应用CRISPR/Cas9技术定向突变烟草CYP71D16基因的研究

论文摘要

烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种重要的经济作物,在我国种植范围较广。烟草品种是影响烟叶产量和品质的主要因素。目前我国对烟草品种的选育仍停留在以表型选择为主的传统育种模式,这种经验育种方式不仅周期长而且品种改良进度缓慢,难以满足我国的经济发展需求。CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）技术之后的一种新的基因组编辑技术,它具有方便、高效、周期短以及载体结构简单等优点,这为改良品种以及提高烟叶品质提供了一条简单有效的基因突变技术手段。为快速获得定向突变材料和提高烟草育种效率,因此,本研究应用CRISPR/Cas9技术构建对烟草CYP71D16基因进行定向突变的重组载体,利用该载体遗传转化烟草K326,采用多种方法对转化株进行筛选及突变鉴定,构建并优化了烟草CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,获得了定向突变烟草CYP71D16基因的突变株。主要研究结果如下:1.CRISPR/Cas9重组载体构建:通过对烟草CYP71D16基因序列分析,在外显子上选择符合要求的靶点（分别记作SG39、SG38）,将靶点与CRISPR/Cas9载体系统连接,构建得到两个重组载体。重组载体采用U6启动子启动sgRNA,采用加强型CaMV35启动子高效表达Cas9蛋白,采用CaMV35S启动子表达潮霉素抗性基因,通过目标序列测序和农杆菌菌液PCR鉴定来验证目标序列的连接和载体的完整性,结果表明构建的载体有很好的完整性,两个重组载体均已导入农杆菌细胞中,可用于后续研究。2.重组载体的遗传转化体系优化:采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法开展遗传转化实验,对遗传转化关键环节的技术措施进行了优化。结果表明:（1）潮霉素的最佳抗性筛选浓度是20 mg/L,处于该浓度下的野生型外植体几乎不分化,而且在一段时间后全部褐化死亡。（2）在农杆菌活化培养阶段,采用H1划线方法（平行+均匀交叉）分离的单菌落数量最多,而且大部分都独立地分布在一条直线上,可排除杂菌的污染从而保证单菌落的可靠性。（3）在潮霉素筛选培养阶段,添加100 mg/L替门汀能够大幅度降低侵染后烟草叶片的污染率,高于该浓度虽可完全抑制农杆菌和其他杂菌生长,但同时也对叶片造成了伤害。（4）在脱分化及再生阶段,6-BA和NAA配比为1.0/0.1时更有利于愈伤组织诱导,配比为0.5/0.1时更有利于不定芽分化,两种配比较能同时兼顾愈伤组织诱导和不定芽分化诱导。（5）在生根阶段,采用IAA和IBA配比为0.2/0.2处理的生根量较多,达到34条,平均根长最长,达到3.23 cm,而且根较粗、叶色正常、整体长势好。3.阳性株筛选与突变效应鉴定:采用PCR方法对转化株进行潮霉素抗性基因及Cas9基因筛选鉴定,潮霉素PCR鉴定得到52株阳性株,Cas9基因鉴定得到的阳性株为46株,阳性率达到82.14%,表明有11.54%的Cas9基因在整合过程中丢失或沉默,为了不影响筛选结果的准确性,建议采用Cas9基因PCR检测对阳性株进行筛选。另外,采用一代测序和RT-qPCR方法对阳性株目的基因突变效应进行鉴定,测序结果得出39株阳性株的靶点及附近发生了不同程度的单碱基与氨基酸变异,总编辑效率达到84.78%;RT-qPCR方法鉴定结果得出共38株阳性突变株的CYP71D16基因相对表达量比野生型低,目的基因突变的植株率达到82.61%。鉴定结果说明两种方法有差异,可能的原因是一代测序方法检测的是目的基因序列是否发生改变,而RT-qPCR方法鉴定的是基因表达量的改变,基因序列发生了改变不一定就会导致目的基因在表达上会有所改变,因此在进行突变体鉴定时可两种方法配合使用,也可以只用后者进行鉴定。本研究应用CRISPR/Cas9技术定向突变烟草CYP71D16基因,获得了38份突变材料,目的基因突变的植株率达到82.61%。说明CRISPR/Cas9基因编辑技术的突变效率高,本研究构建的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系达到定向突变烟草基因的实用要求。

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摘要

Abstract

1 前言

1.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因组编辑技术研究现状

1.1.1 CRISPR/Cas9 系统的发展史

1.1.2 CRISPR/Cas9 系统的基本结构与作用原理

1.1.3 CRISPR/Cas9 技术与ZFNs、TALENs技术的比较

1.1.4 CRISPR/Cas9 技术在作物育种上的发展利用

1.2 植物遗传转化的方法与特点

1.2.1 根癌农杆菌介导法

1.2.2 DNA直接导入法

1.3 转化植株的筛选与鉴定

1.3.1 PCR

1.3.2 RT-qPCR

1.3.3 PCR/RE

1.3.4 HRM

1.3.5 一代测序

1.4 烟草CYP71D16 基因的研究现状

1.5 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料及仪器设备

2.1.1 植物材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 引物序列

2.1.4 菌株与载体

2.1.5 主要培养基

2.1.6 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 CRISPR/Cas9 重组载体的构建

2.2.2 重组载体遗传转化体系的优化

2.2.3 转化植株的筛选鉴定

2.2.4 目的基因的突变效应检测

2.3 技术路线

3 结果与分析

3.1 CRISPR/Cas9 重组载体的构建及验证

3.1.1 靶点序列设计与载体获得

3.1.2 重组质粒构建验证与分析

3.2 CRISPR/Cas9 重组载体遗传转化体系的优化

3.2.1 外植体对不同潮霉素浓度的抗性筛选

3.2.2 不同平板划线方法对农杆菌单菌落分离的影响

3.2.3 替门汀对农杆菌及其他杂菌生长的影响

3.2.4 6-BA和 NAA对愈伤组织及不定芽诱导的影响

3.2.5 IAA和 IBA对转化苗生根的影响

3.3 CRISPR/Cas9 重组载体遗传转化植株的筛选与鉴定

3.3.1 阳性株的筛选

3.3.2 靶点序列测序鉴定突变效应

3.3.3 RT-qPCR鉴定突变效应

4 小结与讨论

4.1 作用于CYP71D16 基因的CRISPR/Cas9 载体构建

4.2 遗传转化体系的建立与优化

4.3 转化植株筛选及突变体鉴定方法的选择

5 结论与展望

参考文献

致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 田茂竹

导师: 刘仁祥

关键词: 烟草,遗传转化,鉴定

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 贵州大学

分类号: S572;Q943.2

总页数: 73

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