张凯[1]2004年在《dsRNA介导的烟草抗烟草花叶病毒（TMV）的研究》文中提出本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子—双链RNA(dsRNA)为目标，将烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因(ΔMP)以反向重复的方式与大豆内含子相连，并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游；以农杆菌介导法转化烟草，获得50株转基因烟草，并对这转基因烟草进行了抗病性研究及抗性机制初探。 根据已报道TMV ΔMP的核苷酸序列设计特异性引物，分别从质粒pTMP(+)扩增正反向ΔMP基因，并与pGEM-T Vector相连。反向ΔMP基因用PstI和BamHI切下，将所得基因片段与用同样酶切开的含内含子的pSK-In相连，获得重组质粒命名为pSK-In-ΔMP。再用SalI和BamHI将包括Intron和反向ΔMP基因在内的片段切下，定向插入至同样酶切开的pBIN438上，获得重组质粒pBIN-In-ΔMP。正向ΔMP基因片段用SalI切下，插入被SalI切开且已去磷酸化的pBIN-In-ΔMP上，鉴定筛选得到含有ΔMP基因的反向重复植物表达载体pBIN-TMVΔMP(i／r)。 用叁亲交配法将植物表达载体pBIN-TMVΔMP(i／r)转入根癌农杆菌EHA105菌株中，经鉴定的阳性转化子用于烟草转化。烟草转化采用农杆菌介导法，将含TMVΔ MP(i／r)基因的农杆菌与烟草叶盘共培养，经卡那霉素抗性筛选获得转基因再生植株50株，所有植株的PCR检测均为阳性。对部分植株进行Southern印迹杂交，结果表明TMVΔMP(i／r)已整合到烟草基因组中。用TMV病汁液接种50株转基因烟草，症状观察和ELISA检测表明，转基因烟草植株对TMV表现出不同的抗病性反应，可将其划分为叁种抗病性类型：免疫型，植株在整个生育期无症状，并检测不到病毒；抗病型，植株前期无症状，后期有轻微症状，并能检测到少量病毒；感病型，植株在整个生育期发病较重，且能检测到大量病。50株植株中免疫型共5株，占10％，抗病型共2株，占4％，感病型共43株，占86％。转基因植株Northern印迹杂交表明，不同抗性的转基因烟草植株ΔMP基因mRNA在细胞质中的积累存在着明显差异，积累量与转基因植株的抗病性呈负相关。
律凤霞[2]2008年在《RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用》文中认为烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类主要病害,也是其它农作物的主要侵染毒源,其种类多,危害严重。生产中常以选用抗病品种作为主要防治手段,但抗病品种存在抗性单一、抗性资源狭窄等局限,不能持久、有效地控制病毒危害。RNA干涉技术为病毒病害的防治开拓了一条新机制。本试验依据RNAi机制,以TMV复制酶基因部分序列为靶序列,经反向重复连接构建到含35S超强启动子的表达载体,转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌LBA4404中,完成植物双元表达载体系统构建。经叶盘法转化获得11株转基因烟草苗。经人工接毒验证,其中7株对TMV具有免疫级抗性。初步证实了RNAi在增强植物抵抗病毒能力方面的显着效果。试验主要内容包括:1.目的基因靶序列的克隆首先对TMV 5种分离株复制酶基因序列进行BlastP序列比对,寻找保守序列,确定进行RNAi的靶序列,设计靶序列引物TMV-r1/TMV-r2。从黑龙江省烟草研究所试验场采集感染普通花叶病的烟草幼嫩叶片,提取TMV总RNA,经RT-PCR获得复制酶基因cDNA序列,应用靶序列引物TMV-r1/TMV-r2进行PCR扩增,产物连接到pMD18-T Simple Vector,转化到大肠杆菌中扩繁,获得RNAi靶序列。2.RNAi双元载体系统构建利用RNAi载体多克隆位点及目的序列边缘的相同酶切位点,采用酶切后连接方法,成功构建含TMV-r序列反向重复结构的中间载体(pUCCRNAi-TMV2)和表达载体(pC2300-35S-OCS-TMV)。