袁晓亮[1]2003年在《氧化修饰与抗氧化剂在动脉粥样硬化形成中作用机制的实验研究》文中认为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一类严重威胁人类生命健康的常见病和多发病。目前，预防和治疗AS缺乏根治性的方法，临床以降低血脂，调节脂代谢为主要手段，效果并不理想。大量实验证明，氧化修饰在AS发病机制中占有重要地位，越来越受到人们的重视。探讨氧化修饰在AS形成过程中的作用机制，同时研究抗氧化保护对AS的影响，对于AS的防治具有重要作用。 本研究根据氧化修饰在AS形成过程中的作用以及自由基反应链式和多态性的特点，按照自由基理论研究进展，采用自由剂清除剂—“安体欣”为治疗药物，建立AS家兔模型，给予动物喂饲在普通饲料加入10％蛋黄粉、1％胆固醇、5％猪油组成的高脂饲料(HL)，并加入不同剂量氧化剂(过氧化氢hydrogenperoxide，HP)建立AS动物模型，探讨氧化损伤以及复合抗氧化剂(AO)对动物模型的影响机制。实验分组如下： A、为阴性对照组(CON)，自由摄食普通饲料； B、为HL+AO组，喂饲高脂饲料，同时灌胃AO(0.06g．kg~(-1))； C、为HL组，单纯喂饲饲高脂饲料； D、为HL+低剂量氧化剂组，喂饲含有HP(0.73ml．kg~(-1))的高脂饲料： E、为HL+中剂量氧化剂组，喂饲含有HP(1.47ml．kg~(-1))的高脂饲料； F、为HL+高剂量氧化剂组，喂饲含有HP(2.93ml．kg~(-1))的高脂饲料； G、为HL+中剂量HP+AO组，喂饲含有HP(1.47ml．kg~(-1))的高脂饲
刘善云[2]2008年在《耐力训练影响ApoE~（-/-）小鼠炎症因子表达与AS防治机制研究》文中进行了进一步梳理动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是严重危害人类健康的疾病之一。当前,以AS为病理基础的心、脑血管疾病的发病率和死亡率均居各种疾病前列。研究AS的发病机理及其防治手段成为医学领域研究的热点和重要课题。一般认为,AS的发生发展是多种遗传因素和环境因素相互作用的结果。近年研究显示,AS是血管内皮损伤后的一种高度特异性的慢性炎症反应过程,炎症是AS中一个关键的致病机制。因此,抗炎治疗有望成为AS新的防治手段。运动锻炼作为AS综合防治中的重要干预手段之一是运动医学领域极为关注的课题。在运动医学领域虽早已开展相关研究工作,但多为整体、器官水平的研究。已有研究证实,有氧运动对AS形成具有明显的干预效果,但对其机制的研究尚显不足。目前尚未见到有关运动干预AS炎症反应机制方面的研究报道,并缺乏运动对已经形成的AS的治疗或改善作用的相关研究。运动锻炼抗阻AS病理进程的机制尚缺乏足够的实验与理论依据。目的:本研究以参与AS炎症反应调控的核转录因子-κB(NF-κB)及其诱导的炎症因子表达在AS中的作用为主线,深入探讨运动对AS的干预效果。在复制实验动物AS模型的基础上,采用病理学、生物化学及分子生物学等研究方法及相关技术,从运动影响AS炎症反应角度探讨运动对AS的干预作用,并从分子水平进一步阐明运动防治AS的可能机制。方法:选取8周龄ApoE基因敲除(ApoE~(-/-))小鼠48只,饲以“西方类型”膳食,随机分为AS预防组(14周实验组)和AS治疗组(26周实验组),即:14周AS模型组(H组)、14周跑台运动组(HE组),26周AS模型组(HH组)、14周造模+12周跑台运动组(H+E组);并选取8周龄同品系C_(57)BL/6J小鼠24只作为对照组,随机分为14周对照组(N_1组)和26周对照组(N_2组)。每组12只,雄性。令HE组和H+E组小鼠在动物活动跑台上进行耐力性运动(13m/min,60min/次,每周5次),分别用于观察耐力运动对AS形成的预防作用和运动对已经形成的AS的治疗或改善效果。在实验过程中每周测量小鼠体重的变化,并观察其生长状况、饮食量、精神状况及对运动负荷的适应能力等。实验周期结束后,采取眼球摘除法从小鼠眼眶静脉丛采集血液标本,用于测定血脂和氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)水平;并取心脏及主动脉近心端1-1.5cm组织制备主动脉根部冰冻切片,从主动脉瓣尖出现起作连续横切,切片厚度7μm。每间隔10张取1张,分别用于油红0染色、HE染色、原位杂交及免疫组化分析等。采用常规生化检测法测定血脂水平;采用双抗夹心酶联免疫ELISA法测定OX-LDL水平;主动脉根部冰冻切片行油红0染色,通过计算机图像分析系统评估AS斑块面积;主动脉切片行HE染色光镜下分析主动脉组织病理变化;主动脉切片行原位杂交法测定主动脉NF-κBmRNA表达;主动脉切片行免疫组化法测定主动脉NF-κBp65及相关炎症因子的表达等。通过对主动脉AS斑块面积进行定量评估和组织病理分析,并结合OX-LDL对NF-κB的激活及其诱导的炎症因子表达和相关分析,从分子水平上深入研究与阐明运动防治AS的可能机制。结果:1、ApoE~(-/-)小鼠生长状况及体重的变化实验过程中各组小鼠体重均呈稳步增长,实验动物生长发育正常,运动组小鼠对运动负荷适应良好。2、耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠AS形成及主动脉组织病理形态学的影响①耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠主动脉AS形成的干预效果与正常对照组(C_(57)BL/6J)小鼠比较,22周龄ApoE~(-/-)小鼠(H组)主动脉根部血管内膜上可见到大量被染成鲜红色的AS斑块,斑块面积占血管腔总面积的41.79±6.93%;耐力运动组(HE组)主动脉根部亦可见AS斑块,但与H组比较,其斑块面积显着减小,斑块面积占血管腔面积比例为25.07±7.94%(P＜0.01)。主动脉切片经HE染色光学显微镜观察病理特征显示,H组小鼠主动脉可见许多脂纹-纤维斑块期病变和少量粥样斑块病变,结果提示本实验中ApoE~(-/-)小鼠AS模型建立已经成功;与H组比较,HE组小鼠主动脉AS病变程度明显减轻,AS病变多限于脂纹期,仅局部形成少量纤维斑块。表明14周耐力运动具有预防或减少AS形成的作用。②耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠已形成的AS的干预效果与H组比较,HH组小鼠主动脉AS病变进一步加重,AS斑块面积与血管腔总面积比例达58.80±6.40%,且多为粥样斑块病变或出现易损斑块特征。对已形成AS的H+E组小鼠实施12周耐力运动干预后发现,其主动脉AS斑块面积占血管腔总面积比例为50.35±3.52%,与H组比较有显着性差异(P＜0.05),但较HH组AS斑块面积显着减少(P＜0.05),且病变程度相对减轻。表明12周耐力运动对ApoE~(-/-)小鼠已经形成的AS具有减缓或控制其病变进程的作用。3、耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠血脂水平的影响与正常对照组比较,ApoE~(-/-)小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均显着升高,HDL-C显着降低,表明ApoE~(-/-)小鼠出现典型的高胆固醇血症和血脂紊乱;而耐力性运动对ApoE~(-/-)小鼠血脂及脂蛋白成分均未产生明显的影响。4、耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠血清OX-LDL水平的影响与正常对照组比较,ApoE~(-/-)小鼠OX-LDL水平明显升高;与H组比较,HE组OX-LDL水平显着降低(P＜0.05);与HH组比较,H+E组OX-LDL水平显着降低(P＜0.05)。提示ApoE~(-/-)小鼠体内存在异常氧化状态和较高的OX-LDL水平,而耐力性运动能有效地减少OX-LDL的生成。5、耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠主动脉NF-κBmRNA及其蛋白表达的影响与正常对照组比较,ApoE~(-/-)小鼠主动脉NF-κBmRNA及NF-κBp65均呈高度表达。与H组比较,HE组NF-κBmRNA、NF-κBp65表达强度和阳性细胞表达率均显着降低(P＜0.01);与HH组比较,H+E组主动脉NF-κBmRNA、NF-κBp65表达强度和阳性细胞表达率均显着降低(P＜0.05)。提示ApoE~(-/-)小鼠血管壁中NF-κBmRNA及NF-κBp65高度表达,而耐力运动可有效地抑制或降低其表达量。6、耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠主动脉炎症因子表达的影响与正常对照组比较,各组ApoE~(-/-)小鼠主动脉炎症因子TNF-α、ICAM-1和MMP-9均呈高度表达,提示AS病变与炎症反应有密切关系;而耐力运动能有效地减少ApoE~(-/-)小鼠主动脉相关炎症因子的表达。7、ApoE~(-/-)小鼠主动脉AS斑块面积与NF-κBp65、OX-LDL的相关关系相关分析表明,ApoE~(-/-)小鼠主动脉AS斑块面积与NF-κBp65、OX-LDL之间呈显着正相关。结论:1、14周耐力训练能有效地预防ApoE~(-/-)小鼠AS的形成。2、12周耐力训练对ApoE~(-/-)小鼠已经形成的AS起到了减缓其病变进展的作用。3、耐力训练防治AS的效果可能是通过下列机制发挥抗AS作用:耐力训练通过降低ApoE~(-/-)小鼠OX-LDL水平和NF-κBmRNA的表达,进而下调参与AS形成的相关炎症因子ICAM-1和MMP-9的表达,降低了AS病灶中的炎症反应,从而起到抑制或减缓AS发展的作用,可能是运动防治AS的重要机制之一。
