一、提高玉米胚性细胞系诱导再生植株的研究（论文文献综述）
张素芳[1]（2020）在《杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究》文中研究指明落叶松是我国北方重要的用材、生态树种之一,利用选择育种、杂交育种等已获得一批生长材质优良的种质资源。由于极端气候条件频发,东北地区春季干旱严重,严重影响落叶松成活及生长,选育抗旱品种十分必要。常规育种改良周期较长,从分子方面开展遗传改良可缩短育种周期,但落叶松干旱响应等分子机理的研究远远落后于其他树种。miRNA是植物中参与转录后基因表达调控的一类非编码单链小RNA分子,主要通过降解靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译调控基因的表达,从而改变植株生长性状或抗逆性等。为定向改良落叶松的优良性状并大量快速繁殖优良种质资源,以杂种落叶松日3×兴9未成熟合子胚为外植体诱导胚性愈伤组织,构建并优化落叶松胚性愈伤的遗传转化体系,同时对干旱胁迫条件下落叶松sRNA进行初步功能分析挖掘miRNA,获得Lol-miR11467并进行遗传转化,分析转基因细胞系在干旱、盐碱胁迫条件下的生理变化并筛选其调控的下游靶基因,主要研究结果如下:（1）杂种落叶松遗传转化体系的构建与优化。胚性愈伤组织的诱导率与球果采集时间有关,7月1日采集的材料诱导率最高,是未成熟合子胚的最佳采集时期。使用75%酒精消毒1 min后使用3%NaClO消毒10 min,接种在含有1.0 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT的BM培养基中,胚性愈伤组织诱导率最大,为10.33%。在含有0.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT的BM增殖培养基上培养12 d时为最佳继代周期。预培养在含有10 g/L肌醇、60 g/L蔗糖的1/4 BM培养基上获的体胚发生数最多。45 mg/L的ABA和75 g/L的PEG4000共同作用能够促进体胚的发生数,体胚发生数量达到最大,为210个/g。采用农杆菌介导法对落叶松进行遗传转化时,发现使用OD600值为0.5的侵染液侵染20 min,共培养2 d,利用4 mg/L Hyg的筛选培养基进行抗性愈伤的筛选,pCAMBIA1301遗传转化效率最高,为45.56%。（2）干旱胁迫下落叶松小RNA挖掘。使用miRDeep2软件共预测到190个miRNAs,其靶基因总数为6284个,共4964个获得注释信息。获得差异表达的miRNAs共59个,约占所有预测的miRNAs（190个）的31.05%,其中有33个是上调表达,26个下调表达。对其差异表达miRNA的靶基因进行富集分析,发现富集较多的是代谢途径,显着富集的是代谢途径中的ABC转运、类胡萝卜素的生物合成、植物激素信号转导、N-聚糖生物合成等,表明miRNAs的调控由多种代谢途径共同参与,miRNAs可能在落叶松的生长发育、胁迫响应等不同生命过程中发挥着重要的作用。（3）落叶松miRNAs的表达分析。在不同的胁迫处理下,大多数miRNAs都能够响应干旱、盐碱胁迫。其中novelmiR63在PEG6000和NaCl胁迫时快速响应,利用不同激素处理后,发现novelmiR63（Lol-miR11467）均能够响应激素应答,novelmiR63与miRBase数据库比对发现,与云杉的miR11467相似度较高,其靶基因注释为生物保护性大分子蛋白之一的热激蛋白,在干旱胁迫中具有一定的调控作用。将其作为候选基因进行遗传转化,并命名为Lol-miR11467。（4）Lol-miR11467在落叶松中的遗传转化。利用农杆菌介导法将Lol-miR11467转入杂种落叶松的胚性愈伤组织中,获得抗性愈伤细胞系27个。将转基因细胞系与野生型细胞系分别放于含有20%PEG6000、50 mM NaHCO3和250 mM NaCl的培养基中,在不同的胁迫处理下,转基因细胞系的POD活性均低于野生型,MDA含量均高于野生型,可溶性蛋白含量均低于野生型,推测Lol-miR11467在落叶松中具有一定的负调控干旱、盐碱胁迫的能力。（5）Lol-miR11467靶基因筛选。3个转基因细胞系的差异基因GO和KEGG富集分析表明,由Lol-miR11467转入后引起的差异基因显着富集在次生代谢的生物合成、激素响应、类黄酮生物合成以及苯丙烷生物合成,表明Lol-miR11467可能在落叶松中响应胁迫、激素等外界刺激以及次生代谢和苯丙烷生物合成的代谢途径中发挥着很重要的作用。对3个转基因细胞系共有的差异基因进行深入挖掘,发现MYB、bHLH、NAC、WRKY等转录因子类,LEA、热激蛋白等生物保护性大分子类以及糖基转移酶、半乳糖苷酶等糖代谢相关的酶类以及与miRNA自身相关的AGO蛋白等和抗旱相关基因的下调表达,推测过表达Lol-miR11467可以通过负调控这些基因的表达而使落叶松抵抗干旱胁迫的能力降低。以抗性愈伤组织转录组的差异基因序列作为参考序列,对Lol-miR11467进行靶基因预测,预测到4条与干旱胁迫相关且下调表达的靶基因。综上所述,本研究通过杂种落叶松遗传转化体系的构建及干旱胁迫下的差异miRNAs分析,获得转Lol-miR11467基因的抗性细胞系,其生理指标检测表明转基因细胞系的抗旱能力减弱,最终找到了可能与落叶松抗旱性减弱相关的4条Lol-miR11467的靶基因。本研究为落叶松或针叶树的遗传转化及miRNAs的分子机理研究奠定基础。
王明清[2]（2020）在《‘凤丹白’牡丹遗传转化体系的研究》文中研究表明凤丹白（Paeonia.ostii）牡丹不仅具有很好的观赏与药用价值,还有较高的油用价值。因牡丹繁殖周期长、系数低,牡丹新品种培育受到传统育种方式的限制。再生体系的研究为牡丹的高效育种提供可行方法,遗传转化的研究为牡丹性状改良奠定了基础。目前牡丹遗传转化仍存在再生体系不稳定,转化效率低等问题。本实验以牡丹成熟种胚和无菌子叶为实验材料,进行愈伤组织的诱导、成熟以及分化研究,以转化载体含甜菜红素生物合成基因,对牡丹进行农杆菌转化和转化条件筛选,构建糖皮质激素诱导的成胚双元载体,并对牡丹子叶进行农杆菌转化。本实验的主要研究结果如下:1.本实验中,种胚萌发率为92%,加入腐胺可促使胚苗强壮,也有利于生根。500mg/LGA3浸泡种子48h后,剥取种胚到萌发培养基:改良MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+Put1.0mg/L,可有效破除休眠。胚苗生长培养基:改良MS+6-BA0.5mg/L+GA30.2mg/L+Put 1.0mg/L。2.诱导愈伤组织试验材料为种胚和子叶,种胚诱导愈伤组织培养基为:改良MS（蔗糖100g/L）+6-BA0.5mg/L+PIC2.0mg/L,愈伤组织诱导率为95%;子叶诱导愈伤组织培养基为:改良MS（蔗糖100g/L）+6-BA0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L,愈伤组织诱导率为68.7%。3.将获得愈伤组织成熟培养25-30d,愈伤组织呈现鹅黄色或白色明显颗粒状。成熟培养基:改良MS（蔗糖30g/L）+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+TDZ 0.3mg/L+ZT0.5mg/L;种胚分化率可达到54.5%,子叶愈伤也有少量不定芽生成。愈伤分化阶段加入0.5mg/L的玉米素,可促进愈伤分化,浓度过高会导致畸形。诱导不定芽分化培养基:改良MS（蔗糖30g/L）+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+ZT0.5mg/L。4.本实验转化载体含甜菜红素生物合成基因,侵染子叶可获得表达红色性状的抗性愈伤,转化率达到29.1%;侵染种胚愈伤组织,也有红色抗性愈伤生成,转化率为5.8%。表明目的基因整合到组织细胞内,且成功表达。5.本实验通过构建一种以DEX诱导的成胚双元载体p YB9664,通过农杆菌侵染无菌子叶获得少量抗性子叶胚,初步证明该载体确实可以诱导胚胎发生。
张耀[3]（2020）在《农杆菌介导的落叶松干细胞转基因标准化平台建立及LaAGL2-2的分离与转化》文中进行了进一步梳理落叶松是我国重要的针叶用材树种之一,利用分子育种手段对落叶松进行遗传改良,建立高效的人工林对落叶松产业的发展具有重要的意义。但目前落叶松的遗传转化技术仍然存在着不统一,稳定性差的问题,这主要是由落叶松易转化细胞系的缺乏,受体材料选择压使用不明确及转化条件没有标准化等因素造成。本研究以落叶松干细胞为材料,基于落叶松体细胞胚胎发生技术和农杆菌介导法,探究落叶松遗传转化过程中的影响因子,建立落叶松转基因标准化平台,提高落叶松遗传转化的效率和稳定性,并在此基础上筛选具有调控落叶松生长发育潜能的MADS-box基因,进行转化验证,为利用基因工程育种创制新种质对落叶松进行遗传改良提供良好的平台。主要研究结果如下:（1）利用不同浓度的Hyg（Hygromycin B）、Cef（Cefotaxime）对落叶松胚性细胞系进行抗生素选择压的筛选,结果显示:Hyg能显着抑制落叶松胚性细胞的生长,当Hyg浓度为3 mg/L时,细胞系X228已基本不再增殖;当Hyg浓度为5 mg/L时,细胞系X31和X268不能再进行增殖。最适合落叶松胚性细胞生长的Cef的浓度为300-500 mg/L,在此Cef浓度下,落叶松胚性细胞的增殖速率加快。（2）通过对9个不同基因型的落叶松胚性细胞系进行增殖能力、成熟体细胞胚诱导率、生根率及转化率的筛选,结果表明,细胞系X31、X228、X268具有较强的再生能力和较高的转化率,符合落叶松易转化细胞系的要求,适宜作为遗传转化的受体材料。（3）通过设置农杆菌浓度为OD600=0.1、0.3、0.5、0.7,侵染时间为10 min、20 min、30 min,共培养时间为1 d、2 d、3 d,和Cef的浓度为300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L,恢复培养的时间为5 d、7 d、9 d进行落叶松遗传转化条件的优化来探索遗传转化的标准条件,结果表明,当农杆菌的浓度为OD600=0.1,侵染时间为10 min,且共培养48 h时,具有最高的转化率;Cef的最适脱菌浓度为400 mg/L,恢复培养的最佳时间为7 d,基于此转化条件我们的转化率达到2.0个/g。（4）对实验室之前得到的27个转录本进行生物信息学分析和基因克隆,共得到20个转录因子,其中多数属于MADS-box家族。GO注释分析表明,它们大部分与植物的生殖发育相关,q RT-PCR的结果显示,LaAGL2-1、LaAGL2-2、LaAGL2-3、LaSOC1-1、LaAGL11、LaAP2-2的表达模式呈现出年龄依赖性,且在无性繁殖过程中表达模式发生了改变,在落叶松从幼年生长阶段向成年生殖生长阶段的转变中发挥着调控作用,具有促进落叶松速生的潜能。进一步利用本文建立的落叶松转基因标准化平台对这些基因进行遗传转化,成功获得了转基因阳性细胞系,证明了落叶松转基因标准化平台的稳定性。综上所述,我们建立了落叶松转基因标准化平台,提高了落叶松遗传转化的效率和稳定性,筛选出了具有速生潜力的目标基因,为利用遗传转化创制落叶松新种质提供了一个高效、稳定的体系。