经特异引物PCR扩增验证、限制性内切酶酶切验证,证实连接正确后经大肠杆菌扩繁,成功完成RNAi双元载体系统构建。3.农杆菌介导法转化烟草通过叶盘法,RNAi工程农杆菌侵染无菌烟草组培苗,通过添加卡那霉素的选择培养基,成功筛选出23株卡那抗性个体,将抗性转化植株移栽到温室培养。4.转基因烟草的分子生物学检测及抗性验证改良CTAB法提取抗性烟草DNA,分别以TMV-r1/TMV-r2引物、35S-A/35S-B引物对抗性材料进行常规PCR鉴定,确定了11株阳性转基因烟草苗。利用人工接种TMV进行转化材料的抗病性鉴定。结果表明:与转TMV复制酶全基因的阳性对照品种和非转化材料阴性对照相比,RNAi转基因个体的抗病性明显高于对照,其中7株达到免疫级水平。5.RNAi效果的荧光定量PCR分析选择表现免疫级抗性的转基因烟草苗4株,转TMV复制酶全基因苗1株,非转基因普通烟草苗3株,分别提取各自总RNA,经荧光定量PCR反应分析植株体内病毒复制酶基因mRNA拷贝数。分析结果证实:出现RNAi效果的转基因烟草中,病毒复制酶基因mRNA拷贝数明显低于其他对照品种,证实了RNAi转基因烟草对人工接种TMV的抗性源于RNAi引起的病毒基因转录产物mRNA的降解。为RNAi技术在抗病毒育种中应用提供理论依据。
赵明敏[3]2005年在《siRNA干扰TMV侵染及其分子机理的研究》文中提出RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是与内源性mRNA 编码区某段序列同源的双链RNA 导入细胞后,该mRNA 发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。被认为是植物在进化过程中发展出的一种非常古老的抵抗外来基因(病毒、转座子等)入侵的防御方式。21nt 的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为RNAi 途径的重要中介,已被广泛应用于哺乳动物和人细胞体系中基因功能和抗病毒研究,但在植物抗病毒研究中应用较少。 根癌农杆菌介导的瞬时表达系统已广泛用于非转基因植物的基因功能研究,它不仅可以快速地导入外源基因,而且使转入基因在短时间内表达。它的另一个特点是可以在一个叶片组织中同时导入多个基因。由于上述优点,这一研究技术将在功能基因组学和蛋白组学研究中发挥更大的作用。 烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是正单链RNA 病毒,是典型的模式植物病毒。研究清楚RNA 干扰在植物抗TMV 上的作用,可以带动其他病毒的相关理论问题和应用实践研究。因此,本文以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)基因组为靶位,设计合成表达小干扰RNA 的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121 中,直接转化根癌农杆菌EHA105。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了靶向TMV 复制酶基因(126kDa 蛋白)、外壳蛋白基因、和运动蛋白基因的siRNA 对TMV 侵染的干扰作用。实验得到以下结果: 1. 成功构建了在植物体内表达靶向TMV 复制酶基因(126kDa 蛋白)、外壳蛋白基因、运动蛋白基因的siRNA 重组表达载体。 2. 瞬时表达靶向TMV 复制酶基因(126kDa 蛋白)的siRNA 能干扰TMV 侵染。接种病毒14d 后,所有pBI/siRNA1519- 和pBI121 空载体处理的烟草上部叶片出现了TMV 侵染的典型花叶症状,而83%的pBI/siRNA1519 和85%的pBI/siRNA2129 处理的烟草上部叶片无任何症状产生。Northern 杂交结果也表明siRNA1519 和siRNA2129 处理的叶片TMV RNA 水平显着降低,或者未检测到RNA 积累。相反,pBI121 和 pBI/siRNA1519- 的处理有较丰富的RNA 积累。随机突变5 个碱基的处理和阴性对照一样不能够抵抗TMV 侵染。表达TMV 复制酶基因的siRNA 处理接种异源病毒(CMV)后也不能抵抗异源病毒侵染。这表明siRNA 介导的干扰作用具有序列特异性和时间、位点依赖性。 3. 瞬时表达靶向TMV 外壳蛋白基因的siRNA 能干扰TMV 侵染。含有重组表达载体
