导读:本文包含了毛状根培养论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:杆菌,发根,甘草,植株,体系,薯蓣,山豆根。
毛状根培养论文文献综述
尹彦超[1]（2019）在《基于毛状根培养体系的甘草CHS及CHI基因功能研究》一文中研究指出甘草是我国最常用的大宗药材之一,素有“十方九草”之誉。近些年来,栽培甘草普遍存在品质退化和有效成分含量低等问题,已成为制约甘草资源可持续发展的关键问题。大量文献报道显示:毛状根可稳定高效的生产药用植物的次生代谢产物,因此利用毛状根培养体系对甘草的次生代谢途径开展研究具有重要价值。甘草苷是甘草中最重要的活性成分之一,查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)及查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)是甘草苷生物合成途径中起关键调控作用的限速酶。因此,本论文拟在前期克隆获得甘草CHS及CHI基因的基础上,构建植物双元表达载体及发根农杆菌工程菌,利用毛状根培养体系对甘草CHS及CHI基因进行功能研究,揭示其影响黄酮类化合物生物合成的分子机制。本课题的研究结果还将进一步筛选甘草苷高水平积累的毛状根体系,为甘草苷的离体合成奠定理论基础和提供技术支持。本文根据课题组前期对于甘草黄酮类化合物含量与CHS、CHI基因多态性相关关系的分析结果筛选出黄酮高含量对应的特异CHS、CHI基因单倍型;采用基因融合的方法构建甘草转CHS、CHI基因植物双元表达载体;通过电转法将甘草转CHS、CHI基因植物双元表达载体导入发根农杆菌;用转基因发根农杆菌工程菌侵染甘草外植体诱导转基因毛状根,并进行PCR和测序验证;建立同时测定甘草毛状根中四种黄酮成分含量的UPLC方法,并对培养得到的转CHS、CHI基因甘草毛状根进行含量测定;通过qRT-PCR对转CHS、CHI基因毛状根中目标基因的拷贝数进行测定,分析目标基因拷贝数与毛状根中黄酮类化合物含量的相关性。本论文共取得了如下研究结果:(1)根据黄酮类化合物含量与CHS、CHI基因多态性相关关系的分析结果,筛选出黄酮类化合物高含量甘草样品对应的特异CHI-1(GenBank注册号:KY115232),CHS-60(GenBank注册号:KY810356)单倍型。(2)选择Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ作为酶切位点,pCAMBIA1305.1为植物双元表达载体,采用基因融合的方法,成功构建甘草转CHI、CHS基因植物双元表达载体pCA-CHI、pCA-CHS。(3)采用电转法(电转条件:C:25μF;PC:200Ω;U:2400V)分别将携带有甘草CHI和CHS基因的双元表达载体pCA-CHI和pCA-CHS导入到发根农杆菌ACCC10060中,构建得到转甘草CHI、CHS的发根农杆菌工程菌。(4)利用转CHI、CHS基因发根农杆菌工程菌侵染甘草外植体胚轴及子叶,通过PCR验证及测序验证,成功获得了转CHI、CHS基因甘草毛状根。(5)建立了同时测定甘草毛状根中4种主要黄酮类化合物含量的UPLC方法,并采用此方法对54份甘草毛状根样品中的黄酮类化合物进行含量测定。统计学分析表明,黄酮总含量在转CHI基因甘草毛状根和空白甘草毛状根样品、转CHS基因甘草毛状根和空白甘草毛状根样品中均存在显着性差异,通过比较秩均数,黄酮含量满足:转CHI基因甘草毛状根>转CHS基因甘草毛状根>空白甘草毛状根,从而证实过表达CHS、CHI基因能够增加甘草毛状根中黄酮类成分的含量。(6)利用qRT-PCR对15份转CHI基因和转CHS基因毛状根中目标基因拷贝数进行了测定,结果显示8份过表达CHI基因甘草毛状根中CHI基因拷贝数分别为1、2或5个,7份过表达CHS基因毛状根中CHS基因拷贝数分别为7、9、10、11、13或18个。(7)根据目标基因拷贝数及黄酮类化合物含量测定结果,最终优选出拷贝数为9的转CHS基因甘草毛状根以及拷贝数为5的转CHI基因甘草毛状根作为进一步离体积累黄酮类化合物的甘草毛状根材料,为将来扩大培养奠定基础。(本文来源于《北京中医药大学》期刊2019-05-01）
