刘永萍[1]2003年在《甲磺酸甲酯对CAOV3细胞端粒酶活性的影响》文中研究说明前言 端粒酶是一种核糖核蛋白酶，它以自身RNA成分为模板催化合成TTAGGG重复序列，添加到真核细胞染色体末端，延长和维持端粒长度，使细胞寿命延长。大多数永生化细胞和恶性肿瘤细胞表达端粒酶活性。端粒酶已成为人们认识抗肿瘤药物的新靶点。 近来研究发现，某些肿瘤细胞经DNA损伤剂作用后端粒酶活性显着降低，可能是损伤端粒结构或其它诸如细胞周期阻滞或凋亡等间接作用的结果。甲磺酸甲酯(methylmethanesulfonate，MMS)是一种能引起DNA损伤的烷化剂，主要使嘌呤硷基环上的氮原子和氧原子发生甲基化，导致DNA双链断裂、点突变，有潜在损伤端粒DNA结构和致细胞凋亡作用。本研究旨在观察MMS对卵巢癌细胞CAOV3端粒酶活性的影响，并观察其是否对肿瘤细胞有凋亡诱导作用。 方法 CAOV3细胞培养在10mlRPMI1640培养基中，其中含10％小牛血清，青、链霉素各100ku/L。37℃，5％CO_2，饱和湿度条件下培养。噻唑蓝(MTT)法测定药物作用浓度如下：2mmol/L，1mmol/L，0.1mmol/L，0.01mmol/L。台盼蓝拒染法计数活细胞。活细胞率（％）＝【活细胞总物（活细胞总数十死细胞总数N x 100％。流式细胞术观察细胞凋亡及细胞周期分布。端粒重复扩增法（TRAP人聚丙烯酸胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性。统计学处理：采用卡方检验。 结 果 将各用药组细胞与相应未用药组细胞于培养120h进行比较，活细胞百分率分别为门3．8。2．3）％（未用药组人”3．3。2．7）畅（0．01 tnml／L MMS），（93．5 t 2．4）％（0．IIYUndeLMMS），和万2．7 t 2．l）％门 MMS人各用药组与未用药组活细胞百分率比较无显着差异河＞0．05人 流式细胞分析结果显示CAOV3细胞经 lmmoUL MMS作用 24h，48h均未见亚二倍体峰，但S期百分率明显升高，同时GO／G；期细胞百分率有所下降，提示经MMS作用后，细胞周期受阻于S期。另外，将不同浓度的MMSN．01－ZnunoVL）作用于CAOV3细胞24h后，检测其端粒酶活性变化。结果显示MMS明显提高了各组细胞的端粒酶活性，甚至在相对较低浓度N．01mmoUL）下也起作用，但以Inunol／L浓度时作用活性最强。InunoULMMS作用于 CAOV3细胞不同时间，结果显示端粒酶活性于作用 10h时就有所提高，作用24h时几乎达到未用药对照组的两倍，作用48h后逐渐下降，作用96h时几乎回到用药前水平。如果在加人引物之前将MMS直接加在CAOV3细胞提取物Zh，结果显示端粒酶活性没有变化，因此排除了MMS对端粒酶的直接激活作用。 讨 论 端粒酶是一种特异性核糖核蛋白多聚酶，它通过延长端粒长 ·2·度而补充随每一轮DNA复制所丧失的端粒重复序列。恶性肿瘤的无限增殖需要端粒酶来维持染色体末端的稳定性。因此，抑制端粒酶活性就为抗肿瘤治疗提供了新策略。研究证实许多DNA损伤剂有抑制肿瘤细胞端粒酶活性的作用，而多数化疗药对肿瘤细胞的杀伤作用是通过凋亡诱导途径实现的。然而有关端粒酶活性变化与肿瘤细胞对化疗药物敏感性之间的关系还不甚清楚。 本实验将不同浓度的MMS作用于CAOV3细胞后，发现其端粒酶活性有不同程度的提高，其中 IInlndeL MMS作用 24h时，细胞端粒酶活性最强。端粒酶活性提高可能是肿瘤细胞修复损伤DNA的需要。断裂DNA的愈合过程可能受端粒酶介导。另外，我们发现将MMS作用于卵巢癌细胞120h后0药组与未加药组活细胞百分率无明显差异。将 lmmVLMMS作用于 CAOV3细胞24和48h后，流式细胞分析结果显示均未见明显的亚二倍体凋亡峰。表明该细胞对MMS存在抗凋亡的可能性。CAOV3细胞对MMS的抗凋亡作用可能与MMS上调端粒酶活性有关。最近报导在去除端粒酶＊＊A成分的小鼠中，端粒长度的缩短能够破坏双链DNA断裂后修复机制，由此提高了小鼠对电高辐射和阿霉素等DNA损伤剂的敏感性。、这些结果提示延长端粒或使端粒酶过表达将有利于双链DNA的断裂后修复。 目前关于端粒酶活性与细胞周期之间的关系还不够明了。有报导认为端粒酶主要是在细胞周期的s期被激活的，而在民／M期几乎检测不到其活性。我们发现CAOV3细胞经MMS作用24和48h后主要受阻于 S期。经 MMS作用后，端粒酶活性上调可能与该酶的细胞周期依赖性调节有关。MMS对CAOV3细胞端粒酶活性的上调作用可能是通过增加S期细胞的百分率而实现的。 总之，我们的实验结果表明MMS对CAOV3细胞端粒酶活性有上调作用，而这种上调作用可能是卵巢癌细胞对MMS产生抗凋亡作用的原因之一。这一结果有利于我们进一步理解端粒酶在恶 ·3·性肿瘤中的作用。深人理解端粒酶活性变化与恶性肿瘤对化疗敏感性的关系将为临床克服肿瘤抗药性提供新思路。 结 论 ＊甲磷酸甲酯对CAOV3细胞端粒酶活性起上调作用。 2．CAOV3细胞对甲磷酸甲酯存在抗凋亡的可能性。 3．甲磷酸甲酯对CAOV3?
刘永萍, 赵恂, 杨平, 时亮, 姚阳[2]2003年在《甲磺酸甲酯对CAOV3细胞端粒酶活性的影响》文中认为目的:探讨卵巢癌细胞CAOV3经烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)作用后端粒酶活性变化与生长状态之间的关系。方法:台盼蓝拒染法计数活细胞,噻唑蓝(MTT)法测定药物作用浓度,流式细胞术观察细胞凋亡,端粒重复扩增法(TRAP)、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性。结果:用药组与未用药组活细胞百分率无显着差异。MMS主要使CAOV3细胞受阻于S期,未见凋亡峰。用药组与对照组相比较端粒酶活性增强。结论:MMS对CAOV3细胞端粒酶活性有上调作用。CAOVB细胞对MMS的抗凋亡效应可能与端粒酶活性上调有关。
参考文献：
[1]. 甲磺酸甲酯对CAOV3细胞端粒酶活性的影响[D]. 刘永萍. 中国医科大学. 2003
[2]. 甲磺酸甲酯对CAOV3细胞端粒酶活性的影响[J]. 刘永萍, 赵恂, 杨平, 时亮, 姚阳. 中国医科大学学报. 2003