李亦轩[4]（2019）在《油松体胚发生优化与遗传转化的初步研究》文中认为油松（pinus tabulaeformis C.）具有耐瘠薄、抗风,适应恶劣环境能力强等特点,是华北,西北及东北地区主要的造林树种。油松虽然用途广泛,但是由于油松的繁殖效率低,生长周期长,且有性繁殖后代变异较大,所以有关该树种的快速繁殖技术仍停滞不前。而有关针叶树繁育技术的研究中,体细胞胚胎发生是大规模繁殖的有效方法之一,本研究以油松为试验材料,在前期建立的油松体胚发生体系基础上,在新细胞系筛选、胚性细胞增殖、体胚成熟等环节分析影响这些环节的各个因素,进一步提高效率,优化体胚体系;并基于体胚体系进行遗传转化的初步研究,以期为油松优良种质的大规模繁殖和重要基因的功能研究提供技术支撑。主要研究结果如下:（1）选用油松未成熟合子胚为外植体材料,诱导新的油松胚性细胞系,增多胚性细胞系的总量。共获得17个胚性细胞系,其中15c4b,16c4g,17c4c是3个有潜力进行大规模繁殖的细胞系。（2）基于气动生物反应器建立了油松胚性愈伤组织高效增殖体系。结果表明气动生物反应器中每100 mL液体培养基内接种胚性愈伤10g,2,4-D 0.2 mg·L-1保留20 mL的旧培养基时能使胚性愈伤增殖率达到最高,可达216.18%,比同期悬浮培养高3.15倍。（3）优化了油松体胚的成熟培养基。选用胚性较好的细胞系15c4b为材料,研究了 ABA浓度、PEG浓度、糖的种类和浓度、以及植物凝胶的浓度对胚性愈伤组织成熟的影响。最终结果显示:成熟培养基中ABA浓度16 mg·L-1、PEG浓度75 g·L-1、植物凝胶浓度5 g·L-1、麦芽糖和蔗糖浓度10+30 g·L-1时,油松体细胞胚的成熟效率提高了 0.8倍。（4）初步探索了油松的遗传转化。使用油松固体愈伤组织和液体悬浮组织进行遗传转化研究,研究结果显示Kan=50-75 mg·L-1对于转化是有利的,当OD值在0.4-0.6之间,侵染时间为5-15 min,共培养时间为48 h时,农杆菌与胚性愈伤组织状态良好,能够得到GUS染色为阳性的愈伤组织。
李哲馨[5]（2017）在《过表达LaMIR166a在落叶松ESMs成胚发育及其萌发过程中的功能研究》文中认为落叶松体细胞胚再生体系是对针叶树进行分子遗传改良、研究裸子植物早期发育调控和形态发生的理想模式系统。然而在实践中仍然存在体细胞胚畸形率高、萌发率低等问题。前期研究发现,过表达miR166a前体基因LaMIR166a后,落叶松体细胞胚顶端发育异常,这与生长素极性运输抑制剂N-1-萘基酞氨酸（N-1-naphthylphthalamic acid,NPA）处理的结果类似,表明miR166及其目标基因LaHDZ31-34与生长素信号途径共同参与调控落叶松体细胞胚形态建成。本研究以落叶松胚性细胞系S287为受体材料,通过过表达LaMIR166a研究了胚性胚柄团（Embryogenic Suspensor Mass,ESMs）成胚发育以及体细胞胚萌发过程中miR166a的功能,发现该过程中miR166a对生长素信号途径存在的调控作用。主要研究结果如下:（1）采用农杆菌介导的遗传转化方法,将LaMIR166a的过表达载体稳定转化落叶松ESMs,筛选出6个抗性细胞系,并获得qRT-PCR验证。与野生型相比,过表达LaMIR166a表现为落叶松ESMs增殖速率减慢、子叶胚畸形子叶数目增多、萌发率增加以及转化植株侧根数目增加等。（2）在鉴定出落叶松IAA信号途径相关基因LaNIT和LaARF基础上,对它们的的表达模式进行分析。发现LaNIT和两个LaARF基因在落叶松体细胞胚发育过程的早期发育阶段上调表达。IAA检测结果显示,在此过程中IAA含量上升。表明落叶松体细胞胚发育的早期阶段,LaNIT参与了IAA的生物合成,且IAA信号通路在这个过程中发挥重要作用。（3）qRT-PCR结果显示,LaNIT与LaHDZ31-34表达模式相吻合,均在胚胎发育早期表达急速上调,说明LaHDZ31-34对LaNIT可能存在正向调控。同时发现miR166a与LaHDZ31-34在体细胞胚发育过程中不呈现完全负调控的表达模式,暗示miR166a对LaHDZ31-34的调控作用具有发育阶段特异性。（4）提出了miR166a/HDZIPⅢ调控落叶松体细胞胚萌发的网络模型。揭示了HDZIPⅢ在转录后受到miR166a的调控,并正向调控LaNIT的表达,影响IAA的合成,进而引起LaARF1和LaARF2表达的改变,调控落叶松体细胞胚的萌发。（5）采用农杆菌介导的遗传转化方法,将LaMIR166a的过表达载体转化烟草,qRTPCR筛选后获得3个转基因株系。表型分析发现转基因植株主根长度、基部直径、侧根密度、茎基部直径以及茎节间长度均显着高于野生型;茎部切片、根部压片和显微观察显示,过表达LaMIR166a明显促进茎部木质部的形成和发育,根毛数量增多、根毛增长、形态弯折等。（6）针对LaMIR166a及其目标基因LaHDZ31分别构建了两个CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,共获得了33个抗性细胞系。经HPT PCR检测,确定这些CRISPR/Cas9表达载体均已成功转化落叶松胚性细胞系。对pZJP15载体抗性细胞系进行酶切验证,结果呈阳性;需要进一步测序验证。综上所述,miR166/HD-ZIPⅢ在落叶松体细胞胚发生中发挥了重要的调控作用,研究结果为进一步研究裸子植物体细胞胚发育的分子调控机理以及获得高效稳定的干细胞繁育体系提供科学依据。
梁芬[6]（2016）在《抗松材线虫病黑松体细胞胚胎发生及植株再生体系研究》文中提出松材线虫病是危害松属树种的一种毁灭性病害,对我国林业生产和生态环境造成很大影响。黑松是易感病树种,受到松材线虫病的严重危害。通过抗病选育建立了种子园,但种子数量有限,不能满足生产所需,开展离体组织培养相关抗病育种技术研究,可为抗性优良基因型快速繁殖及其产业化提供技术支持。本文以抗松材线虫病黑松（抗性黑松）未成熟合子胚为外植体,对体细胞胚胎发生与植株再生过程（ESM诱导和增殖、体胚诱导与成熟、体胚萌发与植株再生）及相关影响因素进行研究,主要研究结果如下:1抗性黑松胚性愈伤组织诱导以抗性黑松未成熟合子胚为外植体,在添加了一定浓度生长素2,4-D、细胞分裂素KT、6-BA的培养基上进行胚性愈伤组织诱导。结果表明,黑松合子胚发育至2-4阶段,诱导率较高;不同家系球果最佳采集日期不同,39#、37#家系于7月1日左右为最优采集期、36#家系则为7月8日左右;不同家系之间胚性愈伤组织诱导率不同,诱导率由高到低依次为36#、37#、34#、39#、35#,诱导率分别为2.5%、2.5%、1.5%、1.5%、1%。2抗性黑松胚性愈伤组织增殖与维持以前期诱导所得胚性愈伤组织为材料,对增殖阶段的主要影响因素进行研究。结果表明,不同胚性细胞系对2,4-D、NAA的适应性不同:34#-1、37#-1所需生长素最佳浓度为0.5 mg/LNAA,36#-2为2 mg/L 2,4-D,39#-1为1 mg/L 2,4-D;各胚性细胞系增殖阶段的生长曲线基本为“S”型,生长率最大值出现在5-10d之间,继代培养15d后,生长基本趋于停滞,最佳继代周期为次/2周。3抗性黑松体细胞胚的诱导与成熟选取增殖状态良好的愈伤组织,以DCR为基本培养基,比较了不同浓度麦芽糖、肌醇、ABA、PEG和GA对抗性黑松体细胞胚诱导与成熟的影响。结果表明,麦芽糖浓度为45 g/L,肌醇浓度为4-6 g/L时,体细胞胚发育最好;GA3对体细胞胚诱导作用优于GA4+7,且最佳浓度为0.5-1g/L;10-15 mg/L ABA、100-140 g/LPEG处理,对体细胞胚的成熟与发育最好。4抗性黑松体细胞胚的萌发与植株再生以抗性黑松胚性细胞系39#-1成熟阶段发育良好的体细胞胚为材料,研究了麦芽糖和活性炭对体细胞胚萌发与植株再生的影响,结果表明,麦芽糖和活性炭最适浓度分别为20g/L、1-2 g/L,能够促进抗性黑松体细胞胚子叶、胚轴以及胚根的形成,有利于体细胞胚的萌发。
吴丽君[7]（2008）在《湿地松、火炬松离体培养植株再生技术的研究》文中认为湿地松、火炬松自上世纪30年代引种至今,两树种已成为我国南方地区大面积造林的主要经济树种。然而,其相对滞后的良种繁育技术仍然制约着两个树种的发展。本研究以湿地松、火炬松不同组织器官为材料,对其直接器官发生、间接器官发生、直接体胚发生等离体培养快繁技术进行系统研究,以建立高效、稳定的湿地松、火炬松离体培养植株再生体系,为其它针叶树种的组培快繁技术提供借鉴。研究的主要内容及结果以下:一.湿地松直接器官发生与植株再生技术以湿地松（Pinus elliottii Engelm）抗病家系和非抗病家系的成熟合子胚为外植体,以不同基本培养基、激素种类及浓度配比和不同的培养方式,研究湿地松离体培养继代增殖的关键技术及主要影响因子。研究结果表明湿地松家系或基因型、继代代数及激素种类浓度的配比是湿地松组培继代增殖效率的主要影响因子。湿地松组培快繁的最佳增殖培养基为B5+6-BA2.0mg/L+IBA0.1mg/L,年增殖率可达3.696.2。利用家系间或家系内个体间增殖率的显着差异,筛选了适宜组培快繁的普通家系优良基因型132个、抗病家系优良基因型2个。通过固体培养与添加液体营养液的双层培养基的培养方式解决了湿地松继代增殖率与有效芽苗率的消长问题,有效缩短了继代周期,简化了培养程序。生根培养阶段,通过对培养基大量元素浓度水平的对比试验,结果表明生根培养初期以无大量元素培养基诱导生根,25d后添加大量元素的培养程序可有效缩短生根培养时间,提高生根率,达到理想的生根效果。本研究基本解决了湿地松长期继代增殖及生根技术问题,建立了稳定的离体快繁增殖及生根体系。但该培养技术的产业化应用还需进一步的中试及相关操作工艺设备的改进,以降低组培苗的生产成本。二、湿地松间接器官发生与植株再生技术以湿地松成熟合子胚、胚苗顶芽、下胚轴、胚根为外植体,选用低盐量的DCR、LP、TX 3种基本培养基,与不同浓度NAA、2,4-D及不同浓度6-BA组合,研究湿地松器官性愈伤组织诱导、增殖及器官分化培养阶段的关键技术。试验结果表明:成熟合子胚、胚苗顶芽是诱导器官性愈伤组织理想的外植体,诱导器官性愈伤组织的最佳培养基为TX+BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+30 g/L蔗糖,诱导率高达50%以上;增殖培养基为TX+BA 0.3 mg/L+NAA 1.0 mg/L+CH 400 mg/L+30 g/L蔗糖,继代周期25～30d,增殖率达3.46;器官分化培养基为TX+BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖,每块愈伤组织可分化20个以上不定芽;不定芽的同步化发育培养基为TX+BA 0～0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖;NAA是器官性愈伤组织诱导、增殖必不可少的生长素。湿地松间接器官发生程序复杂,但其增殖效率远远高于直接器官发生效率。组织细胞学研究结果表明:亮白色、半紧实结构的外部形态及大量“拟分生组织”的内部结构的形成是器官性愈伤组织的重要标志。不定芽原基的分化发育过程约为40～45d。三、湿地松体细胞胚胎发生以湿地松成熟合子胚及未成熟合子胚为外植体,对影响湿地松体胚诱导、ESM维持与增殖培养及体胚成熟等关键技术环节的主要因素进行系统研究。研究结果表明:多胚特征的合子胚发育阶段是湿地松体胚诱导最理想的外植体,即发育第2、3、4阶段的合子胚。基本培养基、激素种类浓度组合及两因素的交互作用对ESM诱导率及外植体褐化率均有极显着影响,湿地松体胚发生最佳培养基激素组合为LP+ 2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L和DCR+ NAA2.0 mg/L +6-BA0.63 mg/L+KT0.61mg/L,4个家系在两种培养基ESM平均诱导率分别为24%和22.75%。