拟黑多刺蚁蜕皮激素受体PvEcR与PvTll及PvExd基因关联性研究

论文摘要

昆虫蜕皮激素受体（ecdysteroid receptor,EcR）,调节生长发育在昆虫体内,作用广,对控制昆虫的蜕皮起着重要作用。当EcR与USP（ultraspiracle）形成二聚体时,即EcR/USP,两者可以共同刺激蜕皮级联反应,控制昆虫生长、变态、生殖等历程。Tailless（Tll）是类固醇核受体家族的一个转录因子,该受体的生理配基至今仍未被识别,为孤儿核受体。能够控制分节、神经系统生成。Extradeticle（Exd）是一种辅因子,作用于昆虫附肢发育、背板形成。Homothorax（Hth）也是一种辅因子,对附肢、神经系统形成等有作用。阿斯巴甜及苯甲酸钠广泛存在于食物中,其虽然风险度低,但是这些物质对人可能的潜在危害依然存在。研究表明阿斯巴甜对小鼠、火红蚁生长发育、对人脑部、果蝇神经系统有影响,苯甲酸钠对秀丽线虫有生殖、神经毒性,对草履虫、嗜热四膜虫生长发育、对大鼠神经系统有影响。拟黑多刺蚁（Polyrhachisvicina Roger）属于社会性昆虫典例,品级分化显明,此物种还具有一定的营养价值,还可治疗人类的一些疾病,也容易获得,因此是做实验的好材料。本项研究以Pvicina为研究对象,研究内容呈两个部分:第一部分利用RNAi技术沉默PvEcR及PvTll,观察蚂蚁的外形,记录死亡率,称量体重,探讨这两个基因对拟黑多刺蚁的发育的影响:并且利用qRT-PCR技术从mRNA水平探究PvEcR与PvTll及PvExd关联性,分析三者在P.vicina生长发育过程的作用,以及对不同品级虫体的影响。第二部分采用阿斯巴甜和苯甲酸钠两种食品添加剂,设置不同浓度溶液,饲喂处理P.vicina不同品级成虫,利用qRT-PCR技术,从mRNA水平检测虫体被饲喂处理前后体内PvEcR、PvTll、PvExd、PvHth基因的表达情况;观察统计虫体被饲喂处理前后表型变化,推测喂食阿斯巴甜和苯甲酸钠对拟黑多刺蚁生长发育及品级分化的影响。研究结果如下:1.通过给虫体喂食dsEcR,观察发现,4龄幼虫发育异常,蛹蜕皮受阻,工蚁腹部外形异常,雄蚁翅膀残缺,雌蚁腹部变为褐色;虫体体重下降。除雌蚁外,雄蚁及工蚁的死亡率增加,由此表明PvEcR-RNAi后对P.vicina正常生长发育有直接影响作用。采用qRT-PCR技术从mRNA水平探讨PvEcR与PvTll、PvExd的相关性,我们看到,PvEcR被干扰后,4龄幼虫、蛹、工蚁、雄蚁和雌蚁中PvEcR mRNA表达水平显著下调;对雄蚁体内PvTll的影响最大,蛹次之,对雌蚁、工蚁、4龄幼虫影响较弱;对4龄幼虫中PvExd的影响最大,雌蚁次之,蛹和工蚁最小,而在雄蚁中PvExd上调变化明显。同一品级不同基因比较表明,PvEcR被干扰后对不同发育阶段,不同品级成虫PvTll表达量的影响大于PvExd的。2.通过给虫体饲喂dsRNA-PvTll,我们发现,PvTll被干扰后,4龄幼虫、蛹、工蚁、雄蚁和雌蚁中PvT7l mRNA表达水平显著下降;雄蚁中PvEcR、PvExd显著上调,而在4龄幼虫、蛹、工蚁、雌蚁中显著下调,但在工蚁中PvEcR的变化不显著。以上研究显示在工蚁中PvT7l-RNAi后,对PvExd的影响比较大;对雌蚁,蛹,4龄幼虫体内PvEcR、PvExd有一定的影响;对雄蚁中PvEcR的影响最大。由此表明PvTll与PvEcR及PvExd具有一定的相关性。观察虫体表型变化,发现虫体死亡率变化对雌蚁影响最低,雄蚁次之,蛹第三,对4龄幼虫的影响最大;体重均下降,利用ZEISS解剖镜对PvTll-RNAi前后,4龄幼虫、蛹及不同品级成虫外形进行对比观察,结果表明PvTll-RNAi后对幼虫的影响比成虫的大。3.用五种浓度阿斯巴甜饲喂蚂蚁后,检测P.vicina不同品级成虫体内的PvEcR、PvTll、PvExd、PvHHth基因的表达情况。经分析,选择50x进行后续实验,结果表明经阿斯巴甜饲喂处理后,雌蚁中仅PvEcR表达呈显著变化（P<0.05）,PvTll在4龄幼虫与蛹中表达呈极显著变化（P<0.01）,且趋势一致。浸润4龄幼虫第12天时PvExd表达呈极显著变化（P<0.01）。统计死亡率发现,该种物质对雌蚁的影响最低,雄蚁次之,蛹最大。体重测量结果表明,雌蚁与雄蚁的体重下降,4龄幼虫与蛹有交叉变化出现。该种物质对体长的影响不明显。虫体外形异常不明显。由此推测阿斯巴甜对P.vicina虫体的生长发育具有一定的影响。4.用五种浓度苯甲酸钠饲喂蚂蚁后,检测P.vicina不同品级成虫体内的PvEcR、PvTll、xPvEd、PvHth基因的表达情况。经统计分析,选择1.5g/L进行后续实验,结果显示经苯甲酸钠饲喂处理P.vicina不同品级成虫后,PvEcR在雌蚁、蛹有极显著下调（P<0.01）;PvTll在雌蚁中有极显著下调,在蛹中显著上调（P<0.05）,PvExd在雄蚁,雌蚁中有极显著下调（P<0.01）,推测苯甲酸钠对基因正常表达具有一定影响,并且比阿斯巴甜的作用明显。统计死亡率发现,苯甲酸钠对蛹的影响最大,4龄幼虫次之,雌蚁最低。体重测量结果表明,三个品级成虫的重量都有所下降;虫体外形稍有异常。由此推测苯甲酸钠对P.vicina虫体的生长发育具有一定的影响。本研究首次探讨了被干扰后与PvTll及PvExd的相关性;第一次对PvTll进行了有效沉默,观察到此基因对P.vicina生长发育调节的重要性,也第一次探讨PvTll与PvEcR及PvExd的相关性,此项工作为以后相关的研究奠定了一定基础。本研究首次采用不同浓度的阿斯巴甜与苯甲酸钠饲喂P.vicina,检测了这两种食品添加剂对PvEciR、PvTll、PvExd、PvHHth基因正常表达的影响。为认识和了解这两种食品添加剂的毒理作用提供了一定的研究依据。

