GldM蛋白在鸭疫里默氏杆菌致病过程中的作用机制

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemrella anatipestifer,RA）引起的一种主要侵害雏鸭、雏火鸡、鹅等多种禽类的急性或慢性、败血性、接触性传染病。感染鸭发病率高达90%、死亡率高达75%,对世界养鸭业造成重大经济损失。RA属于拟杆菌门,黄杆菌属,无鞭毛和菌毛,而拟杆菌门有多种菌都存在滑行运动的现象。基因分析发现RA同样存在着滑行运动基因,同时还存在一整套的新型分泌系统即IX型分泌系统（the type IX secretion system,T9SS）基因,该系统在拟杆菌门中普遍存在且高度保守。在前期研究中我们用转座子随机突变技术筛选到一株Yb2AS87RS08465基因突变株,发现其毒力显著减弱,但具体的机制并不清楚。基因比对分析发现AS87RS08465编码细菌滑行运动和IX型分泌系统核心组分蛋白GldM。通过Western blot鉴定到该蛋白位于RA的细胞膜上。琼脂糖凝胶扩散试验证实了野生株Yb2存在着滑行运动,而突变株的滑行运动能力丧失。进一步的研究表明突变株RA2281（又称Yb2ΔgldM）的黏附和入侵细胞的能力显著降低,此外,突变株Yb2ΔgldM感染雏鸭的血液载菌量显著低于相同剂量野生株感染雏鸭的载菌量,表明AS87RS08465基因对RA感染雏鸭的致病性至关重要。经转录组测序发现,突变株Yb2ΔgldM有15个基因上调表达,其中有6个上调表达倍数在2倍以上、下调表达基因15个,其中有5个下调2倍以上,且部分基因也是IX型分泌系统的组分,提示这些成分之间存在着功能上的联系。本研究表明GldM蛋白与RA滑行运动有关,且对RA感染鸭的致病性有着关键作用。提取野生株Yb2、突变株Yb2ΔgldM和回复株cYb2ΔgldM的分泌蛋白,SDS-PAGE分析发现突变株Yb2ΔgldM在分泌蛋白的丰度和含量上较Yb2和回复株cYb2ΔgldM有很大的区别,Yb2ΔgldM分泌蛋白的酶活试验也证实其酶降解能力显著降低,表明突变株缺失了分泌某些关键酶分子的能力。质谱分析结果显示Yb2ΔgldM的分泌蛋白与Yb2相比,具有显著性的差异,这些差异蛋白有9个含有特异性CTD结构,是IX型分泌系统的分泌底物。基因功能注释显示这9个蛋白很多都是具有催化活性的酶类,可能是RA重要的潜在毒力因子。本研究证明了GldM蛋白与RA的滑行运动、IX型分泌系统及蛋白分泌有关。

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摘要

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英文缩略表

第一章引言

1.1 鸭疫里默氏杆菌研究进展

1.1.1 病原形态与特性

1.1.2 流行病学与诊治

1.1.3 血清型与毒力因子

1.2 滑行运动（Gliding Motility）

1.3 Ⅸ型分泌系统

1.4 GldM蛋白研究

第二章鸭疫里默氏杆菌突变株的生物学特性分析

2.1 目的和意义

2.2 材料

2.2.1 菌株、质粒及细胞系

2.2.2 主要仪器设备

2.2.3 主要试剂及耗材

2.2.4 主要溶液的配制

2.2.5 试验动物

2.2.6 引物设计

2.3 实验方法

2.3.1 回复株cYb2ΔgldM的构建

2.3.2 生长曲线的测定

2.3.3 重组GldM蛋白的原核表达与纯化

2.3.4 兔抗rGldM蛋白多抗血清的制备

2.3.5 GldM蛋白的表达鉴定和亚细胞定位

2.3.6 RA滑行运动能力的测定

2.3.7 RNA转录组高通量测序和差异表达基因的验证分析

2.3.8 RA黏附入侵能力的测定

2.3.9 RA血液载菌量测定

2.4 结果

2.4.1 回复株cYb2ΔgldM的构建

2.4.2 细菌株生长曲线的测定结果

2.4.3 重组GldM蛋白的原核表达与纯化

2.4.4 GldM蛋白的表达鉴定及亚细胞定位

2.4.5 RA的显微观察

2.4.6 差异表达基因的qRT-PCR的验证结果

2.4.7 突变株黏附入侵Vero细胞的能力

2.4.8 突变株血液载菌量的测定

2.5 讨论

第三章鸭疫里默氏杆菌分泌蛋白的研究

3.1 目的和意义

3.2 材料

3.2.1 菌株

3.2.2 主要试剂耗材

3.2.3 主要溶液的配置

3.2.4 主要仪器设备

3.3 方法

3.3.1 RA分泌蛋白的收集

3.3.2 RA分泌蛋白的提取

3.3.3 突变株分泌蛋白酶活力测定

3.3.4 突变株分泌蛋白差异性分析

3.4 结果

3.4.1 RA分泌蛋白的SDS-PAGE及酶活性分析

3.4.2 RA分泌蛋白的质谱鉴定和定量结果

3.4.3 RA野生株Yb2和突变株Yb2ΔgldM分泌蛋白差异性分析

3.5 讨论

第四章全文总结

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈宗超

导师: 于圣青

关键词: 鸭疫里默氏杆菌,型分泌系统,毒力

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发计划“水禽重要疫病诊断新技术研究”(2016YFD0500805),国家自然科学基金青年科学基金项目(31602069)

分类号: S852.61

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