球果短时间冷藏处理、雌配子体“倾斜接种”方式以及在培养基添加乙烯抑制剂及pH缓冲液均有利于提高湿地松体胚诱导率,采用国产琼脂代替进口Phytagel作为植物凝胶剂可起到同样的诱导效果。ESM维持培养阶段,胚性组织胚性的失去或因生长势的衰弱而死亡是针叶树种体胚发生的普遍现象。通过对培养基与激素组合的优化获得了4个可长期快速增殖的胚性细胞系,DCR+NAA 1.0 mg/L +6-BA 0.32 mg/L + KT 0.30 mg/L为湿地松ESM的最佳增殖培养基。生长素是维持胚性的极性结构所必需的,但高浓度的生长素对体胚的生长、发育成熟不利,尤其是高浓度2,4-D可能导致体胚的畸形。添加AC的无激素预培养是体胚发育成熟的必要条件。ABA是体胚从增殖到成熟转化的关键因素。外源ABA与PEG和高浓度蔗糖的组合进一步促进了体胚的发育成熟,湿地松体胚在成熟培养基PL+ABA 50 mg/L+PEG6000 20%+6%蔗糖上获得了发育5阶段的子叶胚。四、火炬松体细胞胚胎发生以火炬松优良家系20-692、20-615、20-1036、20-639不同球果采收期合子胚为外植体,选用4种针叶树体胚发生专利培养基AL、TX、LP、DS分别与AL、TX、LP培养基激素组合及无激素组合形成16种体胚诱导培养基,开展火炬松体胚诱导试验。研究结果表明:体胚诱导最理想的外植体为第2、3、4发育阶段合子胚。外植体基因型是影响体胚诱导率的关键因素,通过培养基、激素组合及其它培养条件的优化是打破离体培养顽拗型基因型限制的有效措施。LP+2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L、AL+2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L培养基可获得较高的体胚诱导率,且体胚质量高。不同的胚性细胞系对体胚成熟培养反应不同,只有具有完整体胚的培养物转入成熟培养基,体胚才能进一步的发育成熟。火炬松胚性细胞系AL-225经无激素培养基预培养后转入AL+ABA 50 mg/L+15%PEG8000的成熟培养基,体胚得以进一步的发育,但未能获得完全成熟体胚。以火炬松成熟合子胚为外植体获得了可持续增殖的ESM。但成熟合子胚体胚诱导率仅为3%,远远低于非成熟合子胚诱导率。但成熟合子胚体胚发生技术仍具有重要的研究价值。
金双侠[8]（2006）在《棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制》文中认为棉花是重要的经济作物，利用遗传工程技术改良棉花品种能够提高棉花的种植效益。然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多障碍，主要表现在棉花体细胞胚胎发生对基因型依赖性很强、周期长、导致再生植株的体细胞变异很严重；棉花遗传转化技术的复杂性（难重复、转化率低）和转基因棉花的农艺性状的变异等等，这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的瓶颈。本研究内容主要涉及棉花高体细胞胚胎发生能力基因型的筛选、棉花体细胞无性系变异研究、高效棉花遗传转化体系的建立，棉花胚芽为转化受体的新的转化方法以及一个小型的promoter-trap插入突变体库的建立，旨在为转基因棉花育种、功能基因组研究提供理论指导。主要研究结果如下： 1 对三十个优良棉花基因型进行离体培养，系统地比较了它们的体细胞胚胎发生能力。筛选到两个体细胞胚胎发生能力明显高于珂字棉的基因型一‘豫668’和‘豫早1号’，这两个基因型能够在两个月内获得高频率的体细胞胚胎发生，为棉花的遗传工程的发展拓宽了受体范围。 2 棉花体细胞无性系变异的研究。利用细胞学压片、流式细胞仪检测及RAPD技术对棉花体细胞胚胎发生获得的再生植株的遗传稳定性进行了评估，研究发现随机挑选的14个再生植株的DNA倍性、染色体数目没有发生变异，而利用187条RAPD引物对再生植株进行检测发现50％再生植株（14株中的7株）存在RAPD扩增多态性，这意味着细胞学水平的遗传变异与DNA水平的遗传变异没有必然联系。在国际上首次利用RAPD和SSR技术对2，4-D+KT和IBA+KT这两种激素组合诱导的胚性愈伤的遗传稳定性进行了检测。发现两者诱导的胚性愈伤组织胚胎发生能力没有明显差异，但2，4-D+KT组合诱导到的胚性愈伤组织在DNA水平上的变异程度要比IBA+KT组合诱导的胚性愈伤组织高。 3 农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系的优化及以GFP为报告基因对棉花下胚轴遗传转化的观察。 预培养15d的棉花胚性愈伤组织是较好遗传转化受体材料，对转化的影响因子进行比较实验，结果表明利用OD值为0.5的农杆菌菌液，在共培培养基中加入50mg／L的乙酰丁香酮，19℃下，暗培养48小时，用100mg／l的卡那霉素进行选择，400mg／l的头孢霉素抑制农杆菌的生长能够获得较高的转化效率。利用这些参数转化能够使胚性愈伤组织转化率达到15.0％左右。 为了克服棉花转基因植株移栽困难的不利影响，建立了一种新的试管苗嫁接移栽技术。以棉花去壳种子消毒后在培养基中萌发的无菌苗作为砧木，在无菌条件下，
陈莉[9]（2006）在《甜玉米再生能力的遗传多态性分析》文中指出组织培养及其植株再生是植物基因工程的一个关键环节,对于作物改良具有重要意义。组织培养技术在玉米转基因育种中受到重视,而其培养能力又受遗传因素的控制,因而了解并掌握玉米组织培养能力的遗传规律已成为当务之急。本研究对茎尖、成熟胚、幼胚三种外植体的再生培养方法优化后,利用以甜玉米为主的45种玉米基因型的不同外植体进行组织培养,考察其体细胞再生能力的差异,然后根据禾谷类作物基因组存在共线性的原理,利用与水稻再生能力相关的OS22A的cDNA序列设计引物,对其不同基因型玉米的DNA进行扩增、电泳和软件分析,以期在基因组水平上对玉米再生能力的遗传特性进行分析并予以一定的解释。主要结果如下:1.玉米茎尖分生组织在添加不同浓度6-BA（6-苄基腺嘌呤）的MS培养基上,经过四周愈伤组织诱导培养和四周芽发育培养,获得高频率的丛生芽和再生植株,芽尖倍增数可达3～8芽/茎尖。通过比较试验,反映了不同基因型的茎尖形成愈伤组织和再生植株能力不同,确立了诱导丛生芽发生的适宜培养条件和程序。2.以成熟胚和茎尖为试材,比较了它与茎尖的培养特性。结果发现玉米的成熟胚和茎尖愈伤诱导率相关,但两种外植体诱导出的愈伤组织状态明显不同,茎尖诱导出的愈伤组织状态普遍比成熟胚的好;两种外植体的愈伤分化率差异明显,成熟胚愈伤组织最高分化率为2.13%,茎尖愈伤组织最高分化率可达21.2%。3.以幼胚为材料,对其愈伤组织诱导,继代培养和分化进行系统的研究,发现不同的培养添加物对幼胚愈伤组织生长状况有明显的影响,L-Pro有利于玉米愈伤组织诱导且质量较好;AgNO3不能替代L-Pro在玉米愈伤组织诱导及分化中所起的作用。4.以45种甜玉米为材料,对成熟胚愈伤组织的诱导和继代培养、植株再生、再生苗移栽等方面进行了研究。45种基因型玉米成熟胚经诱导多可产生愈伤组织,但各种基因型之间愈伤组织诱导率差异较大,变异范围为0～100%。不同基因型愈伤组织的增殖力也有显着差异。对愈伤组织状态进行了分类。研究了出愈率、克隆力、芽点数与植株再生的关系,结果表明出愈率与再生能力有较大的相关性,克隆力、芽点数次之。利用主成分坐标分析并在此基础上对不同基因型甜玉米的再生能力进行聚类,并按欧式距离将45种不同基因型玉米划分为2个大组群。5.采用21种不同基因型的甜玉米,以成熟胚和幼胚两种不同外植体,对愈伤组织的诱导和继代培养、植株再生等方面进行了系统的研究。结果表明:玉米的成熟胚和幼胚愈伤诱导率相关,但两种外植体诱导出的愈伤组织状态明显不同,幼胚诱导出的愈伤组织状态普遍比成熟胚的好;两种外植体的愈伤分化率差异明显。6.根据甜玉米成熟胚和幼胚各自的再生能力的表型数据分别对21材料进行聚类,将供试的材料划分为三个群,第一群出愈率、分化率均较高;第二群特点是出愈率较高,分化率很低或为零;第三群
张宇[10]（2006）在《三种针叶树种遗传转化受体系统的建立及农杆菌介导的遗传转化研究》文中认为马尾松和杉木为我国东部主要的常绿针叶树,也是重要的造林和经济用材树种;杂交松是通过基因重组培育出来的松树杂种,杂种优势极为突出,是值得大力推广的优良树种。开展细胞组织培养及遗传转化研究,对它们的快速繁育、良种选育和抗病虫害研究工作都具有重要的理论意义与实践价值。以马尾松、杂交松和杉木三种针叶树种不同种源基因型的不同外植体进行了再生能力的比较,系统分析了不同基本培养基、不同植物生长调节剂及其浓度对不定芽和不定根诱导效率的影响,优化了各个树种体外植株再生的适应条件;并研究探索了以马尾松初生茎顶组织和杉木茎段为受体材料进行的农杆菌介导的遗传转化,系统研究了抗生素、预培养和共培养时间、侵染菌液浓度及时间、添加乙酰丁香酮及筛选方式等因素对转化效率的影响。主要得到了如下结果及创新进展:①建立了马尾松成熟合子胚及初生茎顶组织的高效器官发生和植株再生体系;②采用初生茎顶组织再生体系为受体系统,首次进行了马尾松的遗传转化研究并得到了初步结果,建立了一个新的农杆菌介导的针叶树种遗传转化体系;③首次建立了杂交松成熟合子胚、子叶及茎段的高效再生体系;④研究建立了杉木成熟合子胚、茎段的高效再生体系并首次由杉木茎段诱导出直接体细胞胚胎发生;⑤利用杉木茎段再生体系为受体系统,进行了杉木的遗传转化研究并得到了初步结果。
二、提高玉米胚性细胞系诱导再生植株的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、提高玉米胚性细胞系诱导再生植株的研究（论文提纲范文）
（1）杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 针叶树体胚发生研究进展 |
| 1.2.1 胚性愈伤组织的诱导 |
| 1.2.2 胚性愈伤组织的增殖及继代 |
| 1.2.3 体胚成熟 |
| 1.3 落叶松体胚发生研究进展 |
| 1.4 针叶树的遗传转化研究 |
| 1.4.1 针叶树的遗传转化 |
| 1.4.2 落叶松的遗传转化 |
| 1.5 miRNA的研究进展 |
| 1.5.1 miRNA的发现 |
| 1.5.2 miRNA的作用机理 |
| 1.5.3 植物miRNA的功能研究 |
| 1.5.4 miRNA在针叶树及落叶松中的研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 2 杂种落叶松遗传转化体系的建立与优化研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验菌株、药品与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 药品及培养基的制备 |
| 2.2.2 外植体的消毒及接种 |
| 2.2.3 胚性愈伤组织的诱导 |
| 2.2.4 胚性愈伤组织的增殖及继代周期的确定 |
| 2.2.5 体细胞胚胎成熟及萌发 |
| 2.2.6 抗生素敏感性试验 |
| 2.2.7 胚性愈伤组织的遗传转化 |
| 2.2.8 统计及分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 再生体系的优化 |
| 2.3.2 遗传转化体系的建立及优化 |
| 2.3.3 转pCAMBIA1301空载体株系的分子验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 外植体选择对诱导率的影响 |
| 2.4.2 植物生长调节剂对诱导的影响 |