王燕[3]2009年在《oxLDL与动脉粥样硬化的相关性研究-oxLDL与动脉粥样硬化关系的临床观察研究—体外阻断oxLDL对内皮细胞损伤的实验研究》文中研究说明以动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)为主要病理改变的心脑血管疾病严重威胁着人类。动脉粥样硬化发病机制复杂,目前得到广泛认可的为损伤-反应学说和由此发展的炎症理论。免疫机制在AS的形成、发展中起重要作用,多种参与免疫反应的细胞和分子相互协同、相互影响,促进了AS的发生发展。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)在AS中的作用正日益受到重视。OxLDL是低密度脂蛋白(LDL)在体内发生氧化修饰而形成的,此反应与体内的氧化应激有关。LDL氧化修饰后,理化性质和生物学特性均发生了一系列改变,可以通过细胞毒性作用、化学趋化作用、影响血管平滑肌增殖、加速泡沫细胞形成、影响纤溶和凝血等机制促进AS的发生和进展。另外,oxLDL具有免疫原性,刺激机体免疫系统产生特异性自身抗体(oxLDL-Ab)。氧化低密度脂蛋白及其抗体均参与了动脉粥样硬化的发生发展,在疾病的进程中发挥着重要的作用,对其研究很多,但是,目前研究结论却有很大的差异,有些甚至十分矛盾。有些病例对照研究表明病人体内oxLDL和oxLDL-Ab水平显着高于正常对照,oxLDL的水平可提供重要的诊断信息,oxLDL-Ab可作为动脉粥样硬化的独立危险因素;然而也有研究报道oxLDL-Ab水平与动脉粥样硬化程度呈现负相关,oxLDL-Ab可发挥保护作用。这些相互矛盾的结果反映了动脉粥样硬化中免疫机制的复杂性。动脉粥样硬化是多阶段慢性演变的过程,包括血管内皮损伤、单核细胞和淋巴细胞粘附和侵入内皮转变为泡沫细胞、脂纹形成,平滑肌细胞迁移至内膜增生形成纤维斑块,之后逐步演变为粥样斑块,斑块不稳定或破裂导致临床上急性事件的发生等复杂过程。动脉粥样硬化斑块主要侵犯弹性型的大动脉和中等管径的动脉,其中颈动脉是脑供血的主要通路,此部位的粥样硬化斑块越来越多地被发现。颈动脉粥样硬化斑块导致狭窄从而引起血流动力学改变的并不多,相对来讲,粥样斑块的性质更为重要。病变若处于稳定期则影响不大,而不稳定时斑块溃破可直接导致脑卒中的发生。脑卒中具有高的病死率和致残率,对人体危险性很大。对不稳定斑块行外科手术切除为该病的二级预防提供了新途径。因此,对斑块稳定性的分析和研究非常重要。本文对确诊有颈动脉粥样硬化病变但病变处于稳定期的高危险性人群进行流行病学研究,分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危险因素与颈动脉粥样硬化的关联,可为AS的防治提供基础,具有重要的现实意义。OxLDL可通过多种作用途径促进动脉粥样硬化的发生发展,其中诱导血管内皮细胞凋亡为其初始作用之一。细胞凋亡即程序性细胞死亡,是生物体内广泛存在的一种为维护体内稳态,细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后由特定基因控制的、以细胞DNA有控降解为特征的、无明显细胞溶解现象的细胞自主有序性死亡。细胞凋亡在AS的发生发展中发挥着重要的作用,尤其是内皮细胞的凋亡机制参与了动脉粥样硬化发生发展的各过程,可影响内皮细胞正常功能、促进血栓形成、参与血管重构、影响动脉形态与结构,具有重要意义。大蒜及从中提取的大蒜油具有广泛的药理作用,包括抗病原微生物、抗肿瘤、增强免疫系统功能、抗氧化、抗衰老、保护肝脏、防治糖尿病等,尤其可通过多种机制对心脑血管系统疾病产生显着的预防和治疗作用,其中,保护内皮细胞为其机制之一。人体必需微量元素硒(Se)也对心血管系统具有保护作用,其水平与心血管疾病的发病率呈明显负相关,还具有抗氧化、解毒等其他多方面生物学效应。大蒜和硒联合应用是否能发挥协同保护作用是该领域一直关注的问题。但是由于大蒜油的PH在5.3到5.8之间,而亚硒酸钠的PH为11.0左右,两者直接混合联用会破坏大蒜素;而且亚硒酸钠中的硒为无机硒,其在体内的吸收转换率难以确定。采用微胶囊技术可将大蒜油和硒联合,然而这种剂型很难用实验研究确定其效能。富硒大蒜的培育开发为将二者联合应用、评价其可能的保健或治疗作用提供了契机。已有研究证明,富硒大蒜可保护心脑血管系统,但具体机制目前尚未阐明,尤其对oxLDL所致的内皮细胞损伤的作用尚未见研究报道。因此,本文以山东苍山培育的富硒大蒜为原料,从中提取大蒜油,测定其中大蒜素和硒的含量;并用ox-LDL作用于体外培养脐静脉内皮细胞(ECV304细胞株)诱导其凋亡,进而用提取的富硒大蒜油进行干预,观察其对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的阻断作用,并对作用机理进行初步探讨。研究目的本文以颈动脉内膜增厚和/或有斑块形成、但未发生急性临床事件者为病例,以颈动脉正常者为对照,运用单纯病例研究和病例对照研究,分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危险因素与颈动脉粥样硬化的关联,并分析oxLDL与自身抗体的关系,以了解与AS有关联的免疫机制,为AS的防治研究提供科学依据。用oxLDL作用于体外培养血管内皮细胞株ECV304,诱导其凋亡,进而用提取的富硒大蒜油进行干预,通过测定细胞存活率、细胞活性、细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白的表达及其mRNA水平的变化以研究oxLDL对血管内皮细胞的损伤作用,探讨富硒大蒜油对此损伤的影响及可能机制,确定其是否有保护作用及所需剂量,为进一步研究其预防AS的功能提供基础。研究内容和方法一.oxLDL与动脉粥样硬化关系的临床观察研究1.研究对象的选择(1)单纯病例研究:选取2005年2月至2005年12月到山东省中医药大学附属医院特检科进行颈动脉超声检查,年龄40岁以上,了解后自愿参加本课题且两年后随访未发生急性临床事件的患者。入选标准为内膜增厚(IMT≥1.0mm)和/或颈动脉处至少一处可测量的斑块。排除严重肝脏或肾脏、甲状腺疾病、恶性肿瘤患者,以及两周内服用维生素B6、B12或叶酸、抗氧化剂者。(2)病例对照研究:病例来源同单纯病例研究;对照为同期参加检查的确诊无动脉粥样硬化病变者。所有研究对象均签署了知情同意书。2.颈动脉超声检查颈动脉超声检查由专人通过ESAOTE超声诊断仪操作。测量颈总动脉处的内膜中层厚度(IMT)。IMT≥1.3mm或比周围区域增厚50%以上即为斑块,并计算斑块的体积。3.调查测量内容及方法使用统一的调查问卷询问研究对象的姓名、年龄、性别、职业、月平均收入、文化程度、家庭住址、联系方式等一般情况以及吸烟情况、饮酒情况、锻炼身体情况、家族史等内容;测量身高、体重、血压等一般指标。4.实验检测内容和方法受试对象于清晨采集空腹肘静脉血约5ml,根据要求分离血清及血浆。2h内应用葡萄糖氧化酶法测量空腹血糖值;采用酶比色法测定甘油叁脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL);采用放射免疫法(IRMA)测定血管紧张素Ⅱ(AngⅡ);采用乳胶增强投射比浊法测定脂蛋白(a)(Lpa);采用固相酶联免疫吸附(ELISA)方法测定幽门螺杆菌IgG(Hp)、肺炎衣原体IgG(Cp)、巨细胞病毒IgG(CMV)抗体;采用ELISA方法测定oxLDL及oxLDL-Ab。5.统计方法统计分析所用软件为SPSS11.5和SAS9.0软件包。应用多元线性逐步回归分析和logistic回归分析探讨循环oxLDL和oxLDL-Ab的影响因素;应用广义线性回归分析IMT和斑块体积的影响因素;采用非条件logistic回归和判别分析进行病例对照研究中的多因素分析。二.