MAT2A/MAT2B在小鼠卵母细胞成熟及早期胚胎发育中的功能研究

论文摘要

哺乳动物卵母细胞成熟及早期胚胎发育受众多信号通路以及转录因子的调控。卵母细胞的成熟需要经过两次减数分裂过程,在减数分裂过程中,MAPK信号通路参与了调控纺锤体的组装和染色体的正常排列。受精后的胚胎即进入着床前发育阶段,该阶段包括两个关键过程,一个是合子基因组激活,该过程是由母源调控向胚胎调控转换的关键时期。早期胚胎发育的另一个重要过程是桑椹胚-囊胚转换,该过程会出现内细胞团以及滋养层的分化。转录因子以及表观修饰因子在这两个过程中发挥着重要作用。发现关键调控因子在卵母细胞成熟或早期胚胎发育中所发挥的作用是揭示发育过程复杂性和系统性的基础。甲硫氨酸腺苷转移酶II（MATII）是哺乳动物体内进行甲硫氨酸代谢的关键复合物,它是由催化亚基α以及调控亚基β组成。其中,α亚基是由MAT2A基因编码而成;β亚基是由MAT2B基因编码而成。该复合物通过催化甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）进而与机体转甲基代谢通路紧密相关,同时SAM也是生物体内甲基基团的最主要来源。MAT2A和MAT2B蛋白广泛分布于生物体的多种细胞类型中,参与了体内众多DNA与组蛋白甲基化修饰。本研究通过筛选及功能分析,对MAT2A及MAT2B基因在小鼠卵母细胞及早期胚胎发育中的表达模式进行研究,并且对MAT2B基因在小鼠卵母细胞成熟过程中的功能进行了研究,同时对MAT2A基因在小鼠早期胚胎发育中的功能以及与组蛋白甲基化修饰的关联进行了相关研究,研究结果如下:（1）通过定量及免疫荧光染色实验,确定了MAT2A和MAT2B基因在小鼠卵母细胞及着床前胚胎发育过程中的表达模式。结果显示MAT2B基因在卵母细胞GV期及MII期显著高表达,并且MAT2B蛋白在GV期呈现明显的核定位。MAT2A基因在MII期、1-细胞期至桑椹胚阶段均呈现高表达模式,在囊胚期其mRNA水平开始降低,免疫荧光染色分析MAT2A蛋白从2-细胞期呈现明显的核定位,这与其参与基因的转录调控相一致。（2）通过干扰片段显微注射实验,研究沉默MAT2B基因对小鼠卵母细胞减数分裂过程的影响。结果发现,干扰MAT2B基因后小鼠卵母细胞的成熟率显著降低,MI期阻滞率显著升高。沉默MAT2B会显著抑制ERK1/2的磷酸化,影响MAPK通路的正常功能。进一步研究发现,MAT2B蛋白通过与GIT1相互作用促进ERK1/2的磷酸化,进而调控下游蛋白发挥功能。同时,MAT2B基因的敲降会影响纺锤体的正常组装以及染色体的正常排列,同时敲降MAT2B后会影响Fgf8,Cdc2和Gdf9等母源mRNA的正常降解,导致这些母源mRNA异常高表达。（3）通过干扰片段显微注射实验,研究沉默MAT2A基因对小鼠合子基因组激活的影响。结果发现,干扰MAT2A基因后小鼠早期胚胎发育阻滞在2-细胞期,即合子基因组激活期。并且沉默MAT2A基因后会导致2-细胞胚胎整体转录水平降低、DNA损伤以及合子基因的表达异常。MAT2A基因沉默导致的2-细胞期阻滞可以通过显微注射MAT2A mRNA进行部分挽救并可发育至囊胚期。（4）通过添加MAT2A蛋白催化功能抑制剂以及甲硫氨酸饥饿培养,研究MAT2A蛋白的催化功能在小鼠桑椹胚向囊胚转换过程中的作用。结果发现,添加抑制剂或者甲硫氨酸饥饿培养均会显著降低囊胚率,使小鼠早期胚胎发育阻滞于桑椹胚期。通过沉默MAT2A基因并同时注射催化位点突变型MAT2A mRNA可以得到与以上相似的结果。说明MAT2A蛋白的催化功能对于桑椹胚-囊胚转换过程至关重要。进一步研究发现,添加抑制剂培养或者甲硫氨酸饥饿培养会导致小鼠胚胎桑椹胚期的H3K4me3水平降低,说明MAT2A蛋白催化甲硫氨酸形成SAM的过程对于小鼠桑椹胚期正常表观基因组的建立以及向囊胚期的发育至关重要。综上所述,本论文研究了甲硫氨酸代谢关键复合物MATII的亚基β和α,其编码基因MAT2B和MAT2A分别在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的功能。证明了MAT2B通过调控MAPK信号通路影响小鼠卵母细胞减数分裂成熟,干扰MAT2B基因会导致小鼠卵母细胞异常阻滞于MI/AI期;另一方面研究了MAT2A对于小鼠合子基因组激活的影响以及MAT2A催化功能对于桑椹胚-囊胚转换过程的影响,验证了MAT2A作为转录因子参与合子基因组激活的调控,同时MAT2A作为一种酶参与调控甲硫氨酸代谢过程并影响桑椹胚期表观基因组建立及向囊胚期的发育。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词