| 2.4.3 胚性愈伤组织的增殖培养 |
| 2.4.4 农杆菌介导的遗传转化的影响因素 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 干旱胁迫下的落叶松小RNA挖掘与分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小RNA文库的构建及质量控制 |
| 3.2.2 miRNA预测及鉴定分析 |
| 3.2.3 miRNA差异基因聚类及表达分析 |
| 3.2.4 miRNA靶基因预测及功能注释分析 |
| 3.2.5 sRNA测序数据的验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 小RNA文库的构建及质量分析 |
| 3.3.2 小RNA序列分析 |
| 3.3.3 miRNA预测及筛选 |
| 3.3.4 sRNA测序的数据验证 |
| 3.3.5 miRNA靶基因预测及其功能注释 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 miRNA响应不同处理的表达模式分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试剂及药品 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 miRNA提取及反转录 |
| 4.2.2 miRNA的qRT-PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 miRNA在不同胁迫处理下的表达分析 |
| 4.3.2 miRNA在不同激素处理下的表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 miRNAs在不同胁迫处理下的表达分析 |
| 4.4.2 miRNA在不同激素处理下的表达分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 Lol-miR11467在落叶松中的遗传转化研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株、试剂及药品 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 pCAMBIA1301-Lol-miR11467的过表达载体构建 |
| 5.2.2 转pCAMBIA1301-Lol-miR11467基因株系的分子检测 |
| 5.2.3 不同胁迫处理的转基因愈伤组织的形态变化 |
| 5.2.4 不同胁迫处理的转基因愈伤组织生理生化指标的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.0 转基因细胞系的检测 |
| 5.3.1 不同胁迫处理下转基因愈伤组织的变化 |
| 5.3.2 不同胁迫处理的转基因愈伤组织生理生化指标的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 Lol-miR11467的靶基因筛选与分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 转录组测序及生物信息学分析 |
| 6.2.2 qRT-PCR验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 测序数据质量评估及组装 |
| 6.3.2 差异表达基因筛选 |
| 6.3.3 转录组数据验证 |
| 6.3.4 Unigene功能注释 |
| 6.3.5 差异表达关键基因的挖掘及归纳 |
| 6.3.6 Lol-miR11467靶基因筛选 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（2）‘凤丹白’牡丹遗传转化体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 外植体的选择 |
| 1.2.2 培养基选择 |
| 1.3 牡丹再生途径 |
| 1.3.1 愈伤组织的诱导 |
| 1.3.2 器官发生途径 |
| 1.3.3 体细胞胚发生 |
| 1.3.4 胚胎发生分子机制 |
| 1.4 遗传转化技术与诱导表达载体 |
| 1.4.1 遗传转化技术 |
| 1.4.2 诱导型表达系统 |
| 1.4.3 地塞米松诱导系统原理 |
| 1.4.4 地塞米松系统的应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 凤丹白再生体系的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 培养基及培养条件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 材料消毒 |
| 2.2.2 种胚萌发 |
| 2.2.3 诱导愈伤组织 |
| 2.2.4 愈伤组织分化实验 |
| 2.2.5 不定芽培养 |
| 2.2.6 生根诱导 |
| 2.2.7 移栽 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 种胚萌发 |
| 2.3.3 不同外植体诱导愈伤组织 |
| 2.3.4 愈伤分化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 2.5.1 凤丹白种胚离体培养 |
| 2.5.2 凤丹白胚性愈伤组织的诱导 |
| 2.5.3 胚性愈伤组织的分化 |
| 第3章 凤丹白遗传转化的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 培养基及溶液准备 |
| 3.2 愈伤组织转化 |
| 3.2.1 子叶和愈伤组织预培养 |
| 3.2.2 筛选剂与抑菌剂 |
| 3.2.3 农杆菌的活化培养 |
| 3.2.4 侵染方式的筛选 |
| 3.2.5 农杆菌侵染愈伤组织 |
| 3.2.6 共培养后处理 |
| 3.2.7 筛选培养 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 子叶和胚性愈伤组织的预培养 |
| 3.3.2 筛选剂的选择与浓度确定 |
| 3.3.3 农杆菌浸染浓度与浸染时间的确定 |
| 3.3.4 共培养后延迟培养 |
| 3.3.5 转化筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 双元载体构建与遗传转化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 农杆菌菌株及质粒 |
| 4.2 双元载体pYB9664 的构建 |
| 4.2.1 BoBBMS和 GRLBDS基因合成 |
| 4.2.2 BoBBMS和 GRLBDS基因片段回收 |
| 4.2.3 双元载体的构建 |
| 4.2.4 高效根癌农杆菌的电击转化 |
| 4.3 凤丹白牡丹pYB9664 转化 |
| 4.3.1 凤丹白愈伤组织预培养 |
| 4.3.2 pYB9664 农杆菌活化培养 |
| 4.3.3 农杆菌侵染 |
| 4.3.4 侵染后处理 |
| 4.3.5 筛选培养 |
| 4.3.6 分化诱导 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 pYB9664 双元载体的构建 |
| 4.4.2 转化农杆菌的筛选 |
| 4.4.3 子叶转化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 凤丹白种子的离体培养 |
| 5.2 凤丹白胚性愈伤组织的诱导与分化 |
| 5.3 遗传转化体系的硏究 |
| 5.4 目的基因性状表达 |
| 5.5 双元载体pYB9664 的构建与转化 |
| 5.6 存在的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）农杆菌介导的落叶松干细胞转基因标准化平台建立及LaAGL2-2的分离与转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 国内外研究现状 |
| 1.3.1 落叶松遗传育种进展 |
| 1.3.2 裸子植物体细胞胚胎发生研究进展 |
| 1.3.3 落叶松体细胞胚发生研究进展 |
| 1.3.4 落叶松干细胞模型 |
| 1.3.5 针叶树遗传转化研究进展 |
| 1.3.6 影响农杆菌介导法转化效率的因素 |
| 1.3.7 针叶树的生长发育与相关基因的研究 |
| 1.4 研究的主要目标及内容 |
| 1.4.1 关键科学问题 |
| 1.4.2 研究目标及内容 |
| 1.5 研究技术路线 |
| 1.6 项目来源及经费支持 |
| 2 落叶松细胞系的抗生素敏感性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 抗生素与培养基 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 头孢霉素对落叶松细胞系生长的影响 |
| 2.2.2 潮霉素对落叶松细胞系生长的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 落叶松易转化细胞系的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验方法与设计 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 落叶松胚性细胞系的增殖 |
| 3.2.2 落叶松成熟体细胞胚的诱导和萌发 |
| 3.2.3 落叶松胚性细胞的转化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 落叶松转基因技术平台的标准化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 菌株与质粒 |
| 4.1.3 培养基与试剂 |
| 4.1.4 实验方法与设计 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 农杆菌浓度,侵染时间及共培养时间对遗传转化的影响 |
| 4.2.2 抑菌抗生素浓度和恢复培养时间的确定 |
| 4.2.3 抗性转化体的获得 |
| 4.2.4 抗性转化体的PCR检测 |
| 4.2.5 落叶松转基因技术的标准化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 受体材料对转化率的影响 |
| 4.3.2 农杆菌浓度,侵染时间和共培养时间与转化率 |
| 4.3.3 抑菌抗生素浓度及恢复培养时间与转化率 |
| 4.3.4 转化体的筛选方式与转化率 |
| 4.4 小结 |
| 5 落叶松 MADS-box家族 AGL2-2 的分离与转化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 落叶松不同年龄间差异表达基因的克隆与注释 |
| 5.2.2 落叶松不同年龄间差异表达基因的表达模式 |
| 5.2.3 年龄依赖性基因在修剪、扦插材料中的表达模式 |
| 5.2.4 年龄依赖性基因在嫁接材料中的表达模式 |