体外阻断oxLDL对内皮细胞损伤的实验研究采用乙醇提取加橄榄油萃取法和水蒸气蒸馏加橄榄油萃取法分别从一般大蒜和富硒大蒜中提取大蒜油,同时制备大蒜匀浆,采用高效液相色谱法测定处理后不同组分大蒜素含量,氢化物发生原子荧光法测定其中的硒含量。采用铜离子诱导法将LDL体外氧化修饰成oxLDL,苏丹黑预染的琼脂糖凝胶电泳及TBARS测定法鉴定LDL氧化程度。应用水蒸气蒸馏加橄榄油萃取法所得大蒜油进行细胞培养实验。ECV304细胞常规培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养液中,其中青霉素、链霉素浓度均为100U/mL,培养条件为37℃、5%CO_2、饱和湿度。将处于对数生长期的ECV304细胞用0.25%胰蛋白酶消化,用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度为2×10~4/ml,取适量细胞悬液接种于培养板或培养瓶。台盼蓝染色法检测细胞存活率;甲基四唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,求得10%的细胞生长受抑制所需要的一般大蒜油、富硒大蒜油及无机硒标准溶液浓度(IC_(10)),选取低于IC_(10)的浓度进行实验。实验分为8组:对照组、oxLDL组、一般大蒜油组、oxLDL+一般大蒜油组、富硒大蒜油组、oxLDL+富硒大蒜油组、硒标准溶液组、oxLDL+硒标准溶液组。所加一般大蒜油终浓度为5μl/L,富硒大蒜油终浓度为2.5μl/L,硒标准溶液终浓度为0.02μg/ml,oxLDL终浓度为22μg/ml。其中oxLDL+大蒜油组为先加入大蒜油作用24h后再加oxLDL作用。MTT法检测细胞活性,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色法测定细胞凋亡率。对照组、oxLDL组、富硒大蒜油组、oxLDL+富硒大蒜油组瑞氏-吉姆萨染色光镜下观察细胞形态学改变,Western blot测定细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表达,反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA水平的变化。研究结果一.oxLDL与动脉粥样硬化关系的临床观察研究1.单纯病例研究的结果(1)循环中oxLDL和oxLDL-Ab的相关性Spearman等级相关分析显示,循环中oxLDL和oxLDL-Ab之间没有线性关系。(2)循环oxLDL与动脉粥样硬化的关系Spearman等级相关分析可见循环oxLDL与IMT弱相关(r_s=0.195,P=0.084),而与斑块体积无关(r_s=0.093,P=0.410)。而多因素分析显示oxLDL与IMT及斑块体积均无关。(3)循环oxLDL-Ab与动脉粥样硬化的关系Spearman等级相关分析可见循环oxLDL-Ab与IMT无关(r_s=0.005,P=0.962),与斑块体积也无关(r_s=0.043,P=0.703)。多因素分析也显示oxLDL-Ab与IMT及斑块体积均无关。(4)动脉粥样硬化的影响因素在广义线性回归模型中,只有年龄和高血压是IMT及斑块体积的独立影响因素。2.病例对照研究的结果(1)循环oxLDL与动脉粥样硬化的关系病例对照研究显示,oxLDL为AS发生的危险因素。(2)循环oxLDL-Ab与动脉粥样硬化的关系病例对照研究显示,oxLDL-Ab在AS的发生中起保护作用。(3)动脉粥样硬化的影响因素病例对照研究中,控制各种混杂因素后,年龄、BMI、TC、TG、oxLDL为动脉粥样硬化发生的危险因素,其中TG的贡献最大(OR=7.399,95%CI:1.498-36.554);而oxLDL-Ab有保护作用(OR=0.793,95%CI:0.714-0.880)。(4)颈动脉粥样硬化的预测采用逐步判别分析发现,oxLDL及oxDL-Ab对患有颈动脉AS病变均具有预测性。二.体外阻断oxLDL对内皮细胞损伤的实验研究1.大蒜素含量测定结果一般大蒜及富硒大蒜提取大蒜油后测定各部分大蒜素的含量,结果显示,橄榄油成功地将大蒜素萃取了出来,所得大蒜油中大蒜素含量较高。2.硒含量测定结果一般大蒜及富硒大蒜提取大蒜油后测定各部分硒的含量,结果显示,富硒大蒜中硒浓度高达一般大蒜的2609倍,且硒主要存在于水溶液中。应用水蒸气蒸馏加橄榄油萃取的方法提取大蒜油时,富硒大蒜油中硒的含量为一般大蒜油的142倍;硒的分布为剩余水溶液中最高,可占到全部量的71.42%。应用乙醇提取加橄榄油萃取法提取大蒜油时,富硒大蒜油中硒的含量为一般大蒜油的181倍;硒主要分布在萃取后的乳相中,达总量的48.76%。3.一般大蒜油、富硒大蒜油及无机硒对细胞生长的影响对数生长期的ECV304细胞在含有一般大蒜油或富硒大蒜油(终浓度均为2.5-40μl/L)或硒标准溶液(终浓度0.04-0.64μg/ml)的培养液中孵育,分别在24h、48h和72h收集细胞,计数200个细胞,结果示细胞存活率＞90%,此浓度范围的一般大蒜油、富硒大蒜油及硒标准溶液对细胞无明显的毒副作用。4.一般大蒜油、富硒大蒜油、无机硒及oxLDL对细胞活性的影响对数生长期的ECV304细胞在终浓度为5-320μl/L一般大蒜油或富硒大蒜油或0.04-2.56μg/ml硒标准溶液或10-160μg/ml oxLDL的培养液中孵育24-72h,经MTT检测细胞活性,结果显示一般大蒜油、富硒大蒜油、硒标准溶液及oxLDL对ECV304细胞活性的抑制均随时间的延长而增加,而且随着一般大蒜油、富硒大蒜油、硒标准溶液或oxLDL浓度的增加而增加。5μl/L一般大蒜油、2.5μl/L富硒大蒜油或0.02μg/ml硒标准溶液对正常细胞的活性几乎无抑制作用(抑制率分别为3.46%、4.86%、4.54%),与对照组比较差异均没有显着性(P均＞0.05);22μg/mloxLDL可明显抑制细胞的活性(抑制率为24.60%),与对照组比较差异有显着性(P＜0.05);用一般大蒜油、富硒大蒜油或硒标准溶液进行干预后,oxLDL所致的细胞活性抑制均明显降低(抑制率分别降低到7.23%、3.70%、5.68%),与oxLDL组比较差异均有显着性(P均＜0.05)。5.富硒大蒜油及oxLDL对细胞形态的影响经瑞氏-吉姆萨染色后,油镜下观察发现,对照组ECV304细胞核大而圆,结构完整,细胞形态规则。OxLDL使细胞变得不规则,并出现凋亡改变。先加入富硒大蒜油作用24h后再加入oxLDL,细胞形态学基本正常,仅有少数细胞出现凋亡改变。6.一般大蒜油、富硒大蒜油、无机硒及oxLDL对细胞凋亡的影响应用Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡率的变化,结果oxLDL组凋亡率相对于对照组显着增大,差异有统计学意义(P＜0.05);在实验所用剂量下,一般大蒜油、富硒大蒜油及硒标准溶液组细胞凋亡率与对照组相比均没有显着性差异(P均＞0.05);但一般大蒜油、富硒大蒜油或硒标准溶液均可抑制oxLDL所致的细胞凋亡率的增加,细胞凋亡率与oxLDL组相比均有显着性差异(P均＜0.05)。7.oxLDL及富硒大蒜油对细胞Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达的影响Western blot结果显示,与对照组相比,oxLDL组细胞Bax和caspase-3蛋白表达量均明显升高,而Bcl-2蛋白表达量显着降低。先加入富硒大蒜油作用24h后再加入oxLDL,Bax和caspase-3蛋白表达量均较oxLDL组显着降低,而Bcl-2蛋白表达量显着升高,均接近于对照组。8.oxLDL及富硒大蒜油对ECV304细胞Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA水平的影响RT-PCR结果显示,oxLDL能显着降低ECV304细胞Bcl-2 mRNA水平(16.1%,P＜0.05),升高Bax mRNA水平(17.5%,P＜0.05)和caspase-3 mRNA水平(61.0%,P＜0.05),同时使Bcl-2/Bax比值降低。先加入富硒大蒜油作用24h后再加入oxLDL,Bcl-2 mRNA水平升高了11.1%,与oxLDL组相比有显着性差异(P＜0.05);BaxmRNA水平降低了2.9%,虽然与oxLDL组相比差异不显着(P＞0.05),但其水平与对照组已无差异(P＞0.05);caspase-3 mRNA水平降低了25.7%,与oxLDL组相比有显着性差异(P＜0.05),但仍显着高于对照组(P＜0.05);Bcl-2/Bax比值升高,相对接近正常水平。结论1.对于颈动脉粥样硬化病变稳定期的病人,体内血液循环中的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)与其自身抗体(oxLDL-Ab)水平无关。2.血液循环中的oxLDL在颈动脉粥样硬化病人体内显着高于对照,但在稳定期病例中与病变的程度无关。3.血液循环中的oxLDL-Ab在颈动脉粥样硬化病人体内显着低于对照,但在稳定期病例中与病变的程度无关。4.oxLDL及oxLDL-Ab可预测AS的危险性,可作为高危人群是否需要进行AS斑块检查的初筛指标。5.oxLDL具有明显的细胞毒作用,可以诱导血管内皮细胞凋亡,此作用可能是通过影响Bcl-2、Bax和caspase-3的基因转录水平从而改变其蛋白表达量而引起的,这是oxLDL致动脉粥样硬化的初始作用环节之一。6.富硒大蒜油在较低浓度范围内即能够抑制oxLDL的细胞毒性作用,通过作用于基因转录水平而逆转Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白表达,从而抑制了oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡,对内皮细胞起到保护作用,参与抑制AS的发生。