朱常香[4]2005年在《烟草病毒的检测和防治新技术研究》文中认为烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍,危害严重的一大类病害。目前世界上已报道发现的侵染烟草的病毒达47 种,我国有17 种。在田间,常表现为多种病毒混合侵染,给烟草生产造成重大损失,重病田减产20～50%,夏烟减产70%以上。对病毒病的快速检测和监控技术是病毒病防治的基础性工作,可提高病毒病防治的针对性和时效性;而植物抗病毒基因工程的发展,特别是RNA 介导的病毒抗性策略的提出,为植物病毒病的防治提供了新的途径。围绕着烟草病害的防治,本研究进行了两方面的探索。其一,分离、提纯马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯X 病毒(PVX)、烟草环斑病毒(TRSV),克隆了6 种病毒的外壳蛋白(CP)基因,并进行了序列分析,首次明确了PVY、PVX 和CMV 山东分离物在分类学上的归属地位。制备了不同病毒的抗体和酶标抗体,建立了以点免疫结合技术(DIBA)为基础的快速、多元的病毒检测体系,对山东烟草病毒病进行了初步调查,明确了主要病毒种类。其二,RNA 介导的病毒抗性策略应用于烟草病毒病防治的研究。在已获得不同抗病类型的转非翻译PVY-CP 基因烟草的基础上,研究了RNA 介导的病毒抗性遗传及外源基因的整合方式与RNA 介导的病毒抗性产生的关系,明确了RNA 介导的病毒抗性可稳定地遗传;揭示了转基因的结构对于诱发病毒抗性产生可能起关键的作用,并进而设计了发夹结构DNA 进行了验证。在此基础上,以烟草上危害最为严重的PVY、CMV和TMV 为材料,克隆并构建了包含3 种病毒部分CP 基因的发夹结构DNA 的植物表达载体,转化烟草,首次培育获得了抗3 种病毒转基因烟草。研究结果将为烟草病毒病的防治提供理论依据和技术支持,具有很好的理论和应用价值。具体研究结果如下:1. 烟草病毒的检测新技术研究—烟草病毒病快速、多元检测技术的建立及应用1.1 病毒的分离从山东感病的烟草和马铃薯上,分离纯化了马铃薯Y 病毒(PVY-SD-TA)、马铃薯X 病毒(PVX-SD1)、烟草花叶病毒(TMV-SD1)、烟草蚀纹病毒(TEV-SD1)、黄瓜花叶病毒(CMV-SD1)和烟草环斑病毒(TRSV-SD1)等6 种烟草上常见的病毒。1.2 病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析
董小卫[5]2010年在《利用木霉和RNAi技术提高烟草抗性和品质的研究》文中进行了进一步梳理病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍,危害严重的一大类病害。目前分布广、危害严重的有烟草普通花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草黄瓜花叶病毒(CMV)等。防治病毒病的措施主要有几个方面,其中培育抗病品种和施用抗病药剂最为直接有效。本文从这两个方面入手开展研究工作:一是研究木霉这种生防真菌对烟草抗病毒的作用及施用方法;二是通过RNAi技术获得抗病毒的RNAi烟。通过研究发现:木霉孢子和康宁霉素分别与烟草花叶病毒混合后,能够引起病毒颗粒断裂、凝聚,极显着降低了病毒的侵染能力,钝化防效分别为85.81%和56.11%。木霉孢子与TMV混合后接种NC89,病毒RNA含量明显低于对照,仅为对照的2.05%,病情指数较对照极显着降低,说明木霉孢子能够体外钝化TMV,并且能够抑制病毒RNA在烟株内的积累。烟草NC89接种病毒6小时后,分别施用木霉孢子悬浮液和康宁霉素,48小时后研磨汁液接种枯斑叁生烟苗,治疗防效分别为97.98%和70.26%,病情指数显着低于对照处理,病毒含量也明显降低,可见木霉及其产物对病毒病具有治疗效果,能够抑制病毒在植物体内的复制和积累,对于防治病毒的二次扩展十分重要。木霉孢子和康宁霉素均可诱导烟草产生抗性,抗性基因得到激活,防御酶活性增强,特别是在接种病毒后,防御酶活性进一步增强,这有利于对抗病毒,抑制病毒RNA复制,降低危害,MDA含量减少,最大叶长、宽极显着提高,病情指数明显降低,诱导防效分别为55.46%和57.68%。