| 5.2.5 落叶松标准遗传转化技术的验证 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 落叶松的生长发育与年龄相关基因的关系 |
| 5.3.2 年龄依赖性基因与无性繁殖的年龄效应 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（4）油松体胚发生优化与遗传转化的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 油松树属简介 |
| 1.1.1 生物学特性和形态特征 |
| 1.1.2 生态习性和分布 |
| 1.1.3 应用价值 |
| 1.2 针叶树繁殖研究进展 |
| 1.2.1 营养繁殖 |
| 1.2.2 组织培养技术 |
| 1.2.3 体细胞胚胎发生 |
| 1.2.4 针叶树体胚成熟的研究进展 |
| 1.2.5 基于气动生物反应器的针叶树愈伤组织增殖体系的研究 |
| 1.2.6 有关成熟培养中影响因素的研究 |
| 1.2.7 针叶树遗传转化研究 |
| 1.3 存在的问题 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 主要研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线图 |
| 2 油松胚性细胞系的诱导 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 2017年和2018年诱导情况 |
| 2.1.4 数据统计与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 2017年油松胚性细胞系诱导率 |
| 2.2.2 2018年油松胚性细胞系诱导率 |
| 2.2.3 现有胚性细胞系统计 |
| 2.3 小结 |
| 3. 基于气动生物反应器的油松胚性愈伤增殖体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 油松ALB增殖体系的建立 |
| 3.1.3 液体培养基 |
| 3.1.4 反应体系试验方法 |
| 3.1.5 ALB体系与锥形瓶悬浮培养的胚性愈伤生长量对比 |
| 3.1.6 ALB体系与锥形瓶悬浮培养胚性愈伤pH值的对比 |
| 3.1.7 不同继代周期的胚性愈伤与增值率的关系 |
| 3.2 油松愈伤组织胚性结构形态检验 |
| 3.3 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 正交试验结果 |
| 3.4.2 ALB体系与锥形瓶悬浮培养的愈伤生长量对比 |
| 3.4.3 ALB体系与锥形瓶悬浮培养胚性愈伤pH值的对比 |
| 3.4.4 不同继代周期的胚性愈伤与增值率的关系 |
| 3.5 油松愈伤组织胚性结构形态检验 |
| 3.6 小结 |
| 4 影响油松胚性愈伤组织形成成熟胚的因素 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.2.1 愈伤组织的悬浮前处理 |
| 4.1.3 单因素试验 |
| 4.1.3.1 基础固体成熟培养基 |
| 4.1.3.2 固体成熟培养基中四种影响因素水平的设置 |
| 4.1.4 正交设计与验证 |
| 4.2 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 油松愈伤组织悬浮前处理生长观察结果 |
| 4.3.2 成熟培养基中ABA浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.3 成熟培养基中PEG浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.4 成熟培养基中植物凝胶浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.5 成熟培养基中糖的种类和浓度对愈伤组织成胚的影响 |
| 4.3.6 四种影响因素正交设计 |
| 4.3.7 优化培养基验证 |
| 4.4 小结 |
| 5 油松遗传转化的初步探索 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 侵染材料 |
| 5.1.1.2 质粒和菌株 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 菌液划板 |
| 5.1.2.2 摇菌与菌液浓度设定 |
| 5.1.2.3 侵染与共培养 |
| 5.1.2.4 水洗材料与转入筛选培养基 |
| 5.1.2.5 筛选培养基中选择压的确定 |
| 5.1.2.6 油松愈伤组织遗传转化反应体系试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 筛选培养基中选择压结果的确定 |
| 5.2.2 愈伤组织遗传转化初步研究结果 |
| 5.3 小结 |
| 6 讨论 |
| 6.1 油松体细胞胚胎发生中油松胚性细胞系的补充 |
| 6.2 基于气动生物反应器的油松胚性愈伤增殖体系的建立 |
| 6.3 影响油松胚性愈伤组织形成成熟胚因素的研究 |
| 6.4 关于油松愈伤组织遗传转化的初步研究 |
| 7. 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（5）过表达LaMIR166a在落叶松ESMs成胚发育及其萌发过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究目的及意义 |
| 1.1.3 项目来源与经费支持 |
| 1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2.1 裸子植物的胚胎发育 |
| 1.2.2 针叶树体细胞胚胎发生研究进展 |
| 1.2.3 MicroRNAs与落叶松体细胞胚发生 |
| 1.2.4 植物mi R165/166 及其目标基因HD-ZIP Ⅲ的功能研究 |
| 1.2.5 生长素信号途径在植物胚胎发育中的研究 |
| 1.2.6 SSN技术在生命科学研究中的应用 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 过表达LaMIR166a落叶松抗性细胞系的筛选及其胚胎转化植株过程的表达分析与功能研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 转LaMIR166a抗性细胞的筛选 |
| 2.2.2 转LaMIR166a抗性细胞系的PCR分析 |
| 2.2.3 转LaMIR166a抗性细胞系的qRT-PCR验证 |
| 2.2.4 过表达LaMIR166a对落叶松ESMs增殖的影响 |
| 2.2.5 过表达LaMIR166a对落叶松子叶胚发育的调控 |
| 2.2.6 落叶松子叶胚不同发育形态的解剖学观察 |
| 2.2.7 过表达LaMIR166a显着提高落叶松子叶胚萌发率 |
| 2.2.8 过表达LaMIR166a落叶松转化植株地上部生长性状分析 |
| 2.2.9 过表达LaMIR166a落叶松转化植株主根与侧根发生情况 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 MiR166a在落叶松体细胞胚发育中的功能 |
| 2.3.2 MiR166a与生长素/生长素极性运输可能的调控关系 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 落叶松体细胞胚发育过程中mi R166a对IAA信号途径的调控研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 研究方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 落叶松LaNIT基因的功能分析与验证 |
| 3.2.2 过表达LaMIR166a ESMs中IAA含量及其信号途径相关基因表达分析 |
| 3.2.3 体细胞胚成熟过程中LaMIR166a、miR166a及其目标基因的表达分析 |
| 3.2.4 体细胞胚成熟过程中IAA信号途径相关基因的表达分析 |
| 3.2.5 体细胞胚发育早期IAA水平分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 植物中的NIT基因家族 |
| 3.3.2 落叶松体细胞胚发育中mi R166a对LaHDZ31–34 的调控作用 |
| 3.3.3 MiR166介导的内源IAA合成与信号转导在植物发育中的作用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 落叶松体细胞胚萌发过程中mi R166a调控IAA信号途径的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 研究方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 落叶松体细胞胚萌发过程中LaMIR166a、miR166a及LaHDZ31-34 的表达分析 |
| 4.2.2 落叶松体细胞胚萌发过程中IAA信号途径相关基因的表达分析 |
| 4.2.3 外源IAA处理对落叶松体细胞胚萌发的调控 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 针叶树体细胞胚萌发能力 |
| 4.3.2 植物激素在落叶松体细胞胚萌发中的重要作用 |
| 4.3.3 MiR166/ HDZIP Ⅲ 调控落叶松体细胞胚萌发的机理 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 过表达LaMIR166a烟草转化植株的表达与功能验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 遗传转化方法与抗性植株筛选 |
| 5.1.2 PCR与qRT-PCR检测 |
| 5.1.3 数据统计与收集 |
| 5.1.4 茎部切片、根部压片与显微观察 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 转LaMIR166a阳性植株的筛选 |
| 5.2.2 LaMIR166a在转基因烟草不同器官中的表达分析 |
| 5.2.3 过表达LaMIR166a烟草植株表型性状分析 |
| 5.2.4 过表达LaMIR166a烟草植株木质部结构分析 |
| 5.2.5 过表达LaMIR166a烟草植株根部成熟区结构观察 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 过表达LaMIR166a促进烟草生物量积累 |
| 5.3.2 过表达LaMIR166a影响烟草器官的发育 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 CRISPR/CAS9介导的落叶松ESMs中定向敲除LaMIR166a的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 目标基因切割位点设计与表达载体构建 |
| 6.1.2 农杆菌介导的落叶松胚性细胞系的遗传转化 |