张国侠[4]2010年在《莱菔子水溶性生物碱对ApoE~（-/-）小鼠血管内皮保护机制的实验研究》文中研究表明动脉粥样硬化是导致心、脑血管疾病的主要发生和死亡原因。动脉粥样硬化的特点是动脉粥样硬化的存在,导致动脉的血管腔内膜狭窄。动脉粥样硬化的危险因素包括低密度脂蛋白胆固醇水平升高,高密度脂蛋白胆固醇水平降低,甘油叁酯水平升高,肥胖,高血压,吸烟,糖尿病,和遗传因素等。其发病涉及体内脂代谢的紊乱和血管内皮功能障碍等方面,由于其发病的分子机制较多,故在治疗上单一靶点的治疗不如多靶点的协同作用。因此,寻求有效中医药治疗途径,发挥中医药整体调节优势有着十分重要的意义。导师盖国忠教授认为本病的病机关键为本虚标实,“痰浊壅滞”是最主要的致病因素,临床应用莱菔子抗动脉粥样硬化相关性疾病,取其降气化痰、通腑泻浊之功效,疗效满意。为进一步阐明莱菔子的抗动脉粥样硬化作用及相关机制,予以客观的、科学的论证。本研究提取了莱菔子有效成分水溶性生物碱,并以ApoE-/-小鼠为研究对象,进行了以下几方面的研究:1.莱菔子水溶性生物碱对ApoE-/-小鼠血脂的影响;2.莱菔子水溶性生物碱对ApoE-/-小鼠血清一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影响;3.莱菔子水溶性生物碱对ApoE-/-小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的影响;4.莱菔子水溶性生物碱对ApoE-/-小鼠胸主动脉核因子-κB(NF-κB)含量、胸主动脉内皮一氧化氮合酶(eNOS)含量、胸主动脉内皮eNOS mRNA表达的影响。实验结果显示:1.莱菔子水溶性生物碱能够降低ApoE-/-小鼠血清甘油叁酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量,提高高密度脂蛋白胆固醇含量;2.能够调节ApoE-/-小鼠血管活性物质生成和释放,升高血清NO含量,提高血清NOS的活性;3.具有抗氧化作用,能够提高ApoE-/-小鼠血清SOD活性,降低MDA含量;4.能够抑制ApoE-/-小鼠胸主动脉NF-κB的蛋白表达;增加胸主动脉eNOS蛋白表达,增加胸主动脉eNOSmRNA表达,具有保护内皮细胞功能的作用。通过本课题的研究,从调节血脂和激活NO-NOS系统对莱菔子的作用机制进行了探讨,为临床应用莱菔子治疗动脉粥样硬化提供了客观依据。
韩京军[5]2003年在《血浆内氧化低密度脂蛋白在肺癌和血管损伤性疾病中特异性变化的实验研究》文中研究说明目的:研究不同种氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）在动脉硬化性血管损伤性疾病（As）和肺癌（Ca）病人血液中的特异性变化。探讨不同种氧化低密度脂蛋白与动脉硬化及肿瘤发病之间的相互关系。探索临床上治疗肿瘤和动脉硬化性疾病的新的理论和方法。[对象及方法]：以临床上确诊肺癌的－Ca组和包括糖尿病的动脉硬化患者作为血管病变组—AS组，正常对照组选择了健康大学生20名，将实验组分为叁组：（1）Ca组，（2）AS组，（3）正常组。每人清晨空腹采血16ml加入乙二胺四乙酸（终端浓度为0.05mmol/L）抗凝、抗氧化，分离提取血浆，在冰箱0℃条件下保存备用。用重层超速离心分离法，分离血浆内低密度和高密度脂蛋白，用八木别法法，检测各组血浆的低密度脂蛋白内过氧化脂蛋白含量。用放射免疫法测定各组血浆内超氧化物歧化酶(SOD)的含量，以薄层层析法判定各组氧化脂质的峰线位置和大致浓度。[结果]：（1）Ca组的过氧化低密度脂蛋白平均含量为9.2±5.1μg／ml高于正常组的5.2±4.3μg／ml具有统计学意义(P<0.05),AS组的过氧化低密度脂蛋白含量为11.9±4.0μg／ml明显高于正常组4.6±2.75μg／ml (P<0.01),过氧化低密度脂蛋白含量在Ca组与AS之间无统计学差异。（2）在薄层层析中Ca组、AS与正常组的过氧化低密度脂蛋白分布与<WP=4>正常组不同。（3）正常组，Ca组与AS组的SOD检测值分别为328.7±140.53μg／ml，736.7±366.9μg／ml，828.6±366.9μg／ml结果显示正常组与Ca组和AS组之间有统计学意义。而Ca组和AS组之间无明显差异。[结论]：（1）Ca与AS和正常人比较其细胞氧化低密度脂蛋白代谢特征表现为代谢率增强，即单位时间内细胞的氧化低密度脂蛋白结合、内吞和降解量均显着增加。过氧化低密度脂蛋白的增加是致病或增强致病因素之一。（2）肺癌和血管病变性疾病发生过程中过氧化低密度脂蛋白具有不同的特异性变化，提示它们的产生来源可能是不同物质。
邵文祥[6]2012年在《Ox-LDL在动脉粥样硬化形成早期的作用机制研究》文中认为动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是导致冠心病和中风等心血管疾病的主要病理基础。一般认为,氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein, Ox-LDL)诱导了血管壁内巨噬细胞泡沫化,并在其局部引发一连串的多种细胞参与的炎症反应,从而导致不同程度的动脉粥样硬化。作为血管壁第一道防线,血管内皮层的完整性和各种特性在动脉粥样硬化过程中起着重要作用。相比正常情况,病理情况下内皮层的完整性受到破坏,或内皮层具有更大粘附性,使单核细胞和淋巴细胞等更容易从血液中迁移到血管壁内,从而加剧动脉粥样硬化进程。近年来发现,Ox-LDL不但存在于血管动脉粥样斑内,也存在于血液中。血液中低浓度的Ox-LDL在婴儿时期就存在,且随年龄增大逐渐升高,在疾病状态下(如动脉粥样硬化)甚至增高几倍至十几倍。研究发现,高浓度的Ox-LDL的确能够诱导内皮细胞死亡从而破坏内皮层完整性,也能提高内皮细胞的粘附能力,从而揭示了高浓度Ox-LDL在动脉粥样硬化中晚期所起的负面作用。那么,在动脉粥样硬化发生之前或早期,低浓度Ox-LDL是否也起着相似的作用?本研究旨在回答这个问题。本研究主要从内皮细胞死亡和铺展两个角度探讨Ox-LDL对内皮细胞层完整性的影响,从一氧化氮(NO)的产生和细胞表面粘附力的变化两个方面来分析Ox-LDL对内皮细胞层粘附特性的影响。出乎意料的是,低浓度和高浓度Ox-LDL对内皮细胞的大部分影响截然相反。与以往报道一致,高浓度Ox-LDL能诱导细胞死亡、抑制细胞铺展、抑制NO的产生及提高细胞的表面粘附力；而低浓度Ox-LDL轻微促进细胞增殖、提高NO的产生、降低细胞的表面粘附力,但对细胞铺展也起一定的抑制作用。这个结果很有趣,暗示了血液中的Ox-LDL很可能起着“双刃剑”的作用：在低浓度时,防止血细胞粘附和进入血管壁,从而起着“好”的作用；高浓度时,则加剧血细胞的粘附和渗透,从而起着“坏”的作用,加剧动脉粥样硬化进程。也暗示着,人体血液中存在着低浓度Ox-LDL也许是件好事,但维持低浓度状态至关重要。这个假说完全颠覆了传统观点但意义重大,我们课题组还将进行深入研究,并期待着更多科研小组来验证这个假说。
