SDS-PAGE电泳检测可在约43.1 KDa处检测到表达的目的蛋白。通过转印将蛋白转移至PVDF膜后,以带His标签的单克隆抗体为一抗,对融合表达蛋白进行Western-blotting检测,结果显示带His标签的单克隆抗体能和融合表达的目的蛋白特异性结合并显色。本研究为PCV3血清学鉴别诊断方法建立及ELISA试剂盒的研究奠定了基础。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

1 病原学

2 流行病学

2.1 PCV3 在国外的流行情况

2.2 PCV3 在国内的流行

2.3 PCV3 混合感染现状

3 PCV3 致病性研究现状

4 PCV3 检测方法研究现状

4.1 病原学检测方法

4.1.1 宏基因组测序法

4.1.2 PCR/qPCR检测法

4.1.3 多重定量实时聚合酶链反应（mqPCR）测定法

4.1.4 Taq Man实时PCR

4.1.5 实时重组酶聚合酶扩增（rt-RPA）测定

4.1.6 SYBR Green实时定量PCR检测方法

4.1.7 液滴数字PCR（ddPCR）测定

4.1.8 环介导等温扩增检测法

4.2 ELISA检测

5 研究目的及意义

第二章贵州PCV3 分子流行病学调查及基因组分析

1 材料

1.1 病料来源

1.2 主要试剂

1.3 主要实验仪器

2 方法

2.1 PCV3 引物设计与合成

2.2 病原核酸的提取

2.3 PCV3 阳性病料的PCR扩增检测

2.4 阳性病料统计与分析

2.5 PCV3 基因组的扩增

2.6 PCV3 基因组的获得与分析

3 结果与分析

3.1 病原PCR检测PCV3 结果

3.2 阳性病料统计与结果分析

3.2.1 不同猪群PCV3 阳性数和阳性率分析结果

3.2.2 不同样品中PCV3 阳性数和阳性率分析结果

3.2.3 不同年限PCV3 阳性数和阳性率分析结果

3.2.4 贵州省各地州市PCV3 阳性数和阳性率分析结果

3.2.5 PCV3 与其他病毒的混合感染分析结果

3.2.6 不同临床表现猪中PCV3 统计分析结果

3.3 PCV3 全基因组的获取及分析结果

3.3.1 PCV3 基因组的扩增结果

3.3.2 PCV3 基因组的序列分析

3.3.3 11株PCV3 基因组之间核苷酸序列相似性分析

3.3.4 贵州11株PCV3与国内外株核苷酸序列相似性分析

3.3.5 PCV3 基因组与国内外毒株遗传进化分析

3.3.6 贵州11株PCV3序列Cap蛋白理化性质分析

3.3.7 贵州11株PCV3基因型分析

3.3.8 贵州11株PCV3 ORF2 编码的Cap蛋白潜在磷酸化位点

3.3.9 贵州11株PCV3 ORF2编码的Cap蛋白N-糖基化和O-糖基化位点预测

4 讨论

5 结论

第三章猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达研究

1 试验材料

1.1 样品和菌株

1.2 试验主要试剂

1.3 主要仪器设备

2 试验方法

2.1 PCV3Cap理化性质分析及稀有密码子预测分析

2.2 引物设计

2.3 pMD-19T-PCV3-Cap重组质粒的构建

2.3.1 PCV3-Cap目的片段的获取

2.3.2 PCV3-Cap目的片段的连接转化

2.3.3 pMD19-T-PCV3-Cap重组质粒的提取与鉴定

2.4 pET-32a-PCV3-Cap原核表达质粒的构建

2.5 重组质粒pET-32a-PCV3-Cap的原核诱导表达

2.5.1 pET-32a-PCV3-Cap质粒转化入原核表达系统

2.5.2 重组质粒pET-32a-PCV3-Cap蛋白的原核融合表达

2.5.3 pET-32a-PCV3-Cap原核融合表达总蛋白的提取

2.6 原核融合表达蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳

2.7 原核融合表达蛋白的Western-blotting分析

2.7.1 蛋白Western-blotting分析准备

2.7.2 蛋白的转膜（半干转）

2.7.3 Western-blottin反应

2.7.4 W-TMB显色

3 结果

3.1 PCV3 ORF2 理化性质分析及稀有密码子预测分析结果

3.2 pMD-19T-PCV3-Cap重组质粒的构建结果

3.2.1 PCV3 ORF2 基因PCR扩增结果

3.2.2 pMD-19T-PCV3-Cap质粒PCR及酶切鉴定结果

3.3 pET-32a-PCV3-Cap重组质粒的构建结果

3.3.1 pET-32a-PCV3-Cap质粒PCR和酶切鉴定结果

3.3.2 pMD-19T-PCV3-Cap和 pET-32a-PCV3-Cap质粒测序比对结果

3.4 pET-32a-PCV3-Cap蛋白的原核表达研究结果

3.4.1 pET-32a-PCV3-Cap质粒转入原核表达系统鉴定结果

3.4.2 SDS-PAGE检测蛋白融合表达时间优化结果

3.4.3 SDS-PAGE检测蛋白融合表达IPTG浓度优化结果

3.4.4 SDS-PAGE检测蛋白融合表达温度优化结果

3.5 Western-blotting试验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附录一攻读硕士学位期间所获成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张爱琼

导师: 曾智勇

关键词: 分子流行病学调查,蛋白,遗传进化分析,原核表达

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 贵州大学

分类号: S852.651

总页数: 78

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