齐立雨,李汶聪,赵雪[2]（2019）在《不同因子对药用植物毛状根培养的影响》一文中研究指出毛状根培养体系作为生物技术在中药中应用的一种技术,是药用植物研究领域的新途径、新方法,受到很多物理因素和化学因素的影响。就药用植物毛状根培养体系的影响因素进行综合阐述,为相关研究和应用提供参考。(本文来源于《黑龙江科学》期刊2019年04期）
邹凯,刘泽波,许小向,上官新晨,尹忠平[3]（2017）在《甜叶菊毛状根培养系统的建立及绿原酸类成分的诱导》一文中研究指出本文利用发根农杆菌A4诱导甜叶菊毛状根再生,建立毛状根生产绿原酸类物质的培养体系,并研究茉莉酸甲酯和水杨酸对毛状根中绿原酸类物质积累的影响。结果表明,经发根农杆菌A4侵染的甜叶菊叶片外植体在共培养14 d后诱导出了毛状根;PCR检测结果表明,发根农杆菌Ri质粒中rol B和rol C基因均已整合到毛状根中;毛状根在MS液体培养基中,培养到第14 d时分别加入不同浓度(50、100、200μmol/L)的水杨酸和茉莉酸甲酯进行诱导,处理第1、3、6 d后均抑制了毛状根的生长,但茉莉酸甲酯促进了毛状根中绿原酸类物质的积累,而水杨酸却抑制了毛状根中绿原酸类物质的积累。由此说明,发根农杆菌A4侵染甜叶菊可诱导出毛状根,该毛状根可用于绿原酸类物质的生产,茉莉酸甲酯可提高绿原酸类物质的含量。(本文来源于《现代食品科技》期刊2017年06期）
盖庆岩[4]（2017）在《菘蓝毛状根培养体系的建立及其主要成分的诱导调控机制研究》一文中研究指出菘蓝为多年生草本植物,其根为板蓝根,是我国应用历史悠久的传统中药材。菘蓝在黑龙江省人工栽培资源丰富,但是存在着与农作物种植相互争地的矛盾。此外,菘蓝生长周期较长(2-3年),大田栽培很难满足其正常生长年限,致使菘蓝根药材中的主要活性成分(生物碱和黄酮类次生代谢化合物)含量往往过低。同时,菘蓝在大田栽培时易受到产地差异、气候变化、病虫害侵袭、土壤重金属和农药残留等诸多不利因素的影响,使得市场上所售菘蓝根药材品质良莠不齐,并造成了相关医药制剂临床治疗效果不佳等后果,己难以满足国内外市场日趋严苛的中药材质量要求。为解决上述问题,一条途径就是利用菘蓝根相关组织培养技术来代替传统大田栽培方式进行规模化生产药用次生代谢活性成分,另一条途径就是对菘蓝根中主要次生代谢活性成分的生物合成调控机制进行研究,以期利用基因工程技术高效生产目标活性成分。基于以上所述,本项研究首先建立了能够精确定性和定量分析菘蓝根中主要生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的LC-MS/MS分析方法,并利用该方法对菘蓝毛状根中目标活性成分的灵敏追踪为导向,建立了一个稳定高产生物碱和黄酮类活性成分的菘蓝毛状根培养体系,用以作为生产目标活性成分以及研究其相关生物合成调控机制的模式平台。其次,利用外源理化和生物诱导子胁迫处理菘蓝毛状根培养体系,并以目标次生代谢活性成分积累量为指标,优化并确定不同诱导子胁迫处理的最佳条件。最后,利用现有菘蓝基因资源和己报道的转录组测序数据进行深入挖掘和分析,筛选出参与生物碱和黄酮类活性成分生物合成路径的候选酶基因,通过分析系列诱导子胁迫处理菘蓝毛状根前后目标活性成分含量的变化规律,并结合目标活性成分生物合成候选酶基因的表达差异性规律,以期初步明确菘蓝毛状根中调控生物碱和黄酮类活性成分生物合成的潜在关键酶基因。本论文的主要研究内容及结果如下:1、建立了分析检测菘蓝根中主要生物碱和黄酮类活性成分的LC-MS/MS方法(1)分析检测6种生物碱类次生代谢活性成分的LC-MS/MS条件如下:色谱条件:Phenomenex Gemini C18 110A反相高效色谱柱(250 mm × 4.6 mm I.D.,5μm);流动相体系为乙腈(A)和水溶液(B);梯度洗脱流程为0-8 min 45-55%(A),8-9 min 55-85%(A),9-14 min 85%(A),14-15 min 85-45%(A),15-17 min 45%(A);柱温为30℃,流速为1.0mL/min,进样量为10μL。