黄柳向[7]2015年在《冠心病合并幽门螺杆菌感染临床相关因素分析及清胃行滞方的干预作用》文中研究说明目的：探讨幽门螺杆菌(Hp)感染与冠心病(CHD)相关危险因素的关系,分析幽门螺杆菌感染在冠心病发病中的作用；探讨幽门螺杆菌感染与冠心病中医证型的相关性。观察清胃行滞方治疗冠心病不稳定型心绞痛合并幽门螺杆菌感染(痰热瘀阻证)的临床疗效,观察其对血脂、血液流变学及炎症因子(高敏C反应蛋白、抵抗素及脂联素)的影响,探讨清胃行滞方治疗的可能机制。方法：1.选择2012年4月-2013年10月湖南中医药大学第一附属医院门诊确诊CHD患者112例,均详细记录并核实其性别、年龄、合并高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟史、饮酒史及家族史等情况,并确认其中医证型。采用14碳呼气试验检测Hp感染情况,并与非冠心病组(59例)比较。2.选择60例2013年6月-2014年8月在湖南中医药大学第一附属医院心内科住院的不稳定型心绞痛合并幽门螺杆菌感染痰热瘀阻证患者,随机分为治疗组(30例,常规西药治疗加用清胃行滞方)及对照组(30例,常规西药治疗加用复方丹参滴丸),疗程均为6周。观察并比较两组患者的临床疗效。观察两组治疗前后血脂水平、血液流变学指标及炎症因子(高敏C反应蛋白、脂联素及抵抗素)水平的变化。观察治疗组治疗后幽门螺杆菌转阴情况。统计方法：计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验,等级资料采用秩和检验。结果：1.冠心病合并幽门螺杆菌感染临床相关因素分析的研究结果：①冠心病组总Hp感染率(45.54%)明显高于非冠心病组(23.72%)(P<0.01)。冠心病组中不稳定型心绞痛患者Hp感染率为56.14%,稳定型心绞痛患者Hp感染率为34.54%,两者差异有统计学意义(P<0.05)；②在冠心病各类型危险因素中,有家族史、吸烟、饮酒史、高脂血症、高血压病、糖尿病史、男性患者Hp阳性率分别为48.65%、50.88%、46.67%、45.16%、46.88%、47.92%、46.67%；无家族史、吸烟、饮酒史、高脂血症、高血压病、糖尿病史、女性患者Hp阳性率分别为46.67%、43.64%、42.31%、48.00%、45.83%、45.31%、43.24%,对应组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。③在冠心病组中,热证、气虚证、气阴两虚证、痰瘀证组患者Hp阳性率分别为69.23%、44.12%、29.41%、33.33%,寒凝证和气滞证组患者Hp阳性率为0%。热证组患者Hp感染率高于气虚证组、气阴两虚证组和痰瘀证组(P<0.01)；而气虚证组、气阴两虚证组和痰瘀证组患者Hp感染率两两之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.清胃行滞方对不稳定型心绞痛合并幽门螺杆菌感染痰热瘀阻证的干预作用研究结果：①两组治疗后患者心绞痛改善情况比较：治疗组总有效率为93.33%,优于对照组的70.00%(P<0.05)。治疗组和对照组治疗后均能减少心绞痛发作次数和缩短心绞痛持续时间(P<0.01),但治疗组疗效优于对照组(P<0.01)。两组治疗后均能减少不稳定型心绞痛患者临时服用硝酸甘油用量(P<0.01),治疗组疗效优于对照组(P<0.01)。②两组患者中医证候疗效比较：治疗后治疗组中医证候总有效率为93.33%,优于对照组的66.67%(P<0.05)。两组治疗后临床症状均有不同程度改善,除气短症状外,治疗组对胸痛、胸闷等中医症状的疗效明显优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。两组治疗后中医证候总积分均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.01)；治疗组中医证候总积分治疗后下降的幅度优于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。③两组心电图疗效比较：治疗组心电图总有效率为76.67%,对照组为50.00%,差异有显着性意义(P<0.05),治疗组优于对照组。④两组治疗后血脂变化比较：除HDL-C变化不明显外,治疗组治疗后TC、TG、LDL-C的水平均下降(P<0.01),疗效优于对照组(P<0.01)。⑤两组治疗后血液流变学指标变化比较：除对照组全血黏度(低切)外,两组治疗后血液流变学各指标均有不同程度下降(P<0.01),治疗组改善明显优于对照组(P<0.05或P<0.01)。⑥两组治疗前后hs、CRP、抵抗素和脂联素水平比较：治疗组和对照组治疗后hs-CRP、抵抗素水平均较治疗前明显下降(P<0.01),而治疗组降低的幅度明显大于对照组(P<0.01)。两组治疗后脂联素水平均高于治疗前(P<0.05或P<0.01),治疗组升高的幅度明显大于对照组(P<0.01)。⑦治疗组治疗后Hp根除情况：治疗组治疗Hp总有效率为80.00%,其中根除率为43.33%。结论：1.幽门螺杆菌感染与冠心病发病相关,可能是冠心病发病的独立危险因素。幽门螺杆菌感染可能诱发加重冠状动脉粥样硬化的炎症反应,导致不稳定斑块形成而致急性心血管事件发生。2.冠心病合并幽门螺杆菌感染患者中医证候以热证居多。不同证候中分布依次为热证>气虚证>痰瘀证>气阴两虚证>寒凝、气滞证。3.清胃行滞方对不稳定型心绞痛合并幽门螺杆菌感染(痰热瘀阻证)具有显着的临床疗效,优于单纯活血化瘀组。能明显缓解心绞痛症状,有效改善患者的血脂水平和血液流变性,提高临床疗效和中医证候疗效,可在临床推广。其可能的治疗机制是：①改善脂质代谢。②抗凝,抗血小板聚集,防止血栓形成,改善心肌微循环。③抑制幽门螺杆菌,干预炎症反应,稳定易损斑块。④降低血清高敏C反应蛋白和抵抗素水平,升高血清脂联素水平,发挥抗炎、抗AS作用。本研究丰富和发展了从脾胃论治冠心病的思路和方法。
杨慧宇[8]2010年在《LOX-1介导氧化应激致动脉粥样硬化的实验研究》文中研究指明研究背景由动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)引起的心脑血管疾病严重危害着人类健康,在欧美一些国家已经成为危及人类健康的一号杀手,因此,对As发生发展机制的研究尤显重要。动脉粥样硬化的发病机理较为复杂,且至今尚不明确其发病机制。近年来研究发现,氧化应激(oxidative stress, OS)学说是As斑块形成学说中的重要组成部分,氧化应激与As的发病密切相关。巨噬细胞通过介导氧化应激参与心血管疾病的发生发展已成为研究热点。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-ademine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶是吞噬细胞(中性粒细胞、单核／巨噬细胞)产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要来源,包含胞膜成分细胞色素b558(gp91phox和p22phox,其中gp91phox有NADPH、heme、FAD的潜在结合位点)和胞浆成分p47phox、p67phox及小的GTP结合蛋白rac(单核细胞为rac1,嗜中性粒细胞为rac2)等五个亚组分。phox的晶体结构显示,p47phox的两个前后排列的Src同源区相互作用能抑制其与p22phox结合。当p47phox被磷酸化时这种抑制作用消失,胞质侧的亚组分易位到胞膜与细胞色素b558结合,且在rac的参与下激活NADPH氧化酶而启动呼吸链,爆发级联反应。单核／巨噬细胞在内皮细胞释放的趋化因子的作用下,积聚在血管内膜下,单核／巨噬细胞吞噬型NADPH氧化酶呼吸爆发生成的ROS在血管壁损伤,特别是斑块的形成、破裂与血栓形成中起着重要作用,动物实验研究中发现,在As损伤部位单核细胞／巨噬细胞NADPH氧化酶可能是生成O-2的重要源。在动脉粥样硬化斑块中超氧阴离子表达增加,并伴随着吞噬细胞gp91phox和p22phox表达增加及非吞噬细胞NOX4表达增加。在人冠状动脉粥样硬化斑块易受损的肩区显示gp91phox广泛表达,这与巨噬细胞定位相一致,以上结果提示,巨噬细胞氧化应激在动脉粥样硬化过程中起关键作用。大量的ROS,可使低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)发生氧化修饰,形成氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,Ox-LDL)。巨噬细胞对脂质的摄取也是通过受体途径,在巨噬细胞上有多种LDL的受体,每种受体对应着相应的配体。血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1 (lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1, LOX-1)是近年来首先在牛血管内皮细胞上发现的Ox-LDL受体,属SR型。它的结构不同于其他SR,为Ⅱ型膜表面糖蛋白,属于C型凝集素家族。进一步的研究发现巨噬细胞和血管平滑肌细胞(VSMCs)膜上亦有LOX-1表达,其基因序列同内皮细胞上的LOX-1完全相同,并且可识别和结合Ox-LDL,在动脉粥样硬化的早期能促进泡沫细胞的形成。研究发现,LOX-1结合Ox-LDL后可以迅速诱发内皮细胞ROS升高,特别是超氧阴离子和H2O2显着升高,升高的ROS除作为第二信使外,还直接作用于内皮细胞,使一氧化氮(NO)失活和核转录因子-κB(NF-κB)活化,胞膜脂质过氧化,巨噬细胞也有LOX-1表达,那么LOX-1在巨噬细胞氧化应激中是否起着重要的调节作用未见报道。