康宁霉素作为木霉产peptaibols,具有木霉孢子的部分功能,且诱导浓度较低。木霉孢子的盆栽和大田实验表明,浇灌木霉孢子后施用木霉专用肥处理烟叶外观质量好、化学成分相对协调、评吸质量优于其他处理,加之该处理烟叶病害显着降低、产量高、产值高,具有较高的推广应用价值。从GenBank下载TMV、CMV的不同株系的移动蛋白氨基酸序列,PVY polyprotein酶氨基酸序列,运用DNAMAN进行对比分析,挑选高度重合序列,确定其编码碱基序列,经人工合成构建含有酶切位点的联合基因片段CTP,经过酶切得CTP、CT、CP、TP、C、T、P等7个片段。从GenBank下载TMV、CMV的不同株系的复制酶氨基酸序列,经对比分析确定其编码碱基序列后人工合成构建含有酶切位点的联合基因片段CrTr,经过酶切得CrTr、Cr、Tr 3个片段。将得到的10个片段分别插入RNAi-pUC中,再用双酶切反向连接至干涉载体,用PstⅠ酶切载体,回收片段,脱磷后,插入表达载体pUCC2300-35-ocs中,转化感受态农杆菌,获得富集质粒的农杆菌,经酶切验证,获得含hpDNA的农杆菌。用含有hpDNA的农杆菌感染事先准备好的无菌烟草叶片碎片中,MS培养基培养,待长出根系后,即初步得到RNAi烟苗,通过接毒实验、RT-PCR等手段检测其抗病性,得到抗病毒烟苗11株;通过Southern blot挑选单拷贝、高抗性RNAi烟苗2株进行单倍体育种,快速得到的双倍纯合转基因RNAi烟苗,烟苗抗病毒特性得到保留--能够同时抵抗叁种病毒入侵,且化学成分与普通烟草基本一致。
路子峰[6]2013年在《林烟草抗烟草花叶病毒（TMV）N’基因的信号传导途径研究》文中研究说明为了确定林烟草(Nicotiana sylvestris)抗病N’基因抗烟草花叶病毒(TMV)的信号调控途径,本论文研究了PAD4、EDS1、Rar1、SGT1、NPR1、Jar6、COI1和CTR1等8个信号元件编码基因转入林烟草后,寄主的抗性表现,获得的主要结果为：1.通过Trizol法从林烟草叶片中提取总RNA,利用反转录克隆了林烟草的以上8个基因片段。2.通过酶切、连接和转化,分别将上述8个基因的反向互补序列连入用植物表达载体pCAM2300-35s-OCS构建了RNAi植物表达载体。3.分别转化入农杆菌LBA4404,利用叶盘转化法通过组织培养获得再生植株,经检测除Rar1基因外7个基因已转入林烟草。4.摩擦接种TMV-T1病毒于部分叶片上后,仅转Jar6基因植株与野生未转基因植株表现不同,即在接种叶片上出现了枯斑症状,在未接种叶片上出现花叶症状,而转其他基因的植株与野生型表现相同,即均出现枯斑,说明林烟草N’基因的信号原件编码基因Jar6基因被沉默,病毒未得到限制而从接种叶片扩展到未接种叶片上。
胡琼[7]2010年在《dsRNA介导的烟草和番茄抗病毒基因工程研究》文中研究指明本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子-dsRNA为目标,在已有的表达黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因和烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因的dsRNA的T0代转基因烟草基础上对其后续4代转基因烟草进行了抗病性及抗性机制分析。挑选转CMV部分复制酶基因的转基因烟草T0代抗病株系和感病株系的种子,对其T1代幼苗进行Southern blot检测,结果发现不同抗性株系间的拷贝数均存在很大差别,且抗病性与拷贝数不存在相关性。对T1代幼苗的抗性测定发现,T0代为免疫型的植株在T1代时其抗病性发生分化,免疫型与感病型的比率约为1：1-3：1。T1代株系中挑选四个抗病株系和一个感病株系,通过自花授粉得到T1代种子,播种后的T2代幼苗在四叶期时摩擦接种CMV,结果显示抗病株系接种CMV后不发病,而感病株系和非转基因对照的发病率是100%,说明T2代转基因烟草免疫株系的抗病性是稳定的。对T2代烟草Southern blot检测表明,T2抗病株系Rep15-1-1,Rep15-1-61等为单拷贝株系。从自花授粉得到的免疫型T3代中选择了Rep15-1-1-15、Rep15-1-1-26、Rep15-30-23-27,对其T4代的抗性测定表明,转基因烟草中检测不到病毒。