| 6.1.3 再生材料中基因组定向修饰结果检测与分析 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 Cas9载体遗传转化与抗性细胞筛选 |
| 6.2.2 抗性细胞系的分子检测及其结果分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 SSN技术与植物mi RNAs的功能诠释 |
| 6.3.2 CRISPR/Cas9技术在落叶松miR166a定向敲除中的应用 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（6）抗松材线虫病黑松体细胞胚胎发生及植株再生体系研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 针叶树体细胞胚胎发生的研究进展 |
| 1.1 国外针叶树体细胞胚胎发生及植株再生研究进展 |
| 1.2 国内针叶树体胚发生及植株再生研究进展 |
| 2 针叶树体细胞胚胎发生过程及其影响因素 |
| 2.1 胚性愈伤组织的诱导 |
| 2.2 胚性愈伤组织的保持和增殖 |
| 2.3 体细胞胚的成熟 |
| 2.4 体细胞胚的萌发和植株再生 |
| 3 黑松组织培养研究进展 |
| 第二章 抗性黑松胚性愈伤组织诱导 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 外植体来源 |
| 1.2 外植体的处理 |
| 1.3 合子胚发育阶段检测与观察 |
| 1.4 球果不同采集期对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 1.5 不同抗性家系对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 1.6 培养条件与数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抗性黑松合子胚不同发育阶段的检测 |
| 2.2 球果不同采集期（发育阶段）对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3 不同抗性家系对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.4 抗性黑松胚性愈伤组织诱导过程观察 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 抗性黑松胚性愈伤组织增殖与维持 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 不同浓度生长调节剂对ESM增殖的影响 |
| 1.2.1 不同浓度 2,4-D对ESM增殖的影响 |
| 1.2.2 不同浓度NAA对ESM增殖的影响 |
| 1.3 抗性黑松ESM增殖曲线 |
| 1.4 ESM组织形态和细胞学观察 |
| 1.5 培养条件与方法 |
| 1.6 数据统计与处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度生长调节剂对ESM增殖的影响 |
| 2.1.1 不同浓度 2,4-D对ESM增殖的影响 |
| 2.1.2 不同浓度NAA对ESM增殖的影响 |
| 2.2 抗性黑松ESM增殖曲线 |
| 2.3 ESM组织形态和细胞学差异观察 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 抗性黑松体细胞胚诱导与成熟 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 不同浓度的麦芽糖对体胚诱导与成熟的影响 |
| 1.3 不同浓度的肌醇对体胚诱导与成熟的影响 |
| 1.4 不同浓度的ABA和PEG互作对体胚诱导与成熟的影响 |
| 1.5 不同浓度的GA_3、GA_(4+7)对体胚诱导与成熟的影响 |
| 1.6 体胚发育与成熟过程的细胞学观测 |
| 1.7 培养条件与数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度的麦芽糖对体胚诱导与成熟的影响 |
| 2.2 不同浓度的肌醇对体胚诱导与成熟的影响 |
| 2.3 不同浓度的ABA和PEG互作对体胚诱导与成熟的影响 |
| 2.4 不同浓度的GA_3、GA_(4+7)对体胚诱导与成熟的影响 |
| 2.5 体胚发育与成熟过程的细胞学观测 |
| 3 结论与讨论 |
| 第五章 抗性黑松体细胞胚萌发与植株再生 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 麦芽糖、活性炭（AC）对黑松体胚萌发的影响 |
| 1.2.1 不同浓度麦芽糖对黑松体胚萌发的影响 |
| 1.2.2 不同浓度活性炭（AC）对黑松体胚萌发的影响 |
| 1.3 黑松体胚生根培养与植株再生 |
| 1.4 培养条件与数据统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 麦芽糖、活性炭（AC）对黑松体胚萌发的影响 |
| 2.1.1 不同浓度麦芽糖对黑松体胚萌发的影响 |
| 2.1.2 不同浓度活性炭（AC）对黑松体胚萌发的影响 |
| 2.2 黑松体胚生根培养与植株再生 |
| 3 结论与讨论 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 1 主要结论 |
| 2 存在问题与展望 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
（7）湿地松、火炬松离体培养植株再生技术的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 针叶树离体培养及植株再生研究进展 |
| 1. 针叶树种离体培养与植株再生方式及其特性 |
| 1.1 直接器官发生 |
| 1.2 间接器官发生 |
| 1.3 直接体胚发生 |
| 2. 针叶树种器官发生研究进展及其影响因素 |
| 2.1 直接器官发生植株再生研究进展 |
| 2.2 间接器官发生植株再生研究进展 |
| 2.3 针叶树器官发生的影响因素 |
| 2.3.1 外植体基因型与器官发生 |
| 2.3.2 外植体生理状态与器官发生 |
| 2.3.3 培养基类型与器官发生 |
| 2.3.4 植物激素种类浓度组合与器官发生 |
| 2.3.5 光照调控与器官发生 |
| 3. 针叶树种体胚发生研究进展及影响因素 |
| 3.1 体胚发生与植株再生研究进展 |
| 3.2 针叶树体胚发生的步骤及影响因素 |
| 4. 结语 |
| 第二章 湿地松、火炬松离体培养植株再生研究进展 |
| 1. 湿地松、火炬松离体培养与植株再生研究进展 |
| 1.1 直接器官发生植株再生研究进展 |
| 1.2 间接器官发生植株再生研究进展 |
| 1.3 湿地松、火炬松体胚发生植株再生研究进展 |
| 2. 针叶树种组培快繁技术研究中存在的技术问题 |
| 2.1 器官发生与植株再生研究存在的问题 |
| 2.2 体细胞胚胎发生研究存在的问题 |
| 3. 结语 |
| 第三章 湿地松直接器官发生继代增殖的影响因子 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 无菌培养物的建立 |
| 1.3 抗病家系与非抗病家系对继代增殖的影响 |
| 1.4 继代增殖与增殖代数的相关性试验 |
| 1.5 6-BA 与 NAA 对继代增殖的影响 |
| 1.6 培养条件 |
| 1.7 数据统计与分析方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 胚离体培养及胚苗萌发结果 |
| 2.2 丛生芽分化结果与分析 |
| 2.2.1 丛生芽分化基本培养的筛选 |
| 2.2.2 不同家系丛生芽分化结果与分析 |
| 2.3 继代培养芽增殖率与增殖代数的相关性试验结果与分析 |
| 2.4 6-BA 与 NAA 的负互作效应对组培快繁效率的影响结果 |
| 3. 结语 |
| 第四章 湿地松直接器官发生优良基因型的筛选 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 初代培养基的设计 |
| 1.3 优良基因型的筛选标准 |
| 1.4 继代增殖培养基的设计与优化 |
| 1.5 生根培养程序的优化 |
| 1.6 移栽管理技术措施 |
| 1.7 培养条件 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 初代培养基的筛选与优化 |
| 2.2 优良基因型的筛选结果 |
| 2.3 增殖效率(年增殖率)与继代培养基的关系 |
| 2.4 芽苗的生根诱导试验结果与分析 |
| 2.5 组培苗的移栽 |
| 3. 结论 |
| 第五章 湿地松间接器官发生器官性愈伤组织诱导与增殖 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 种子的无菌处理 |
| 1.3 愈伤组织诱导培养基设计 |
| 1.3.1 基本培养基与激素组合的筛选 |
| 1.3.2 生长素种类的筛选 |
| 1.4 愈伤组织的增殖培养基设计 |
| 1.5 不同浓度 CH 对愈伤组织增殖的影响 |
| 1.6 抗氧化剂在增殖培养基中的应用 |
| 1.7 暗培养对外植体褐化的影响 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 合子胚器官性愈伤组织诱导结果与分析 |
| 2.2 胚苗顶芽、下胚轴、胚根器官性愈伤组织诱导结果与分析 |
| 2.3 生长素种类浓度对合子胚器官性愈伤组织诱导的影响 |
| 2.4 激素组合对器官性愈伤组织的增殖的影响 |
| 2.5 水解酪蛋白对器官性愈伤组织增殖速率的影响 |
| 2.6 PVP 与 Ac 对愈伤组织褐化的影响 |
| 2.7 暗培养对外植体褐化的影响 |
| 3. 结语与讨论 |
| 第六章 湿地松器官性愈伤组织不定芽分化、植株再生与组织细胞学观察 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 愈伤组织器官分化培养基的筛选 |
| 1.2.1 激素组合的筛选 |
| 1.2.2 水解酪蛋白、蔗糖、活性炭对不定芽分化的影响 |
| 1.3 不定芽分化的组织细胞学观察 |
| 1.4 芽器官发育的同步化 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 愈伤组织不定芽的分化结果 |
| 2.1.1 激素组合对不定芽分化的影响 |
| 2.1.2 水解酪蛋白对不定芽分化的影响 |
| 2.1.3 蔗糖浓度对不定芽分化的影响 |
| 2.1.4 活性炭对不定芽分化的影响 |
| 2.2 不定芽器官分化的组织学观察结果与分析 |
| 2.3 不定芽的同步化生长发育 |
| 3. 结语与讨论 |
| 第七章 湿地松体细胞胚胎发生--ESM 的诱导 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.1.1 试验材料1 |
| 1.1.2 试验材料2 |
| 1.2 未成熟合子胚发育阶段的检测方法 |
| 1.3 诱导培养基的设计 |
| 1.3.1 成熟种胚外植体诱导培养基 |
| 1.3.2 未成熟合子胚外植体诱导培养基 |
| 1.4 其它因素对 ESM 诱导率影响 |