综合以上的研究进展,我们提出一个假设：LOX-1在巨噬细胞氧化应激致动脉粥样硬化过程中可能起关键作用。基于国内外在本领域的研究进展,我们推测：Ox-LDL与LOX-1结合后可能诱导巨细胞NADPH的激活,进一步促进ROS生成,导致氧化应激,生成的ROS可作为第二信使,过多的ROS可通过增加钙离子水平来激活胞内信号通路和改变细胞内蛋白的氧化还原状态,使脂质氧化、黏附分子表达、基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases,MMP)激活、内皮细胞功能失调／凋亡、血管平滑肌细脆(VSMC)增殖和迁移以及血管收缩性改变,进一步放大氢化应激效应：造成恶性循环,加速动脉粥硬化的发展。目的我们将在国内外及时前期研究的基础上较为全面地分析LOX-1在巨噬细胞氧化应激致动脉粥样硬化这一重要病理过程中的作用。采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默LOX-1基因表达,观察LOX-1对巨噬细胞ROS生成及对NADPH氧化酶各组分基因表达的影响,结合流式细胞仪、Real-Time PCR、Western-blot等技术探讨Ox--LDL能否通过LOX-1来诱导巨噬细胞NADPH的激活,进一步促进ROS生成,导致氢化应激,同时选用丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路分析其作用机制。为进一步探讨LOX-1介导巨噬细胞氧化应激致动脉粥样硬化的作用,采用ApoE基因敲除小鼠,经尾静脉注射腺病毒Ad-siRNA-LOX-1,观察对动脉粥样硬化氧化应激的影响,进一步揭示LOX-1促进动脉粥样硬化的分子机制。本研究不仅可能发现Ox-LDL/LOX-1所诱导的氧化应激信号通路及其在动脉粥样硬化中的作用。还将可能提供新的药物治疗靶点,指导通过抑制LOX-1及其信号等新的抗动脉粥样硬化的临床治疗方案。方法1.LOX-1小分子干扰表达载体的构建根据siRNA的设计原则,设计、合成叁对特异性针对LOX-1基因的小分子干扰RNA序列,同时设计与人类所有己知基因序列均无同源性的片段作为阴性对照,以LOX-1为靶基因设计并合成小发卡结构两端配对的siRNA寡核苷酸链,再经变性、复性后形成双链LOX-1-siRNA。采用DNA重组技术,将LOX-1基因双链与线性化pGenesiI-1质粒表达载体连接,用酶切法及测序法鉴定重组质粒。2.质粒LOX-1-siRNA转染小鼠巨噬细胞条件的优化及效应(1)培养小鼠巨噬细胞(RAW264.7),倒置相差显微镜观察细胞形态,将融合60%的巨噬细胞无血清培养24h后,细胞生长至对数增殖期。弃去原培养液,更换新的无血清培养液并随机分成2组(1×107个/组)：无血清对照组及转染组。分为质粒／脂质体转染试剂不同体积比(质粒量分别为0.5μg、1μg及1.5μg,体积比为1：1；1：2；1：3；作用48h。荧光显微镜下观察转染细胞绿色荧光的表达,流式细胞仪检测转染效率,MTT法测定细胞活性。(2)选用上述优化选择的转染条件,转染巨噬细胞,荧光定量PCR法检测LOX-1mRNA的表达,Western blot法检测LOX-1蛋白的表达,选择沉默效果最佳的作为下一步的干预序列。3.LOX-1对Ox-LDL所诱导巨噬细胞氧化应激的影响(1)实验分组：实验分成4组：对照组；Ox-LDL (50 mg/L)组；LOX-1-siRNA+Ox-LDL (50mg/L)；选用沉默效果最佳的干扰序列干预24h后再加入Ox-LDL作用16小时；pCon组：质粒对照组。(2)LOX-1对巨噬细胞MDA及SOD含量的影响：实验终止时,收取细胞,按照试剂盒说明书,分别对各组MDA及SOD含量进行测定。(3)荧光显微镜及流式细胞术法检测细胞内ROS水平：实验分为：阴性对照组；正常培养的细胞中不加荧光探针；正常对照组：正常培养的细胞中加入荧光探针,不加任何干预因素；H2O2阳性对照组：使用H2O2作为阳性对照组；Ox-LDL诱导组；加入Ox-LDL(50mg/L)作用16小时；LOX-1-siRNA+Ox-LDL组：LOX-1-siRNA干预24h后再加入Ox-LDL作用16小时;pCon组：质粒对照组。实验结束后采用荧光显微镜及流式细胞术法检测细胞内ROS的水平。(4)应用荧光定量PCR及Western blot法检测NADPH氧化酶核心酶及亚组分的表达,以GAPDH为内对照,检测NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox作为观察指标,荧光定量PCR方法及Western blot法检测NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox mRNA及蛋白表达。4.LOX-1在巨噬细胞氧化应激相关信号转导通路的作用(1) Ox-LDL作用不同时间对MAPKs信号转导通路的影响：观察Ox-LDL作用不同时间诱导MAPKs的作用,实验分为：无血清对照组及Ox-LDL (50 mg/L)作用不同时间组(Ox-LDL分别作用15min,30 min,60min,90min,120 min)。收集细胞,用Western-blot方法检测P-p38MAPK, p38 MAPK, P-ERK, ERK, P-JNK, JNK表达。(2)LOX-1-siRNA对Ox-LDL诱导巨噬细胞MAPKs信号转导通路的影响：观察LOX-1-siRNA对Ox-LDL诱导巨噬细胞MAPKs信号转导通路的影响,实验分为4组：对照组；Ox-LDL (50mg/L)组;LOX-1-siRNA+Ox-LDL (50 mg/L); pGenesil-1组。收集细胞,用Western-blot方法检测P-p38MAPK, p38 MAPK, P-ERK, ERK, P-JNK, JNK表达。5.LOX-1在ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化氧化应激的作用(1)采用APOE基因敲除(APOE KO)小鼠,高脂饮食饲养。8周龄ApoE-/-小鼠,高脂饮食饲养并随机分为下列3组(n=60)：APOE KO对照组；载体对照组；RNAi组。APOE KO对照组：于五周末经尾静脉注射PBS缓冲液(200μ1)至小鼠体内,隔14天重复注射PBS(200μ1)。观察4周,观察期间高脂喂养。载体对照组：于五周末将腺病毒Ad-siRNA-Neg(终滴度为5×1012 pful/mL)经尾静脉注射至小鼠体内,隔14天重复注射腺病毒Ad-siRNA-Neg,观察4周,观察期间高脂喂养。RNAi组：于5周末将腺病毒Ad-siRNA-LOX-1(终滴度为5×1012 pful/mL)经尾静脉注射至小鼠体内,隔14天重复注射腺病毒Ad-siRNA-LOX-1,观察4周,观察期间高脂喂养。(2)腺病毒介导的siRNA在体内的生物分布及差异表达：首次注射后第7天及第14天随机取小鼠5只,称其体重,按0.4ml/100g的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,迅速取出肝、肾及主动脉组织,立即送病理科行冰冻切片,厚度为5～8μm,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,评估Ad5-EGFP-LOX-1-sIRNA被组织吸收的情况。(3)检测主动脉中LOX-1 mRNA及蛋白的表达：尾静脉注射腺病毒Ad-siRNA-LOX-1观察4周后,用Real-time PCR及Western blot法检测主动脉中LOX-1 mRNA及蛋白的表达。(4)测定血脂水平：采用酶比色法,用全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油叁醋(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。(5) Movat五色套染法染色,使用Image Pro-Plus 5.1软件进行资料分析,观察不同组别斑块形态学变化,并测量平均斑块面积和斑块面积与管腔面积的比值。(6)采用Vevo 770 High-Resolution Imaging System (VisualSonics Inc., Toronto, Ontario, Canada)对小鼠进行左颈总动脉超声检查,测量左颈总动脉管腔直径、内膜中层厚度(IMT)。(7)免疫组化染色观察斑块内巨噬细胞CD68的阳性表达量,巨噬细胞CD68的阳性表达为胞浆内的棕黄色颗粒,实验结果经图像分析系统中的免疫组化模块处理。(8) Real-time PCR法及Western blot法及检测主动脉组织中LOX-1、NOX1、NOX2、racl、p47phox、p22phox mRNA及蛋白表达。