质谱条件:电喷雾负离子电离模式;最佳SRM条件下目标化合物离子对分别为表告依春m/z 127.8→58.0,靛红m/z 145.6→118.0,吲哚-3-甲醛m/z 143.9→115.1,色胺酮w/z 247.2→218.9,靛蓝m/z 261.0→217.0,靛玉红m/z 261.2→157.0。(2)分析检测8种黄酮类次生代谢活性成分的LC-MS/MS条件如下:色谱条件:Phenomenex Gemini C18 110A反相高效色谱柱(250 mm × 4.6 mmI.D.,5μm),流动相体系为乙腈(A)和0.001%甲酸水溶液(B);梯度洗脱流程为0-5 min 40-50%(A),5-13 min 50-60%(A),13-15 min 60-68%(A),15-16 min 68-40%(A),16-18 min 40%(A);柱温为30℃,流速为1.0mL/min,进样量为10μL。质谱条件:电喷雾负离子电离模式;最佳SRM条件下目标化合物离子对分别为芦丁和新橙皮苷m/z 609.3→301.4,蒙花苷m/z 591.4→283.1,甘草素m/z 255.9-→119.0,槲皮素m/z 301.0→151.0,异鼠李素m/z 315.0→300.1,山奈酚m/z 285.3-→183.1,异甘草素m/z 255.4→118.9。利用上述两种LC-MS/MS分析检测方法,既能够有效摒弃其他非目标杂质成分的干扰,又能够快速、灵敏和精确的定性和定量检测菘蓝根中14种目标次生代谢活性成分,适用于对后续菘蓝毛状根中痕量级目标次生代谢活性成分的分析检测。2、建立了菘蓝毛状根体外诱导转化体系及高产生物碱和黄酮的液体培养体系(1)选取3周龄菘蓝无菌苗叶柄为外植体,经发根农杆菌LBA9402侵染后在含有125.uM乙酰丁香酮和1.5 mM精氨酸的1/2MS培养基上共培养2天,转移到含有300 mg/L头孢噻肟钠的抑菌培养基中进行除菌处理,最终毛状根诱导率可达76.67%,且整个诱导周期仅需16天;同时以毛状根生长量和目标活性成分积累量为考察指标,筛选得到了高产生物碱的毛状根株系ITHRL Ⅲ和高产黄酮的毛状根株系ITHRL V,并进行了PCR分子鉴定。(2)利用BBD实验设计对高产目标活性成分的菘蓝毛状根株系的液体培养条件进行了系统优化,得到了高产生物碱的毛状根株系ITHRL Ⅲ的最佳培养条件如下:液体培养基类型1/2MS,培养基初始pH值5.8,培养温度24.7 ℃,蔗糖浓度3.14%,接种量0.75%和培养时间23天;高产生物碱的毛状根株系ITHRL V的最佳培养条件如下:液体培养基类型1/2MS,培养基初始pH值5.8,培养温度24.7℃,蔗糖浓度3.06%,接种量0.75%和培养时间24天。在上述最佳条件下,菘蓝毛状根培养体系Ⅲ中总生物碱的产量为521.77± 6.94μg/gDW),菘蓝毛状根培养体系V中总黄酮的产量为438.10 ±3.46μg/gDW,二者均明显高于2年生大田栽培菘蓝根中的总生物碱(464.69 ± 9.25 μg/g DW)和总黄酮(341.73±4.85μg/gDW)的含量。3、外源植物信号分子对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量和代谢调控研究(1)利用茉莉酸甲酯(MJ)、乙酰水杨酸(ASA)和水杨酸(SA)信号分子对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的诱导增量和代谢调控进行了研究。实验结果表明SA对生物碱类活性成分的诱导增量效果最佳,而MJ对黄酮类活性成分的诱导增量效果最佳;利用CCD实验设计分别优化得到了SA和MJ对菘蓝毛状根的最佳诱导条件,SA诱导增强23日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅲ生产生物碱的最佳条件为:SA浓度为142.61 μM和诱导时间为28.18 h,在此条件下总生物碱得率为3146.55 士 97.63μg/g DW,是未处理空白对照组中总生物碱得率(533.84 ± 13.02 μg/g DW)的5.89倍。