选择了抗性强且遗传性稳定的Rep15-1-1-15株系,接种病毒后测定其T4代各叁株转基因烟草中的病毒RNA和siRNA,结果表明转基因烟草在接种前后均能检测到信号很微弱的CMV RNA,而非转基因烟草接种病毒后存在大量的CMV RNA;转基因烟草中均能检测到24 nts和21 nts两种类型的siRNA,且两种siRNA信号强度差别不大,而非转基因烟草在接种前后均检测不到siRNA.以上结果表明,转基因烟草的抗性是通过基因沉默降解病毒RNA而产生的。将转基因烟草T4代株系部分幼苗分别放于15℃和24℃的光照培养箱中,接种CMV后对其CMV RNA和siRNA积累进行了测定,结果显示在低温(15℃)下转基因烟草对CMV仍然具有抗性,基因沉默效率不受影响。挑选转TMV部分移动蛋白基因的转基因烟草T0代抗病株系和感病株系种子,对其T1代幼苗进行Southern blot检测,结果表明T0代不同抗性株系间的拷贝数均存在很大差别,抗病性与拷贝数不存在相关性。对T1代幼苗的抗性测定发现,T0代为免疫型的植株在T1代时其抗病性发生分化,免疫型与感病型的比率约为1：1-3：1。T2代幼苗对TMV的抗性测定表明,T2代转基因株系能抗TMV。对T2代烟草Southern blot检测表明,T2抗病株系MP16-17-14,MP16-17-29,MP53-52-7等为单拷贝株系。对其T4代的抗性测定表明,转基因烟草中检测不到病毒。选择了抗性强且遗传性稳定的MP16-17-29-9株系,接种病毒后测定其T4代各叁株转基因烟草中的TMV RNA和siRNA,结果表明转基因烟草在接种前后均能检测到信号很微弱的TMV RNA,而非转基因烟草接种病毒后存在大量的TMV RNA;转基因烟草中均能检测到24 nts和21 nts两种类型的siRNA,而非转基因烟草在接种前后均检测不到siRNA.说明了转基因烟草的抗病性主要是通过基因沉默降解病毒RNA而产生的。进一步测定表明在低温(15℃)下T4代转基因烟草对TMV依旧有很好的抗性。将含部分CMV Rep (i/r)基因的农杆菌与番茄叶盘共培养,经卡那霉素抗性筛选获得转部分CMV Rep (i/r)基因的再生植株,PCR检测发现在随机抽取的转基因番茄中均能扩增到特异性条带,点杂交也均能杂到特异信号,说明获得了转部分CMV-Rep基因的转基因番茄,对其抗病性进行了初步研究。
尹国华[8]2009年在《利用Red重组系统构建dsRNA原核表达体系抗烟草花叶病毒的研究》文中指出利用DNA重组技术,构建病毒基因发夹结构的RNA(hpRNA)(转录后均形成dsRNA)的植物表达载体,转化植物,获取抗病毒转基因植物是利用基因工程技术控制植物病毒病害的最有效策略。这一策略通常称为RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance)。RNA介导的病毒抗性的本质是一种转录后的基因沉默,也称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。与其他植物抗病毒基因工程策略相比,RNA介导的病毒抗性表型近乎免疫、抗性持久;且由于转基因植株中不存在有功能的病毒基因或蛋白,也不存在转基因mRNA的积累,因而不存在发生互补、异源包壳、协生和重组的风险,具有较高的生物安全性。尽管如此,但由于公众出于对转基因植物的生态风险和食品安全性的考虑,抗病毒转基因植物的应用仍然受到极大地限制。新近的研究表明,通过细菌原核表达dsRNA(HT115菌株,RNase III缺失体)同样能够干扰植物病毒的侵染,且与获得抗病毒转基因植物相比具有更高的安全性。RNase III广泛存在于生物体中,它在dsRNA的加工中处于中心地位、参与RNA的降解、RNA沉默(负责产生microRNA或者siRNA)和许多其他的细胞生物活性。大肠杆菌中的RNase III由rnc基因编码。本研究利用Red重组系统,敲除了大肠杆菌JM109(DE3)和HMS174(DE3)PlysS菌株的rnc基因,构建和优化了dsRNA原核表达体系。并利用HT115原核表达系统表达了TMV不同功能基因区域的dsRNA,对不同功能基因dsRNA介导的病毒抗性进行了比较。研究结果有助于将原核表达dsRNA抗病毒体系进一步发展成为一种环境友好、高效便捷的控制植物病毒的新方法,解决目前植物病毒危害日益严重的问题。