陈义忠[1]2003年在《ZS株弓形虫P22基因片段的克隆和表达》文中研究表明目的：研究ZS株弓形虫表膜抗原P22编码基因的克隆和表达。 方法：从ZS株弓形虫基因组中扩增出P22编码基因的位于开放阅读框架(ORF)中的一长496bp的片段，限制性内切酶Pst Ⅰ和BgL Ⅱ双酶切该片段，胶回收纯化，插入表达质粒载体pThioHisA，B，C多克隆位点，构建原核质粒重组体pThioHisA，B，C/P22，并转化E.coli Top 10，筛选阳性克隆，以限制性酶切分析及测序鉴定后，以IPTG进行诱导，在E.coli Top 10中表达，用SDS—PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western-blot分析重组抗原的活性，并纯化表达产物。同时扩增P22编码基因ORF的全长561bp片段，经Pst Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切后，定向克隆于质粒pBudCE 4.1，构建真核重组重组表达质粒pBudCE 4.1/P22，通过脂质体介导转染入小鼠巨噬细胞RAW264.7，以RT-PCR方法鉴定目的基因在巨噬细胞中的表达。 结果： 1．从弓形虫ZS株基因组中扩增出P22编码基因的一长496 bp，另一长561bp的片段，并成功构建含P22编码基因的原核质粒重组体pThioHisA，B，C/P22，及真核重组表达质粒pBudCE 4.1/P22。 2．以P22编码基因片段构建的重组表达质粒pThioHisA，B，C/P22，可在E.coli中以硫过氧化物融合蛋白的形式高效表达，SDS—PAGE显示表达正确的条带。Western-blot证实重组蛋白能被感染弓形虫兔血清所识别。ProBond~(TM)树脂柱可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。 3．成功获取pBudCE 4．l／P22转染的l／噬hll胞则性克隆，并证实 P22－m洲A0阳比九隆细胞中的表达。 结 论：成功构建弓形虫ZS株表膜抗原P22编码是因pThiOHISA，B，C／P22表达质粒，诱导表达弓形虫农牧抗原p22蛋白，儿g。b化该融合蛋白，该重组蛋白只有化疫反应件。并成功获取p＊u」CE4．1／门二转染的巨噬细胞阳性克隆，为弓形虫人与诊断和抗原的免疫特件及其对【噬细胞的免疫调节功能作用的研究奠定从｛；Z扎．
陈义忠, 章涛, 彭碧文, 黄清玲, 林建银[2]2003年在《弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化》文中提出目的 克隆弓形虫 ZS株表面抗原 P2 2编码基因 ,构建原核重组表达质粒 p Thio His A,B,C/ P2 2 ,并在大肠杆菌 (Top10 )中进行表达及纯化融合蛋白。 方法 PCR扩增及限制性内切酶 Pst 和 Bgl 双酶切 4 96 bp的弓形虫表面抗原 P2 2编码基因目的片段 ,胶回收纯化 ,插入表达质粒载体 p Thio His A,B,C多克隆位点 ,构建重组体p Thio His A,B,C/ P2 2 ,并转化大肠杆菌 (E.coli) Top10 ,筛选阳性克隆 ,以限制性酶切分析及测序鉴定后 ,以异丙基硫代β- D-半乳糖苷 (IPTG)进行诱导 ,在 E.coli Top10中表达 ,用 SDS- PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化。 结果 PCR扩增出约 4 96 bp的 P2 2编码基因目的片段 ,与预期片段大小相符 ;所构建的 p Thio His A,B,C/ P2 2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定 ,与预期结果一致 ;SDS- PAGE与免疫印迹显示 ,表达融合蛋白产物约 35 .4 k D。 结论 成功构建弓形虫 ZS株表面抗原 P2 2编码基因 p Thio His A,B,C/ P2 2表达质粒 ,诱导表达弓形虫表面抗原 P2 2蛋白 ,并纯化该融合蛋白
陈义忠, 章涛, 黄清玲, 彭碧文, 林建银[3]2004年在《zs株弓形虫P22基因片段在巨噬细胞中的表达》文中进行了进一步梳理目的 克隆表达ZS株弓形虫表膜抗原P2 2编码基因的巨噬细胞株。方法 扩增P2 2编码基因ORF的全长 5 6 1bp片段 ,经PstI、XbaI双酶切后 ,定向克隆于质粒 pBudCE 4 .1,构建真核重组表达质粒 pBudCE 4 .1/P2 2 ,通过脂质体介导转染入小鼠巨噬细胞RAW2 6 4 .7,以RT PCR方法鉴定目的基因在巨噬细胞中的表达。结果 成功获取pBudCE 4 .1/P2 2转染的巨噬细胞阳性克隆 ,并证实P2 2 mRNA在阳性克隆细胞中的表达 ,为P2 2蛋白对巨噬细胞的免疫调节功能作用的研究奠定基础。