论文目录

摘要

Abstract

第1章前言

1.1 拟黑多刺蚁概述

1.2 蜕皮激素受体EcR研究概述

1.3 Tailless研究概述

1.4 Extradeticle研究概述

1.5 Homothorax研究概述

1.6 食品添加剂阿斯巴甜研究概述

1.7 食品添加剂苯甲酸钠研究概述

1.8 RNAi技术研究概况

1.9 研究目的及意义

1.10 研究内容与技术路线

第2章 PvEcR对P.vicina生长发育、品级分化的影响及其与PvTll和PvExd的相关性研究

2.1 实验材料

2.1.1 研究材料

2.1.2 主要耗材、仪器

2.1.3 主要试剂、配方

2.2 实验方法

2.2.1 总RNA提取及质量检测

2.2.2 第一链cDNA合成

2.2.3 引物设计及模板质量检测

2.2.4 胶回收纯化及测序

2.2.5 PvEcR RNAi实验

2.3 实验结果与分析

2.3.1 PvEcR干扰后总RNA提取

2.3.2 模板质量及PvEcR引物特异性检测

2.3.3 添加T7启动子

2.3.4 PvEcR-dsRNA稳定性检测

2.3.5 PvEcR-dsRNA干扰浓度初选择

2.3.6 实时定量PCR确定最终干扰的最佳浓度

2.3.7 实时定量PCR检测不同发育阶段不同品级成虫PvEcR-dsRNA的干扰效率

2.3.8 PvEcR与PvExd及PvTll关联性研究

2.3.9 P.vicina虫体的表型变化

2.4 讨论

第3章 PvTll对P.vicina生长发育、品级分化的影响及其与PvEcR和PvExd的相关性研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 总RNA提取及质量检测

3.2.2 第一链cDNA合成

3.2.3 引物设计及模板质量检测

3.2.4 胶回收纯化及测序

3.2.5 PvTll RNAi实验

3.3 实验结果与分析

3.3.1 PvTll干扰后总RNA提取

3.3.2 模板质量及PvTll引物特异性检测

3.3.3 添加T7启动子

3.3.4 PvTll-dsRNA稳定性检测

3.3.5 PvTll-dsRNA干扰浓度初选择

3.3.6 实时定量PCR最终确定PvTll-dsRNA干扰的最佳浓度

3.3.7 实时定量PCR检测不同发育阶段不同品级成虫PvTll-dsRNA的干扰效率

3.3.8 PvTll与PvExd及PvEcR关联性研究

3.3.9 P.vicina虫体表型的变化

3.4 讨论

第4章阿斯巴甜对P.vicina生长发育、品级分化及其对PvEcR、PvTll、PvExd、PvHth的影响

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.2.1 Total RNA提取及质量检测

4.2.2 第一链cDNA合成与模板质量检测

4.2.3 阿斯巴甜干扰实验

4.3 实验结果

4.3.1 阿斯巴甜干扰后总RNA提取

4.3.2 模板质量

4.3.3 阿斯巴甜最佳干扰浓度确定

4.3.4 阿斯巴甜干扰后不同发育阶段不同品级成虫体内PvTll、PvEcR,PvExd mRNA表达变化

4.3.5 阿斯巴甜干扰后虫体表型的变化

4.4 讨论

第5章苯甲酸钠对P.vicina生长发育、品级分化及其对PvEcR、PvTll、PvExd、PvHth 的影响

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 Total RNA提取与质量检测

5.2.2 第一链cDNA合成与质量检测

5.2.3 苯甲酸钠干扰实验

5.3 实验结果

5.3.1 苯甲酸钠干扰后总RNA提取

5.3.2 模板质量

5.3.3 苯甲酸钠最佳干扰浓度确定

5.3.4 苯甲酸钠干扰后不同发育阶段不同品级成虫体内PvTll、PvEcR、PvExd mRNA表达变化

5.3.5 苯甲酸钠干扰后虫体表型的变化

5.4 讨论

总结

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王桂荣

导师: 奚耕思

关键词: 拟黑多刺蚁,干扰,阿斯巴甜,苯甲酸钠

来源: 陕西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 陕西师范大学

分类号: Q963

DOI: 10.27292/d.cnki.gsxfu.2019.000435

总页数: 108

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拟黑多刺蚁蜕皮激素受体PvEcR与PvTll及PvExd基因关联性研究

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