| 1.5 外植体的无菌处理及半固体培养基的制备 |
| 1.5.1 成熟种胚的无菌处理 |
| 1.5.2 未成熟球果的无菌处理 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 1.7 培养条件 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 成熟合子胚胚性培养物诱导试验结果与分析 |
| 2.2 湿地松不同家系未成熟球果合子胚发育进程 |
| 2.2.1 湿地松合子胚发育过程 |
| 2.2.2 不同家系合子胚发育进度差异 |
| 2.3 球果采收期（合子胚发育阶段）对 ESM 诱导的影响 |
| 2.3.1 湿地松 ESM 的诱导过程 |
| 2.3.2 合子胚发育阶段与 ESM 活力的关系 |
| 2.3.3 合子胚发育阶段与 ESM 诱导率的关系 |
| 2.4 培养基、激素组合对 ESM 诱导率的影响 |
| 2.4.1 不同培养基激素组合雌配子体的形态反应与分析 |
| 2.4.2 不同培养基激素组合对 ESM 诱导率、褐化率的影响 |
| 2.5 外植体的接种方式对 ESM 诱导率的影响与分析 |
| 2.6 球果冷藏时间对 ESM 诱导率的影响与分析 |
| 2.7 植物凝胶种类浓度对 ESM 诱导率的影响 |
| 2.8 硝酸银与 MES(pH 缓冲液)对 ESM 诱导率的影响 |
| 3. 结语与讨论 |
| 第八章 湿地松 ESM 的维持、增殖与体胚的成熟 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 ESM 的维持、增殖培养基 |
| 1.3 增殖培养方法 |
| 1.4 体胚发育、成熟培养方法 |
| 1.5 体胚的发育与成熟培养基 |
| 1.6 ESM 增殖与体胚成熟的培养条件 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 ESM 胚性维持培养结果与分析 |
| 2.2 胚性细胞系的增殖培养基的优化与筛选 |
| 2.2.1 增殖培养基的筛选 |
| 2.2.2 胚性细胞系增殖的组织细胞学观察 |
| 2.3 体胚的发育与成熟培养结果 |
| 3. 结语与讨论 |
| 第九章 火炬松未成熟合子胚体细胞胚胎发生 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 合子胚发育阶段的检测 |
| 1.3 4 种专利培养基与诱导培养基的设计 |
| 1.4 不同浓度生长素2,4-D 对体胚诱导的比较试验 |
| 1.5 半固体培养基的准备、外植体的无菌消毒及培养条件 |
| 1.6 ESM 的维持与增殖培养 |
| 1.7 体胚的成熟 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 合子胚发育阶段镜检结果 |
| 2.2 雌配子体在不同培养基上的形态反应 |
| 2.3 ESM 诱导率与合子胚发育的相关性 |
| 2.4 不同家系不同培养基的 ESM 诱导率、褐化率及其方差分析 |
| 2.5 生长素2,4-D 浓度对体胚诱导率的影响 |
| 2.6 ESM 维持与增殖培养结果与分析 |
| 2.7 体胚成熟培养结果与分析 |
| 3. 结语与讨论 |
| 第十章 火炬松成熟合子胚体细胞胚胎发生 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 外植体无菌消毒程序 |
| 1.3 诱导培养基与体胚诱导率 |
| 1.4 种子重量与体胚诱导率的关系 |
| 1.5 合子胚接种方式 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 不同培养基激素组合对成熟合子胚体胚诱导的影响 |
| 2.2 种子重量与体胚诱导的关系 |
| 2.3 接种方式及种子提取液对体胚诱导率的影响 |
| 3. 结语与讨论 |
| 第十一章 结语与展望 |
| 1. 湿地松、火炬松离体培养植株再生技术研究的主要结论 |
| 2. 湿地松、火炬松离体培养快繁技术研究存在的问题 |
| 3.松属树种离体培养快繁技术产业化应用前景与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间已发表的论文 |
（8）棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 棉花组织培养及生物技术研究进展 |
| 1.1 棉花组织培养的概述 |
| 1.1.1 棉花组织培养及植株再生 |
| 1.1.1.1 愈伤组织的诱导和培养 |
| 1.1.1.2 植株再生 |
| 1.1.2 响体细胞胚发生和植株再生的因素 |
| 1.1.2.1 基因型 |
| 1.1.2.2 外植体 |
| 1.1.2.3 激素 |
| 1.1.2.4 培养条件 |
| 1.2 植物体细胞无性系变异研究进展 |
| 1.2.1 体细胞无性系变异特点及遗传基础 |
| 1.2.2 植物体细胞无性系变异的影响因素 |
| 1.2.2.1 外植体中预存的变异 |
| 1.2.2.2 外植体的基因型和类型 |
| 1.2.2.3 植株再生方式 |
| 1.2.2.4 培养时间、继代次数的影响 |
| 1.2.2.5 培养方式对体细胞变异的影响 |
| 1.3 植物转基因研究进展 |
| 1.3.1 植物遗传转化的发展 |
| 1.3.2 植物遗传转化的方法 |
| 1.3.2.1 根癌农杆菌介导的基因转移 |
| 1.3.2.2 基因枪转化法 |
| 1.3.2.3 PEG法 |
| 1.3.2.4 显微注射法(microiniection) |
| 1.3.2.5 电激法 |
| 1.3.2.6 碳化硅纤维介导转化法 |
| 1.3.2.7 子房注射法 |
| 1.3.2.8 其它方法 |
| 1.3.3 棉花的遗传转化 |
| 1.3.4 影响农杆菌T-DNA转移的因素 |
| 1.4 GFP报告基因的利用 |
| 1.4.1 发光机制 |
| 1.4.2 GFP的应用领域 |
| 1.5 植物突变体库创建与功能基因组研究 |
| 1.5.1 植物突变体库的创建 |
| 1.5.1.1 理化诱变 |
| 1.5.1.2 植物转座子标签 |
| 1.5.1.3 农杆菌介导的T-DNA插入突变 |
| 1.5.2 经典的插入突变克隆基因的不足 |
| 1.5.3 Gene trap技术在植物功能基因组研究中的应用 |
| 1.6 本课题的研究目的与意义 |
| 1.6.1 高体细胞胚胎发生能力基因型的筛选 |
| 1.6.2 棉花体细胞无性系变异的研究 |
| 1.6.3 农杆菌介导棉花转化体系的优化 |
| 1.6.4 新的转化方法的探讨 |
| 1.6.5 promoter-trap突变群体的初步研究 |
| 第二章 高体细胞胚胎发生能力基因型的筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 品种(系)材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 棉花组织培养所用培养基和培养条件 |
| 2.1.2.2 棉花体细胞再生的培养体系 |
| 2.1.2.3 愈伤秤重、形态及细胞学压片观察 |
| 2.1.2.4 不同基因型棉花品种(系)的再生能力比较 |
| 2.1.2.5 数据统计与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同基因型的愈伤组织诱导 |
| 2.2.2 不同品种(系)的愈伤组织增殖及分化能力比较 |
| 2.2.3 三个棉花品种体细胞发生能力的保持的比较研究 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 棉花组织培养中的体细胞无性系变异研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 体细胞胚胎发生及植株再生 |
| 3.2.2 再生植株的倍性分析 |
| 3.2.3 再生植株的细胞学压片 |
| 3.2.4 再生植株的RAPD多态性研究 |
| 3.2.5 两种不同激素组合诱导的胚性愈伤组织再生能力的比较 |
| 3.2.6 两种不同激素组合诱导的胚性愈伤组织的RAPD、SSR多态性研究 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 流式细胞仪检测再生植株的倍性 |
| 3.3.2 再生植株的细胞学压片观察 |
| 3.3.3 再生植株的RAPD多态性 |
| 3.3.4 两种激素诱导的愈伤组织再生能力的比较 |
| 3.3.5 两种激素诱导的胚性愈伤组织的RAPD、SSR多态性研究 |
| 3.3.6 聚类结果分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 农杆菌介导的棉花遗传转化的研究 |
| 4.1 农杆菌介导的棉花胚性愈伤组织遗传转化 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 棉花胚性愈伤组织的根癌农杆菌转化体系 |
| 4.1.2.1 培养基及培养条件 |
| 4.1.2.2 转化方法 |
| 4.1.3 转化愈伤及再生植株的分子检测 |
| 4.1.3.1 基因组DNA抽提(大量法) |
| 4.1.3.2 小量抽提法(用于PCR扩增) |
| 4.1.3.3 PCR分析 |
| 4.1.3.4 Southern杂交(参照Sambrook,2002进行) |
| 4.1.4 根癌农杆菌转化‘YZ-1’胚性愈伤组织的条件优化 |
| 4.1.4.1 农杆菌菌株对转化效率的影响 |
| 4.1.4.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 |
| 4.1.4.3 乙酰丁香酮(AS)与农杆菌侵染效率 |
| 4.1.4.4 共培养温度与农杆菌侵染 |
| 4.1.4.5 共培养时间与农杆菌侵染 |
| 4.1.4.6 愈伤组织生理状态与农杆菌侵染 |
| 4.2 转基因再生植株的嫁接移栽试验 |
| 4.2.1 普通嫁接 |
| 4.2.2 试管内嫁接移栽技术 |
| 4.3 GFP作为报告基因研究下胚轴为转化受体的棉花遗传转化 |
| 4.3.1 试验材料： |
| 4.3.2 农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化 |
| 4.3.3 GFP荧光检测 |
| 4.3.4 转化细胞的生长特性观察及其分化调控 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 农杆菌转化棉花胚性愈伤组织的参数优化研究 |
| 4.4.1.1 农杆菌菌株对转化效率的影响 |
| 4.4.1.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 |
| 4.4.1.3 乙酰丁香酮对转化效率的影响 |
| 4.4.1.4 共培养温度对对转化效率的影响 |
| 4.4.1.5 共培养时间对转化效率的影响 |
| 4.4.1.6 愈伤组织生理状态对对转化效率的影响 |
| 4.4.2 农杆菌介导的‘YZ-1’的胚性愈伤组织遗传转化体系的建立 |
| 4.4.3 抗性愈伤组织的PCR鉴定 |
| 4.4.4 转基因再生植株的Southern杂交检测 |
| 4.4.5 转基因再生植株的嫁接移栽技术 |