结果1.LOX-1小分子干扰表达载体的构建成功构建了以LOX-1基因为靶点的真核表达载体LOX-1-siRNA1、LOX-1-siRNA2,经DNA测序和酶切鉴定,所构载体无基因突变,结果与预期符合,为下一步实验奠定了基础。2.质粒LOX-1-siRNA转染小鼠巨噬细胞条件的优化及效应(1)RAW264.7细胞在含10%的无酚红的DMEM培养基中生长良好。传代后2h贴壁,形态以类圆形和不规则多边形为主,一般含1～2个核,有伪足,细胞胞体较小,细胞生长快,5～6 d汇合。(2)经过优化转染条件,脂质体转染剂Lipofectamine2000可以将重组质粒LOX-1-siRNA高效转染入RAW264.7细胞,并保证较低的细胞毒性。两者最佳配比为LOX-1-siRNA1.0μg、Lipofectamine2000 2μl,转染入RAW264.7细胞后,能显着抑制LOX-1mRNA的表达,其中又以LOX-1-siRNA2抑制作用更强,作为我们下一步实验的最佳选择。3.LOX-1对Ox-LDL所诱导巨噬细胞氧化应激的影响(1)LOX-1对巨噬细胞MDA含量及培养液中SOD活性的影响：Ox-LDL组MDA的水平明显高于对照组(32.69±1.16 vs 9.79±1.52,P<0.05),而Ox-LDL组SOD水平却明显低于对照组(24.09±1.58 vs 13.08±1.08,P<0.05),表明经Ox-LDL诱导的巨噬细胞氧化系统和抗氧化系统己失去平衡,处于氧化应激状态。与Ox-LDL组相比,Ox-LDL+LOX-1-siRNA组细胞内MDA含量明显下降(32.6±1.16 vsl2.75±1.93,P<0.05),SOD活性明显升高(13.08±1.08VS 19.9±1.12,P<0.05)。(2)荧光显微镜观察LOX-1对巨噬细胞内ROS水平的影响：结果发现,Ox-LDL刺激后细胞内ROS水平较对照组明显升高,LOX-1-siRNA+Ox-LDL组,细胞内ROS水平明显下降。(3)流式细胞术检测细胞内ROS水平：结果显示,阳性对照组ROS平均荧光强度为(110.0±2.1),对照组为(33.8±2.8), Ox-LDL处理16h后ROS平均荧光强度(70.9±3.1)与对照组比较显着增加(P<0.05),而转染LOX-1-siRNA 24 h后再加Ox-LDL处理16h,巨噬细胞中ROS平均荧光强度为(38.7±2.3),与Ox-LDL组比较显着降低(P<0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。(4) Real-Time-PCR结果分析显示：Ox-LDL (50mg/L)诱导16h后,NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox mRNA表达水平明显上调,与对照组0.387±0.02相比差异具有统计学意义(P<0.05)。转染LOX-1-siRNA干预24h后再加入Ox-LDL刺激16h, NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox mRNA表达水平明显下调,与Ox-LDL差异具有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果显示：LOX-1-siRNA对巨噬细胞NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox蛋白表达水平的影响与基因水平趋势一致(P<0.05)。4.LOX-1在巨噬细胞氧化应激相关信号转导通路的作用(1)与对照组相比,Ox-LDL作用15 min时p38MAPK、JNK磷酸化水平显着增加(P<0.05),而后逐渐下降；Ox-LDL作用60 min时ERK1／2磷酸化水平显着增加(P<0.05),而后逐渐下降。(2)转染LOX-1-siRNA干预24h后再加入Ox-LDL刺激15min p38MAPK、JNK磷酸化表达水平明显下调,与Ox-LDL组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),转染LOX-1-siRNA干预48h后再加入Ox-LDL刺激60min ERK1/2磷酸化表达水平明显下调,与Ox-LDL组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。5.LOX-1在ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化氧化应激的作用(1)体重变化及血脂水平：各组小鼠在实验结束时体重均有一定的增加,但体重增加值在各组间无统计学差异(P>0.05)。在Ad-siRNA-LOX-1组中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇均有降低的趋势,但没有统计学差异(P>0.05)。(2)腺病毒介导的siRNA在体内的生物分布及差异表达：取干预组小鼠主动脉、肝脏、肾脏组织后立即作冰冻切片,在荧光显微镜下观察荧光表达情况。结果显示：主动脉、肝脏、肾脏组织都可见大量绿色荧光表达,并且在主动脉斑块内大量分布。(3) Real-time PCR及Western blot法检测主动脉中LOX-1 mRNA及蛋白的表达：Real-time结果显示：ApoE KO鼠对照组、病毒对照组主动脉LOX-1 mRNA表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05); Western blot结果显示：ApoE KO鼠对照组,病毒对照组主动脉LOX-1蛋白表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05),与RT-PCR结果一致,说明ApoE KO鼠经尾静脉注射Ad5-EGFP-LOX-1-siRNA后,LOX-1表达明显降低。(4) LOX-1-siRNA对主动脉粥样斑块面积的影响：Movat染色显示与对照相及对照载体组比较,RNAi干扰组ApoE-/-小鼠斑块面积,外弹力膜面积,斑块面积／血管面积减少但差异均无统计学意义(P>0.05),与对照相及对照载体组比较,RNAi干扰组ApoE-/-小鼠纤维帽显着增加(5.41±0.46 vs 4.78±0.25及4.81±0.34,P<0.05)。(5)左颈总动脉(LCCA)超声结果：左颈总动脉超声显示,各组平均动脉内径之间无显着性差异,与ApoE-/-安慰剂组及载体对照组相比,Ad-siRNA-LOX-1组左颈总动脉平均内膜中层厚度(IMT)明显降低,并具有统计学意义(0.29±0.06 vs 0.28±0.02,0.2±0.01,P<0.05)(6)主动脉斑块处巨噬细胞聚集：与ApoE安慰剂组及载体对照组相比,RNAi组斑块中巨噬细胞阳性率显着减少。Real-time PCR法检测组织中NOX1、NOX2、p22phox、p47phox、rac1mRNA表达(7) Real-time PCR及Western blot法检测组织中NOX1、NOX2、p22phox、p47phox raclmRNA表达：Real-time结果显示：ApoE KO鼠对照组,病毒对照组的NOX1、NOX2、p22phox、p47phox、rac1mRNA表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示：ApoE KO鼠对照组,病毒对照组的主动脉NOX1、NOX2、p22phox、p47phox、rac1蛋白表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05),与RT-PCR结果一致。结论1.成功构建了LOX-1基因RNA干扰载体LOX-1siRNA,转染效率可确保实验的可靠性,且操作简单,并成功筛选出针对小鼠LOX-1基因沉默的特异性siRNA,为动物实验奠定基础。2. Ox-LDL能诱导巨噬细胞LOX-1表达增加,激活巨噬细胞NADPH氧化酶,使NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox表达明显增加,进一步诱发ROS大量生成,导致氧化应激。3. Ox-LDL与LOX-1结合能引起机体内ROS的增加,ROS的增加可激活MAPKs信号激酶,ROS可能是诸多信号传导通路的共同环节。4. ApoE-/-小鼠体内试验表明,LOX-1可能通过调节斑块的稳定性参与动脉粥样硬化的进程,而LOX-1调节斑块的稳定性可能与NADPH氧化酶的激活、ROS的生成有关。VI