龚娅[4]2000年在《弓形虫P30叁种表达形式重组质粒的构建及遗传免疫效果的初步测试》文中研究说明背景：弓形虫是一种专性细胞内的寄生原虫，呈世界性分布，能引起人兽共患的弓形虫病。全世界约有1/3的成年人感染弓形虫。若孕妇感染弓形虫，则虫体可经胎盘传给婴儿，导致流产、畸胎；而在肿瘤患者、AIDS病人等免疫功能严重受损者，作为一个主要的机会致病因子，弓形虫是引发致死性病变的主要病原之一。因此，为了防治弓形虫病，迫切需要研制出一行之有效的弓形虫疫苗。已有研究表明，弓形虫的主要表面抗原P30具有很强的免疫原性，是非常理想的候选疫苗分子。与传统疫苗相比，90年代发展起来的核酸疫苗技术因其潜在的优势使其得到迅速而广泛的应用。目前，弓形虫核酸疫苗的研究也取得了一些进展，已经证实用编码弓形虫P30抗原的质粒DNA进行核酸免疫，能够引起特异性的抗感染免疫应答，但是，弓形虫P30基因不同表达形式的重组质粒所产生的免疫效果如何，尚不得而知。 目的：通过构建含弓形虫P30基因不同表达形式（膜型、分泌型及细胞内型）的重组质粒，并将其免疫小鼠，测定抗体水平，以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗分子。 方法：1、弓形虫表膜型P30基因重组质粒的构建：设计并合成了一对引物，利用PCR技术，从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出完整的P30编码序列（包括信号肽及疏水尾），将其克隆到真核表达载体pcDNA中，构成pcDNA3-P30Mb。 2、弓形虫分泌型P30基因重组质粒的构建：回收纯化PCR扩增的P30基因片段，用PstI切去C端的疏水氨基酸序列，再克隆到pcDNA中，构成pcDNA3-P30Se。 3、弓形虫细胞内型P30基因重组质粒的构建：用限制性内切酶EcoRI和BamHI将重组质粒pBV220-P30In的小片段切下，亚克隆到pcDNA中，目为pcDNA3-P30In。 4、将质粒DNA与lipofectin以5:2的比例混合，经小鼠股四头肌注射，5ug/只。2周后，加强注射一次。分别于免疫前及免疫后2周、4周、6周自小鼠尾静脉采血，用Westernblot和ELISA检测IgG抗体水 5、诱导含昨T－A SP30 A PI的工程菌表达 P30蛋白并纯化，免疫印D 迹测定其免疫活性，以用于检测小鼠血清中的特异性抗体。同时，对纯DD 化条件进行优化。Dl 结果：l、经双酶切鉴定及DNA序列测定，叁种重组质粒中的插入 ll 片段确为弓形虫P30的编码基因且读码框架正确。l12、小鼠血清中IgG抗体的检测：免疫印迹显示，免疫后2周，除lD 细胞内型重组质粒免疫组外，膜型及分泌型兔疫组均出现较弱的反应D 带，且前者显色略浅，在免疫后4周和6周，叁个兔疫组均显示IgG抗 体反应带，且各组之间颜色深浅无明显差异。另一方面，从IgG抗体产l 生的时间进程来看，免疫后2周，抗体反应带较弱，而在免疫后4周和l16周，抗体反应显着增强，同时也可看出，4周和6周的反应带深浅无l 明显变化。ELISA定量结果显示，空载体pCDNA3注射组与叁种重组质D 粒注射组之间有显着性差异o功刀5），说明弓形虫P3O基因的重组质D 粒确实能够诱导机体产生特异性抗体；免疫后2周，pcDNA3I30In注 射组与PcDNA3P30Mb和PcDNA3I30Se注射组之间的差别具有显着。＠u＜0．05），thegM＃ZredIBARgH0＞0．05）；the＆＆s 4 N和～16周，叁个免疫组之间的 IgG抗体水平无显着性差异0＞0．05）；同 l ＃，）A IgG ftWPI％rtfedsfg＄％，m＆ti 2 MghffiW7k4K（ff，f～l 了第4周和6周时，各免疫组的IgG抗体均较二周时明显增加，但4周ll 和 6周之间的 IgG抗体水平无明显变化0＞0．05），表现为一平台期。l13、纯化蛋白能与弓形虫病人阳性血清反应，出现了特异性反应lIw。l14、经免疫印迹显示，浓缩至初始体积的1／3刁历时，纯化蛋白的反”lD 应带颜色最深，说明此时有活性的纯化蛋白的浓度最高。D 结论：l、成功地构建了弓形虫P30基因叁种表达形式的重组质D 粒。D12、用编码P30抗原的重组质粒进行核酸免疫，能够诱导免疫小鼠 l 产生特异性的IgG抗体。膜型及分泌型重组质粒诱导IgG抗体的出现先 于细胞内型。但随着时间延长，其抗体水平无明显差别。因此，就产生IIgG抗体而言，叁种重组质粒的免疫效果是基本相同的。l 3、本方法表达纯化的P30蛋白具有免疫学活性，可用于体外检 测。在纯化过程中，最佳浓缩程度是浓缩至初始体积的1／3－l／6，此时，D 有活性的纯化蛋白浓度最高。
参考文献：
[1]. ZS株弓形虫P22基因片段的克隆和表达[D]. 陈义忠. 福建医科大学. 2003
[2]. 弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化[J]. 陈义忠, 章涛, 彭碧文, 黄清玲, 林建银. 福建医科大学学报. 2003
[3]. zs株弓形虫P22基因片段在巨噬细胞中的表达[J]. 陈义忠, 章涛, 黄清玲, 彭碧文, 林建银. 中国人兽共患病杂志. 2004
[4]. 弓形虫P30叁种表达形式重组质粒的构建及遗传免疫效果的初步测试[D]. 龚娅. 第一军医大学. 2000