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短杆菌来源胆固醇氧化酶的重组表达及杂化纳米花固定化研究

2020-12-08阅读(589)

短杆菌来源胆固醇氧化酶的重组表达及杂化纳米花固定化研究

论文摘要

胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase,COD）是一种多功能生物酶,属于黄素蛋白氧化还原酶,该酶是生物细胞代谢过程中胆固醇降解的重要酶,被广泛应用于临床检测,农业,食品检测等领域。本研究将短杆菌Brevibacterium sp.来源的胆固醇氧化酶基因（cod）在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达,研究了其酶学性质;对重组酶进行有机-无机杂化纳米花固定研究,考察了COD对不同底物的转化能力,并对产物进行了鉴定。（1）以含有Brevibacterium sp.来源cod基因的质粒pET28a-cod作为PCR模板,扩增cod基因,将其与质粒pRhamTM连接,并在宿主E.coli BL21（DE3）菌株中进行重组表达。使用7-氯-异咯嗪及黄素单核苷酸（FMN）为亲和配体填料的纯化柱进行纯化,获得比酶活25.23 U·mg-1的纯酶。酶学性质测定显示胆固醇氧化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.0,经差式扫描量热分析（DSC）,得到酶半变性温度为60.5℃。对诱导条件进行优化,当诱导剂浓度为0.25%时,30℃诱导16 h,酶活为10.6 U·mL-1,是未优化时的1.5倍。（2）通过有机无机金属杂化纳米花的方式对COD进行固定,无机载体选择Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+的水不溶性盐结晶,对固定化条件从不同酶浓度、不同金属离子浓度方面进行优化。Cu2+、Zn2+、Mn2+载体最终选择酶浓度为0.15 mg·mL-1,金属离子浓度为1.6 mmol·L-1,此外当0.1 mg·mL-1 COD时,分别用0.8 mmol·L-1Ca2+、1.6mmol·L-1的Fe3+进行后续实验。使用FE-SEM、DSC、XRD及FTIR等技术对固定化形成的纳米花进行表征及性质鉴定,并测定了固定化酶的酶学性质。发现当Cu2+、Ca2+和Zn2+为无机载体时,最优条件下最高比酶活分别是0.59 U·mg-1、0.59 U·mg-1及0.63U·mg-1,而Mn2+、Fe3+比酶活相对较高分别为1.95 U·mg-1,1.12 U·mg-1。固定化酶的温度稳定性、pH稳定性及储存稳定性均比游离酶有很大提高。DSC测定其半变性温度由游离酶的60.5℃分别提升至138.49℃、167.02℃、167.02℃、160.99℃及172.85℃。（3）COD底物谱较为广泛,选取了胆固醇、豆甾醇、孕烯醇酮、麦角固醇、β-谷甾醇及脱氢表雄酮五种底物研究游离酶和固定化酶的底物特异性。发现COD对胆固醇、对孕烯醇酮、脱氢表雄酮、麦角固醇均有转化能力,并且产物单一。对转化的产物进行分离、纯化,通过LC-MS、NMR、FTIR等技术方法分析,确定产物分子量和结构式。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 胆固醇氧化酶的概述
  •     1.1.1 胆固醇氧化酶的简介
  •     1.1.2 胆固醇氧化酶的催化机理
  •     1.1.3 胆固醇氧化酶的应用价值
  •     1.1.4 胆固醇氧化酶的底物特异性
  •   1.2 酶的固定化简介
  •     1.2.1 固定化酶的应用
  •     1.2.2 传统固定化酶方法
  •     1.2.3 有机-无机杂化纳米花固定化酶
  •     1.2.4 有机无机杂化纳米花的形成过程
  •   1.3 立题依据及主要研究内容
  •     1.3.1 立题依据
  •     1.3.2 主要研究内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株与质粒
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要仪器
  •     2.1.4 培养基及常用溶液配方
  • TM的构建'>  2.2 重组质粒pRhamTM的构建
  •     2.2.1 cod基因片段的聚合酶链式反应（PCR）
  •     2.2.3 PCR产物与T载体连接
  •     2.2.4 目的基因与载体pRham TM连接
  • TM-cod的构建与表达'>  2.3 重组菌E.coli BL21/pRhamTM-cod的构建与表达
  •     2.3.1 化学法制备JM109/BL21 感受态细胞
  •     2.3.2 热激法法转化
  • TM-cod的摇瓶发酵'>    2.3.3 重组菌E.coli BL21/pRhamTM-cod的摇瓶发酵
  •   2.4 胆固醇氧化酶的纯化与酶学性质研究
  •     2.4.1 胆固醇氧化酶的纯化
  •     2.4.2 蛋白质浓度的测定
  •     2.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析胆固醇氧化酶
  •     2.4.4 胆固醇氧化酶的酶活测定
  •     2.4.5 胆固醇氧化酶酶学性质的测定
  •   2.5 固定化酶的制备及性质研究方法
  •     2.5.1 有机无机杂化纳米花形成的条件优化
  •     2.5.2 固定化酶酶学性质分析
  •     2.5.3 固定化酶表面特征的研究
  •   2.6 COD氧化产物的分析、提取与鉴定实验方法
  •     2.6.1 COD不同底物动力学参数的测定
  •     2.6.2 酶的底物特异性分析
  •     2.6.3 产物提取与纯化
  •     2.6.4 产物的分析
  • 第三章 结果与讨论
  •   3.1 胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究
  •     3.1.1 重组表达载体的构建及验证
  •     3.1.2 胆固醇氧化酶的表达及纯化
  •     3.1.3 胆固醇氧化酶的酶学性质研究
  •     3.1.4 鼠李糖诱导E.coli产COD摇瓶条件优化
  •   3.2 有机无机杂化纳米花的条件优化及其特征
  •     3.2.1 COD-Cu有机无机杂化纳米花
  •     3.2.2 COD-Ca有机无机杂化纳米花
  •     3.2.3 COD-Zn有机无机杂化纳米花
  •     3.2.4 COD-Mn有机无机杂化纳米花
  •     3.2.5 COD-Fe有机无机杂化纳米花
  •   3.3 固定化酶的底物选择性及产物鉴定
  •     3.3.1 固定化酶底物选择性
  •     3.3.2 产物初步提取、纯化及结构鉴定
  •   3.4 正辛烷/水转化体系探索
  •     3.4.1 胆固醇氧化酶在正辛烷/水中的耐受性
  •     3.4.2 胆固醇氧化酶在正辛烷/水中转化胆固醇
  • 主要结论及展望
  •   主要结论
  •   展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 郝梦瑶

    导师: 辛瑜

    关键词: 胆固醇氧化酶,酶学性质,杂化纳米花固定,产物鉴定

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 江南大学

    分类号: Q78;Q55

    总页数: 65

    文件大小: 5892K

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