具体结果如下:1、原核表达dsRNA抗病毒体系的构建(1)突变体的构建:利用Red重组系统,设计引物RNaseIII50-5和RNaseIII50-3,分别以pKD3和pKD4质粒为模板,使用KOD-plus高保真酶进行PCR,扩增带有氯霉素抗性和卡那霉素抗性基因的打靶线性DNA片段,将JM109(DE3)和HMS174(DE3)PlysS菌株rnc基因进行敲除,获得缺失RNase III的突变体M-JM109和M-HMS174。在M-JM109突变体的基础上,设计引物LacY-5和LacY-3对M-JM109突变体LacY基因进行敲除,获得LacY基因缺失体M-JM109lacY。(2)原核表达载体的构建:以TMV CP基因为目的基因,以质粒pBI121上120 bp的葡萄糖苷酸酶基因部分序列为发夹结构的“环”,设计引物TMVCPII-5和TMVCPII-3,扩增TMV CP基因,分别对扩增的PCR产物和L4440质粒进行PstI和SalI双酶切,构建LCP480载体;设计引物TMVCPI-5和TMVCPI-3、TMVCPII-5和TMVCPII-3、GUSII-5和GUSII-3,构建pGEM-CP480载体;设计引物CPI-5和CPI-3、CPII-5和CPII-3、GUSI-5和GUSI-3,构建pET-CP480载体。(3)原核表达体系的构建:将构建成功的原核表达载体,转入构建的RNase III突变体和HT115菌株中,获得原核表达体系。将构建好的原核表达体系,经IPTG诱导表达,均可提取长度约为660 bp或者480 bp的dsRNA,表明所构建的RNase III缺失体和HT115菌株具有相同特性,均可以用于dsRNA的诱导表达。对不同的原核表达体系表达的dsRNA进行荧光定量PCR分析,结果表明:M-JM109或者M-JM109lacY菌株dsRNA的表达量明显高于其他菌株,载体pGEM-CP480为适宜生产dsRNA的表达载体,因此M-JM109/pGEM-CP480或者M-JM109lacY/pGEM-CP480为最优化的原核表达体系,其相对表达量分别为6.50+ 0.69和7.28+0.56。(4)抗病性检测:对来源于不同原核表达载体表达的dsRNA进行抗病性鉴定,结果表明,来源于不同原核表达载体表达的dsRNA抗病效果基本一致,都能达到50%左右的抗病率,说明不同的表达载体生产的dsRNA对TMV的防治并没有区别。抗病植株的Northern blot分析表明,抗病植株能够产生siRNA,而野生型对照植株则检测不到siRNA,外源的dsRNA能够防治植物病毒的侵染,这种抗病性为RNA介导的抗病性。2、原核表达TMV不同功能基因dsRNA介导的抗病性比较研究(1) TMV不同功能基因dsRNA表达载体的构建:Trizol法提取TMV总RNA,设计引物TMV RP-5和TMV RP-3,TMV MP-5和TMV MP-3,TMV RNA-5和TMV RNA-3,采用RT-PCR技术分别克隆了TMV复制酶基因、运动蛋白基因和54 kDa RNA聚合酶基因的部分序列,采用PCR技术亚克隆叁个基因480 bp片段,反向重复插入pGEM-GUS载体,构建叁个不同基因的dsRNA表达载体,分别为pGEM-RP480、pGEM-MP480和pGEM-RNA480。将构建好的dsRNA表达载体转入HT115菌株中,经IPTG诱导,均可表达480 bp的dsRNA,证明所构建的dsRNA表达载体正确。(2) TMV不同功能基因dsRNA介导的抗病性比较:用原核表达的TMV复制酶基因、运动蛋白基因、54 kDa RNA聚合酶基因和衣壳蛋白基因的dsRNA处理烟草植株,进行抗病性鉴定。初步的检测结果表明,原核表达TMV不同功能基因的dsRNA均能保护植物抵抗TMV病毒的侵染,但介导的抗病性存在着差异。其中来源于运动蛋白基因的dsRNA介导的抗病效果最好,66%左右的处理植株表现为抗病;来源于衣壳蛋白基因的dsRNA介导的抗病效果较好,48%的处理植株表现为抗病;而来源于54 kDa RNA聚合酶基因和复制酶基因的dsRNA介导的抗病效果较差,表现为抗病的处理植株的比例分别为40%和34%。