综述部分

第一章卵母细胞成熟及早期胚胎发育

1.1 卵母细胞减数分裂过程及调控机制

1.1.1 卵母细胞减数分裂过程

1.1.2 卵母细胞减数分裂调控

1.2 早期胚胎发育的合子基因组激活

1.2.1 合子基因组激活的时间

1.2.2 合子基因组激活的机制

1.2.3 母源mRNA的翻译

1.2.4 母源mRNA的清除

1.2.5 转录调控因子

1.2.6 染色质重塑

1.3 囊胚的形成和发育

1.3.1 致密化和极化的发生

1.3.2 内细胞团和滋养层的形成

1.3.3 囊胚期组蛋白修饰

第二章 MAT2A及 MAT2B的研究进展

2.1 MAT2A研究进展

2.2 MAT2B研究进展

2.3 甲硫氨酸代谢调控

2.4 甲硫氨酸代谢与DNA甲基化

2.5 早期胚胎发育的甲硫氨酸供给

2.6 研究目的和意义

试验部分

第三章 MAT2A和MAT2B在HEPG2及LO2细胞中的表达和定位

3.1 材料和试剂

3.1.1 主要材料

3.1.2 主要试剂

3.2 方法

3.2.1 细胞培养

3.2.2 RNA提取

3.2.3 反转录与实时荧光定量PCR

3.2.4 基因扩增与载体构建

3.2.5 细胞转染

3.2.6 细胞免疫荧光染色

3.2.7 蛋白免疫印迹检测

3.2.8 统计分析

3.3 结果

3.3.1 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2细胞系中的表达

3.3.2 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2细胞系中的定位

3.3.3 MAT2A和MAT2B过表达影响其亚细胞分布

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 MAT2B调控小鼠卵母细胞减数分裂成熟

4.1 材料和试剂

4.1.1 主要材料

4.1.2 主要试剂

4.2 方法

4.2.1 卵母细胞及受精卵的采集和培养

4.2.2 卵母细胞显微注射

4.2.3 胚胎实时荧光定量PCR

4.2.4 胚胎免疫荧光染色

4.2.5 MAT2B及 GIT1 过表达载体构建

4.2.6 细胞培养

4.2.7 蛋白质免疫共沉淀

4.2.8 统计分析

4.3 结果

4.3.1 MAT2B在卵母细胞期高表达

4.3.2 敲降MAT2B对卵母细胞成熟的影响

4.3.3 MAT2B与 GIT1 互作并激活MAPK通路

4.3.4 U0126 处理对卵母细胞成熟的影响

4.3.5 敲降MAT2B影响纺锤体排列和母源mRNA降解

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 MAT2A在小鼠合子基因组激活中的功能研究

5.1 材料和试剂

5.1.1 主要材料

5.1.2 主要试剂

5.2 方法

5.2.1 细胞培养

5.2.2 组织RNA提取

5.2.3 小鼠卵母细胞及胚胎的采集与培养

5.2.4 mRNA反转录

5.2.5 蛋白免疫印迹检测

5.2.6 胚胎显微注射

5.2.7 胚胎免疫荧光染色

5.2.8 胚胎实时荧光定量PCR

5.2.9 体外转录

5.2.10 胚胎转录活性检测

5.3 结果

5.3.1 MAT2A及 MAT2B在小鼠多组织中的表达模式

5.3.2 MAT2A及 MAT2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎中的表达模式

5.3.3 免疫荧光检测MAT2A在小鼠早期胚胎中的分布模式

5.3.4 MAT2A干扰RNA的验证

5.3.5 敲降MAT2A导致小鼠2-细胞胚胎阻滞

5.3.6 敲降MAT2A对2-细胞转录水平的影响

5.3.7 胚胎发育挽救实验

5.3.8 细胞水平敲降MAT2A后影响组蛋白甲基化修饰

5.3.9 敲降MAT2A后对2细胞胚胎组蛋白甲基化的影响

5.3.10 敲降MAT2A后导致2细胞胚胎DNA损伤

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 MAT2A在小鼠囊胚发育中的功能研究

6.1 材料和试剂

6.1.1 主要材料

6.1.2 主要试剂

6.2 方法

6.2.1 小鼠胚胎获取

6.2.2 小鼠胚胎培养

6.2.3 胚胎免疫荧光染色

6.2.4 胚胎实时荧光定量PCR

6.2.5 MAT2A催化位点突变载体构建

6.2.6 体外转录

6.2.7 胚胎显微注射

6.2.8 胚胎凋亡染色

6.3 结果

6.3.1 环亮氨酸处理对胚胎发育的影响

6.3.2 环亮氨酸处理对组蛋白甲基化修饰的影响

6.3.3 甲硫氨酸饥饿培养对胚胎发育的影响

6.3.4 甲硫氨酸饥饿培养对组蛋白甲基化修饰的影响

6.3.5 MAT2A催化突变体对胚胎发育的影响

6.3.6 抑制MAT2A催化活性对胚胎凋亡的影响

6.3.7 抑制MAT2A催化活性对囊胚细胞数的影响

6.3.8 抑制MAT2A催化活性对囊胚基因表达的影响

6.4 讨论

6.5 小结

全文结论

创新点

不足之处和进一步研究计划

参考文献

附录

致谢

个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 孙洪政

导师: 张涌

关键词: 基因,卵母细胞成熟,早期胚胎发育,小鼠

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家高技术研究发展计划(编号:2011AA100303),国家自然科学基金(编号:31172279)

分类号: Q492

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000056

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