邓同乐[9]2006年在《Ox-LDL诱导早期巨噬细胞源泡沫细胞形成和损伤中相关动力学机制研究》文中指出动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种多因素疾病,与多种危险因子包括血脂紊乱、糖尿病、肥胖和高血压有关,重要的基本病理改变是氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)在血管壁的积聚,其中巨噬细胞在血管壁的脂质代谢中起着关键而复杂的作用。在早期脂质浸润中,巨噬细胞通过清道夫受体(CD36等)摄取Ox-LDL,形成泡沫细胞,大量积聚的Ox-LDL引起细胞毒性使细胞产生大量炎症因子,改变了细胞的形态和信号转导,进而损伤细胞影响动脉粥样硬化的发展。因此,早期AS最基本的病理特征之一就是巨噬源泡沫细胞的形成和损伤,但目前其形成和损伤的时间和空间动力学机理仍不清楚。 本研究以PMA诱导人单核细胞U937源的巨噬细胞为靶细胞,通过Ox-LDL诱导的巨噬细胞源泡沫细胞模型,利用流式细胞术、激光共聚焦显微术和分子生物学技术等实验技术,结合动力学分析方法,研究了动脉粥样硬化早期巨噬细胞源泡沫细胞形成和损伤的相关动力学机制。 本研究分别在Ox-LDL急性和慢性刺激等不同条件下,对影响泡沫细胞形成的部分关键因子胆固醇酯(CE)、总胆固醇(TC)、CD36、CD54和F-actin,以及[Ca~(2+)]i等进行了时间和空间上的相关动力学研究。研究结果显示,1)在慢性刺激下,Ox-LDL能显着以时间依赖的方式诱导细胞内CE和TC的升高(P<0.01),尤其在24h时(CE/TC)%>50%,表明了Ox-LDL诱导早期泡沫细胞形成的时间动力学变化,即Ox-LDL刺激24h后形成典型巨噬细胞源泡沫细胞;2)在急性和慢性刺激下,Ox-LDL能显着诱导[Ca~(2+)]i的升高,但在急性刺激时,胞外液无论在有无Ca~(2+)存在的情况下,[Ca~(2+)]i都呈不同程度的升高,且在空间上形成明显的跨膜Ca~(2+)梯度变化;3)在慢性刺激下,Ox-LDL以时间依赖的方式诱导细胞表面CD54和CD36表达的升高,以及F-actin时间和空间上多聚化的改变; 另外,本研究还分别在Ox-LDL急性和慢性刺激等不同条件下,对影响泡沫细胞内线粒体损伤的部分关键因子H_2O_2、NO和O_2~(·-)、线粒体呼吸、线粒体膜电位(△ψm)、谷胱甘肽(GSH)和Bcl-2蛋白的表达、以及细胞的凋亡和坏死等进行了相关动力学研究。研究结果显示,1)在急性和慢性刺激下,Ox-LDL能显着
郭遂怀[10]2016年在《涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型炎性细胞因子的调节作用》文中认为目的:动脉粥样硬化(AS)是一种主要累及大、中动脉的疾病,其基本病变是动脉内膜的脂质沉积、内膜纤维样、粥样斑块形成引起管壁变硬、管腔狭窄,继而引起一系列继发病变,AS是多种心脑血管疾病的病变基础。近年来研究发现,在AS中检测到炎症细胞和炎症介质,不论在AS的启动、病变之进展、还是在血栓性并发症形成中,炎症始终为其关键因素。中医学认为AS与痰关系密切,痰是人体脏腑气血失和,津液运化失常的病理产物,是一种危害甚广的致病因素。因此,探索动脉粥样硬化的发生发展机制成为防治心脑血管病的重中之重。在本研究中,通过对动脉粥样硬化新西兰兔模型灌胃涤痰汤水煎液,检测AS兔主动脉粥样斑块的病理组织改变,从细胞以及分子生物水平,研究涤痰汤水煎液对AS兔炎性因子的影响。方法:48只雄性新西兰白兔按随机数字表法,分为6组,每组8只,即空白组、AS模型组、涤痰汤低、中、高剂量组和阿托伐他汀钙组。空白组饲以普通饲料;其余各组饲以高脂饲料。8周后,随机选取AS模型组兔2只,麻醉后,取颈总动脉血,查血脂,提示血脂明显增高;主动脉分离后制备HE片,血管壁内均可见明显的粥样斑块,提示AS造模成功。AS模型组以生理盐水10ml/kg灌胃4周,期间继续喂以高脂饲料;涤痰汤高剂量组给予高浓度中药煎剂(0.738g/ml)灌胃、涤痰汤中剂量组给予中等浓度中药煎剂(0.492g/ml)灌胃、涤痰汤低剂量组给予低浓度中药煎剂(0.266g/ml)灌胃以及阿托伐他汀钙组应用阿托伐他汀钙3mg·kg-1d-1灌胃,各组均按10ml/kg灌胃,每日14:00按时灌胃1次,持续4周,期间继续喂以高脂饲料。于末次给药后禁食(不禁水)12 h,次晨经颈总动脉取血4 m L,应用全自动生化分析仪测定血清中Tc、TG、LDL-c、HDL-c、SOD和MDA的含量;ELISA法测定血清中TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1的含量;静脉注射戊巴比妥钠(25 mg/kg)后,新西兰白兔很快进入麻醉期,然后迅速分离心脏到髂总动脉分叉处之间的主动脉,剔除干净动脉周围的脂肪组织,并于主动脉弓处取直径3 mm的组织作HE染色及用Western blot方法作主动脉NF-κB、E-selectin蛋白表达检测,用荧光定量PCR检测TNF-α和IL-6m RNA表达及用免疫组化法检测ICAM-1、VCAM-1表达。结果:1涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型血清Tc、TG、HDL-c、LDL-c的影响:涤痰汤能降低AS兔血清Tc、TG、LDL-c水平,且呈剂量依赖性,与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01或P<0.05)。2涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型血清SOD、MDA的影响:涤痰汤能提高AS兔SOD水平,降低MDA水平,且呈剂量依赖性,与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01或P<0.05)。3涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型血清TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1的影响:涤痰汤能降低AS兔主动脉血清TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1的表达,且呈剂量依赖性,与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01或P<0.05)。4涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型主动脉NF-κB、E-selectin蛋白表达的影响:涤痰汤能降低AS兔主动脉NF-κB和E-selectin蛋白的表达,且呈剂量依赖性,与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01或P<0.05)。5涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型主动脉TNF-α、IL-6 m RNA表达的影响:涤痰汤能降低AS兔主动脉TNF-α、IL-6 m RNA的表达,且呈剂量依赖性,与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01或P<0.05)。6涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型主动脉ICAM-1、VCAM-1的影响:涤痰汤能降低AS兔主动脉ICAM-1、VCAM-1的表达,且呈剂量依赖性,与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01或P<0.05)。7涤痰汤对动脉粥样硬化兔模型动脉血管组织病理学改变的影响:空白组可见主动脉壁厚薄均匀,内膜光滑完整,无AS斑块形成;AS模型组,内膜层隆起,内膜下可见大量泡沫细胞聚集和细胞外脂质沉积;涤痰汤低剂量组,内膜下泡沫细胞聚集和细胞外脂质沉积开始有所减少;涤痰汤中剂量组,内膜下泡沫细胞聚集和细胞外脂质沉积减少比较明显;涤痰汤高剂量组,内膜下泡沫细胞聚集和细胞外脂质沉积明显减少;阿托伐他汀钙组,内膜下泡沫细胞聚集和细胞外脂质沉积明显减少。结论:1.在本实验中,应用高脂饲料成功造模了动脉粥样硬化模型,中医的理论认为,“痰”与高脂血症密切相关。由此推论,动脉粥样硬化与中医“痰”邪息息相关。2.在本实验中,经检测,动脉粥样硬化兔存在血脂增高,炎性细胞因子表达增高。由此推论,动脉粥样硬化的发生、发展与血脂异常,炎症反应的关系密切。3.涤痰汤具有调血脂作用,同时,能提高抗氧化应激能力,具有降低致动脉粥样硬化炎性细胞因子的作用。Modulate Effect of Ditan Decoction on Inflammatory Cytokines in
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