余翠[9]2009年在《利用环境RNA防治烟草病毒》文中认为20世纪90年代以来,烟草病毒病在我国烟区连年发生,不仅造成烟叶产量的重大损失,而且使烟叶品质严重下降。培育抗病品种、栽培防治技术和选用抗病毒药剂及微量元素等防治烟草病毒病收敛不大。应用基因工程手段培育的转基因抗病品种存在安全问题。本研究探讨了应用环境RNAi防治烟草病毒病新手段。从分别感染烟草花叶病毒(TMV),黄瓜花叶病毒(CMV),马铃薯Y病毒(PVY)的烟叶中克隆该叁种病毒的外壳蛋白基因(⊿cp)。克隆的TMV⊿cp基因序列与Genebank中TMV⊿cp基因序列(EF122500)的相似性99%以上。叁种病毒的mRNA中通过RT-PCR扩增⊿cp基因,并与PFG19-T简单载体相连。⊿cp基因用sac I和kpn I酶切,得到的⊿cp基因片段与载体L4440相连,得到的重组质粒命名为L4440-TMV-⊿cp、L4440-CMV-⊿cp、L4440-PVY-⊿cp,重组质粒转化到RNAaseⅢ缺陷型大肠杆菌(dy330)中,用IPTG诱导dsRNA的表达。获得了能够表达dsRNA的转化子。实验所确定的最佳培养条件是37℃,220rpm/min,培养16h后,扩大培养4h, IPTG诱导4h,提取的dsRNA制剂在CD260是能达到2.046ng/ul.当烟苗长到4-5片叶时,将提取的TMV dsRNA的制剂喷洒到感染TMV的烟苗上。通过DAS-ELISA检测烟叶中的病毒含量。结果显示阳性对照含量是1.474,接毒和喷洒dsRNA提取液同时进行的含量是1.04,接毒一天后喷洒dsRNA提取液的含量是1.109,接毒叁天后喷洒dsRNA提取液含量是1.199,接毒七天后喷洒dsRNA提取液含量是1.275。喷洒了dsRNA的烟苗对感染了病毒的烟苗有不同程度的抑制作用,其烟叶中的病毒含量都比感染了病毒的阳性对照要低,病毒的含量能比阳性对照最高降低30%。而且这种实验不存在着转基因植物的潜在危险,也不像化学药物那样对环境有污染,基本是零污染制剂。是一种更为安全,高效的防治烟草病毒病的制剂。本实验的最后结果没有达到RNA沉默的最佳抑制效率-95%,这可能和实验所表达的双链RNA没有茎环结构有关。茎环结构的存在与双链RNA的稳定性有关。后续的工作中我们为了提高双链RNA的稳定性可以考虑用PCR的方法扩增出cp基因片段和间隔序列,在多克隆位点上将间隔序列插入到方向相对的两条cp基因之间,构建一个能够表达发卡结构双链RNA的重组质粒,再转化进大肠杆菌dy330中,形成一个能够表达dsRNA的工程菌。
孙兆楠[10]2012年在《高沉默效率植物病毒双链RNA的抗病毒研究》文中研究说明RNA沉默是生物（特别是真核生物）细胞抵御外来核酸（病毒、转座子或转基因）入侵以保持生物自身基因组完整性的一种防御机制。dsRNA为诱发RNA沉默的关键因子。利用DNA重组技术，构建病毒基因发夹结构的RNA（hairpin RNA）（转录后均形成dsRNA）的植物表达载体，转化植物，获取抗病毒转基因植物是利用基因工程技术控制植物病毒病害的最有效策略，这一策略通常称为RNA介导的病毒抗性（RNA-mediatedvirus resistance）。RNA介导的病毒抗性具有抗性强、抗性持久、生物安全性高等特点。尽管如此，但由于公众出于对转基因植物的生态风险和食品安全性的考虑，抗病毒转基因植物的应用仍然受到极大地限制。新近的研究表明，通过细菌原核表达dsRNA同样能够干扰植物病毒的侵染。与获得抗病毒转基因植物相比，利用细菌表达病原dsRNA沉默病毒基因的表达具有更高的生物安全，更易被接受。烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍、危害严重的一大类病害。其中分布广、危害严重的有马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）等。在田间，病毒病多混合发生，给烟草生产带来巨大损失。病害流行的年份，由病毒病造成的烟叶产量损失可达30%～50%，个别地块甚至绝产。本研究以PVY和TMV的部分功能基因的热点位置为靶序列构建hpRNA载体，利用原核表达dsRNA的策略，比较PVY不同功能基因及同一功能基因的不同区段的抗病效果，并探讨利用该策略同时抗两种病毒的基因投递方式对抗病效果的影响进行，为利用该策略抗植物病毒的研究提供了理论依据。