| 4.4.6 GFP作为报告基因研究下胚轴为转化受体的遗传转化 |
| 4.4.6.1 GFP的瞬时表达和稳定表达 |
| 4.4.6.2 转基因愈伤组织的形态结构、生长发育特性研究 |
| 4.4.6.3 不同基因型的材料遗传转化特性 |
| 4.4.6.4 GFP转化愈伤的分化调控 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 棉花胚芽为转化受体的遗传转化 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 根癌农杆菌和转化载体 |
| 5.1.3 转化方法 |
| 5.1.3.1 胚芽的剥离 |
| 5.1.3.2 超声波辅助农杆菌转化处理 |
| 5.1.3.3 转化及植株再生过程 |
| 5.1.4 GFP瞬时表达观察 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 超声波辅助的棉花胚芽的遗传转化体系的建立 |
| 5.2.2 不同超声波功率、处理时间对超声波处理效果的影响 |
| 5.2.3 不同的介质对超声波处理效果的影响 |
| 5.2.4 不同的基因型对超声波处理效果的影响 |
| 5.2.5 抗虫基因的SAAT转化 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 PROMOTER-TRAPPING突变群体的初步研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 品种 |
| 6.1.2 农杆菌菌株和转化载体 |
| 6.1.3 以胚性愈伤组织为受体的遗传转化 |
| 6.1.4 转化愈伤及再生植株不同器官的GUS染色 |
| 6.1.5 再生植株的分子生物学鉴定 |
| 6.1.6 转基因当代材料的农艺性状考察 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 转基因再生植株的农艺性状考察 |
| 6.2.2 转基因再生植株农艺性状的变异规律 |
| 6.2.3 转基因再生植株的PCR检测 |
| 6.2.4 转基因再生植株的Southern杂交分析 |
| 6.2.5 Promoter-trap T_0代群体GUS检测 |
| 6.2.5.1 GUS基因在突变群体的表达频率 |
| 6.2.5.2 GUS基因在根中的表达模式 |
| 6.2.5.3 GUS基因在花器官中的表达模式 |
| 6.2.5.4 GUS基因在营养器官中的表达模式 |
| 6.2.5.5 GUS基因在不同体细胞胚胎发育阶段中的表达频率 |
| 6.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）甜玉米再生能力的遗传多态性分析（论文提纲范文）
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 玉米组织培养发展概况 |
| 1.2 玉米愈伤组织类型和再生途径 |
| 1.3 影响愈伤组织诱导的因素 |
| 1.3.1 基因型对玉米体细胞再生能力的影响 |
| 1.3.2 不同外植体对玉米再生的影响 |
| 1.3.3 培养条件对玉米体细胞再生能力的影响 |
| 1.4 存在的问题及解决的办法 |
| 1.4.1 愈伤组织的改良 |
| 1.4.2 试管苗的移栽 |
| 1.4.3 污染 |
| 1.4.4 褐化 |
| 1.5 玉米再生能力的遗传特性及其基因效应分析 |
| 1.6 玉米比较基因组学 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 甜玉米再生体系的建立及其优化 |
| 2.1 茎尖培养再生体系的建立 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果与分析 |
| 2.1.3 讨论与结论 |
| 2.2 成熟胚再生体系的建立及与茎尖再生体系的比较 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果与分析 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.3 幼胚培养再生体系的建立 |
| 2.3.1 材料与方案 |
| 2.3.2 结果与分析 |
| 2.3.3 讨论 |
| 第三章 甜玉米高再生能力基因型的筛选及评价 |
| 3.1 甜玉米成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生特性的评价 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果与分析 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 幼胚再生特性的比较分析 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果和分析 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.3 成熟胚和幼胚的再生能力的比较 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果与讨论 |
| 第四章 甜玉米体细胞再生能力及DNA 多态性分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 反应体系的建立 |
| 4.2.2 验证引物 |
| 4.2.3 引物的筛选 |
| 4.2.4 21 份材料的类群划分 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 下一步研究建议 |
| 4.5 结论 |
| 附录 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）三种针叶树种遗传转化受体系统的建立及农杆菌介导的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1. 植物生物技术在林木遗传改良中的应用 |
| 引言 |
| 1.1 林木细胞和组织培养 |
| 1.1.1 器官发生途径 |
| 1.1.2 体细胞胚胎发生途径 |
| 1.2 林木遗传转化 |
| 1.3 林木分子标记技术 |
| 2. 针叶树遗传转化的研究进展综述 |
| 引言 |
| 2.1 农杆菌介导的针叶树遗传转化 |
| 2.2 基因枪法 |
| 2.2.1 瞬时表达 |
| 2.2.2 稳定表达 |
| 2.3 电穿孔法 |
| 2.4 影响针叶树转化的一些主要因素 |
| 参考文献 |
| 第一部分:马尾松、杂交松和杉木的细胞组织培养研究 |
| 前言 |
| 摘要 |
| 材料和方法 |
| 1. 植物材料 |
| 2. 培养基和培养条件 |
| 2.1 马尾松直接器官发生培养基及培养条件 |
| 2.2 杂交松直接器官发生培养基及培养条件 |
| 2.3 杉木器官发生及体细胞胚胎发生培养基及培养条件 |
| 3. 数据统计方法 |
| 3.1 不定芽的诱导频率 |
| 3.2 诱导的平均不定芽数 |
| 3.3 不定芽的形成能力 |
| 4. 石蜡切片方法 |
| 结果和讨论 |
| 1. 马尾松高效再生体系的建立 |
| 1.1 马尾松基因型的选择 |
| 1.2 基本培养基和细胞分裂素对马尾松成熟合子胚不定芽诱导的影响 |
| 1.3 BA 和TDZ 浓度对马尾松初生茎顶组织芽诱导的影响 |
| 1.4 影响马尾松不定芽伸长的因素 |
| 1.5 影响马尾松不定根诱导的因素与植株再生 |
| 1.6 马尾松成熟合子胚不定芽发生的组织学分析 |
| 2. 杂交松高效再生体系的建立 |
| 2.1 基本培养基及细胞分裂素对杂交松成熟合子胚不定芽发生的影响 |
| 2.2 BA、TDZ 浓度对杂交松试管苗子叶和茎段芽诱导的影响 |
| 2.3 影响杂交松不定根诱导的因素与植株再生 |
| 3. 杉木高效再生体系的建立 |
| 3.1 杉木基因型的选择 |
| 3.2 杉木成熟合子胚和茎段的芽诱导过程及体外植株再生 |
| 3.2.1 杉木成熟合子胚培养直接不定芽发生及植株再生 |
| 3.2.2 杉木茎段不定芽和腋芽的诱导及体外植株再生 |
| 3.3 杉木茎段培养直接体细胞胚胎发生 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:农杆菌介导的马尾松和杉木遗传转化研究 |
| 前言 |
| 摘要 |
| 材料和方法 |
| 1. 植物材料及外植体再生 |
| 2. 菌株和质粒 |
| 3. 细菌培养基、酶及生化试剂 |
| 4. 菌株培养 |
| 5. 转化步骤 |
| 6. 转化体的筛选和抗性芽的再生 |
| 7. 转基因马尾松芽苗、杉木芽苗的鉴定 |
| 7.1 GUS 染色分析 |
| 7.2 植物基因组DNA 的提取 |
| 7.2.1 方法与步骤 |
| 7.2.2 母液与DNA 提取液 |
| 7.3 聚合酶链式反应(PCR)分析 |
| 结果和讨论 |
| 1. 不同抗生素浓度对芽分化的影响 |
| 1.1 抑菌抗生素对芽分化的影响 |
| 1.2 筛选抗生素的本底抗性实验 |
| 2. 预培养时间对转化的影响 |
| 3. 侵染农杆菌菌液及侵染时间对转化的影响 |
| 4. 共培养时间对转化的影响 |
| 5. 共培养培养基pH 值对转化的影响 |
| 6. 添加添加乙酰丁香酮(AS)对农杆菌介导转化的影响 |
| 7. 筛选方式对产生抗性芽的影响 |
| 8. 稳定转化及抗性芽苗的获得 |
| 9. GUS染色分析 |
| 10. 抗性芽苗的PCR检测 |
| 11. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 攻博期间文章目录 |
| 缩写列表 |
| 致谢 |
四、提高玉米胚性细胞系诱导再生植株的研究（论文参考文献）
- [1]杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究[D]. 张素芳. 东北林业大学, 2020
- [2]‘凤丹白’牡丹遗传转化体系的研究[D]. 王明清. 上海师范大学, 2020(07)
- [3]农杆菌介导的落叶松干细胞转基因标准化平台建立及LaAGL2-2的分离与转化[D]. 张耀. 中国林业科学研究院, 2020
- [4]油松体胚发生优化与遗传转化的初步研究[D]. 李亦轩. 北京林业大学, 2019(01)
- [5]过表达LaMIR166a在落叶松ESMs成胚发育及其萌发过程中的功能研究[D]. 李哲馨. 中国林业科学研究院, 2017(11)
- [6]抗松材线虫病黑松体细胞胚胎发生及植株再生体系研究[D]. 梁芬. 南京林业大学, 2016(03)
- [7]湿地松、火炬松离体培养植株再生技术的研究[D]. 吴丽君. 南京林业大学, 2008(09)
- [8]棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制[D]. 金双侠. 华中农业大学, 2006(02)
- [9]甜玉米再生能力的遗传多态性分析[D]. 陈莉. 新疆农业大学, 2006(02)
- [10]三种针叶树种遗传转化受体系统的建立及农杆菌介导的遗传转化研究[D]. 张宇. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）, 2006(10)