主要研究结果和结论如下：（1）原核表达马铃薯Y病毒基因组不同功能基因的双链RNA抗病毒研究利用PCR技术扩增PVY外壳蛋白基因（Coat Protein, CP）、复制酶基因（NuclearInclusion Protein b, NIb）和辅助蛋白（Helper Component Protein, HC-Pro）基因中间区域长度为600bp的cDNA片段，构建发夹RNA（hpRNA）结构的原核表达载体，转入M-JM109lacY菌株中，经IPTG诱导，均可表达600bp的dsRNA，证明所构建的dsRNA表达载体正确。用原核表达PVY外壳蛋白基因、复制酶基因和辅助蛋白基因的dsRNA处理烟草植株，进行抗病性鉴定。检测结果显示，原核表达PVY病毒不同功能基因的dsRNA均能保护植物抵抗PVY病毒的侵染，但介导的抗病性存在着差异。其中来源于复制酶基因的dsRNA介导的抗病效果最好，72%左右的处理植株表现为抗病；来源于衣壳蛋白基因的dsRNA介导的抗病效果较好，56%的处理植株表现为抗病；而来源于蚜传辅助蛋白基因的dsRNA介导的抗病效果较差，表现为抗病植株占处理植株的比例为46%。（2）原核表达马铃薯Y病毒NIb基因的不同区段的双链RNA抗病毒研究根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系（PVYN）的复制酶（NIb）基因序列设计引物，利用PCR扩增NIb基因的5′端、中间、3′端各500bp cDNA区段，分别反向插入原核表达载体pGEM-GUS中，构建了3个hpRNA结构的原核表达载体pGEMNIb-1、pGEMNIb-2和pGEMNIb-3。经IPTG诱导，在大肠杆菌M-JM109lacY菌株中可表达产生500bp的核酸片段，经DNase和RNaseA消化处理，证实为dsRNA。提取表达的PVY NIb基因不同区段的dsRNA处理烟草，进行抗病毒试验，结果显示，表达NIb基因不同区段的dsRNA均能保护植物抵抗病毒的侵染，但区段间存在显着差异，中间区段效果最好，抗性植株的比例为66%；3′端次之，抗性植株的比例为52%；5′端区段效果最差，抗性植株的比例仅为34%。Northern blot分析结果表明：目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关，证明所获得的抗病性是RNA介导的，21～25nt的siRNAs是RNA沉默的效应分子。（3）原核表达PVY、TMV的dsRNA多抗病毒研究基于前期研究结果，选取了抗病效果较好的PVY的CP和NIb，TMV的CP和MP基因热点位置序列，构建了包含PVY、TMV的单病毒cDNA区段及2种病毒嵌合基因cDNA区段的6个hpRNA载体，IPTG诱导目的dsRNA表达，比较单病毒dsRNA的混合物和病毒嵌合基因的dsRNA的抗病效果。结果显示：两种原核表达的dRNA投递策略均能够同时介导对PVY、TMV两种病毒的抗性，但单病毒dsRNA的混合物较两种病毒嵌合基因的dsRNA具有更好地保护效果，最佳组合抗病效果为42.09%。siRNANorthern blot结果表明，该抗性是由RNA介导的。
参考文献：
[1]. dsRNA介导的烟草抗烟草花叶病毒（TMV）的研究[D]. 张凯. 浙江大学. 2004
[2]. RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用[D]. 律凤霞. 黑龙江八一农垦大学. 2008
[3]. siRNA干扰TMV侵染及其分子机理的研究[D]. 赵明敏. 西北农林科技大学. 2005
[4]. 烟草病毒的检测和防治新技术研究[D]. 朱常香. 山东农业大学. 2005
[5]. 利用木霉和RNAi技术提高烟草抗性和品质的研究[D]. 董小卫. 山东师范大学. 2010
[6]. 林烟草抗烟草花叶病毒（TMV）N’基因的信号传导途径研究[D]. 路子峰. 兰州大学. 2013
[7]. dsRNA介导的烟草和番茄抗病毒基因工程研究[D]. 胡琼. 浙江大学. 2010
[8]. 利用Red重组系统构建dsRNA原核表达体系抗烟草花叶病毒的研究[D]. 尹国华. 山东农业大学. 2009
[9]. 利用环境RNA防治烟草病毒[D]. 余翠. 河南农业大学. 2009
[10]. 高沉默效率植物病毒双链RNA的抗病毒研究[D]. 孙兆楠. 山东农业大学. 2012