MJ诱导增强24日龄菘蓝毛状根培养体系V生产黄酮的最佳条件为:MJ浓度为179.54 μM和诱导时间为41.87 h,在此条件下总黄酮得率为4963.15 ± 110.18μg/g DW,是未处理空白对照组中总黄酮得率(442.63±9.46μg/gDW)的11.21倍。(2)对现有菘蓝基因资源和已报道的转录组测序数据进行深入挖掘和分析,筛选到了参与生物碱和黄酮类活性成分生物合成路径的11个候选酶基因,并通过qRT-PCR分析这些候选酶基因转录表达水平的差异性变化规律,结合LC-MS/MS分析生物碱和黄酮类活性成分含量的变化规律,初步明确了 YUCCA单加氧酶(YUCCA)基因是SA诱导调控菘蓝生物碱生物合成路径中的潜在关键酶基因;查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因和黄烷酮3'-羟化酶(Flavanone 3-β-hydroxyalse,F3'H)基因是MJ诱导调控菘蓝黄酮生物合成路径中的两个潜在关键酶基因。4、紫外辐射对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量和代谢调控研究(1)利用UV-A、UV-B和UV-C对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的诱导增量和代谢调控进行了研究,实验结果表明UV-B对这两种次生代谢活性成分的诱导增量效果最好;UV-B诱导增强23日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅲ生产生物碱的最佳辐射剂量为162 kJ/m2,此条件下总生物碱含量为773.35 ± 28.19μg/g DW,是未处理空白对照组中总生物碱含量(526.09 ± 9.54μg/g DW)的1.47倍;UV-B诱导增强24日龄菘蓝毛状根培养体系V中黄酮积累的最佳辐射剂量为108 kJ/m2,此条件下总黄酮得率为7259.12 ±198.19μg/g DW,是未处理空白对照组中总黄酮得率(439.68 ± 8.27 μg/g DW)的16.51倍。(2)通过qRT-PCR分析菘蓝生物碱和黄酮生物合成路径中11个候选酶基因的转录表达水平,并结合LC-MS/MS分析生物碱和黄酮类活性成分含量的变化规律,初步明确了YUCCA基因是UV-B诱导调控菘蓝毛状根生物碱生物合成路径中潜在的关键酶基因;查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)基因是UV-B诱导调控菘蓝毛状根中黄酮生物合成路径中潜在的关键酶基因。此外,通过测定UV-B诱导前后菘蓝毛状根中抗氧化酶的活力变化以及粗提物的抗氧化活性变化,确定了菘蓝毛状根对UV-B诱导表现出了显着的氧化应激防御响应。5、固定化食用曲霉对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量和代谢调控研究(1)利用海藻酸钙固定化的食用黑曲霉孢子(IAN)菌球和米曲霉孢子(IAO)菌球对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的诱导增量和代谢调控进行了研究,实验结果表明IAN对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量效果最好;IAN诱导增强23日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅲ生产生物碱的最佳条件为:孢子量约105个/瓶、共培养温度30℃、pH 7.0和共培养时间48 h,在此条件下总生物碱得率为1378.89 ±33.47μg/gDW,是未处理空白对照组中总生物碱得率(535.83 ± 15.16μg/g DW)的2.57倍;IAN诱导增强24日龄菘蓝毛状根培养体系V生产黄酮的最佳条件为:孢子量约106个/瓶、共培养温度30℃、pH 7.0和共培养时间72 h,在此条件下总黄酮得率为3018.31 ±48.66μg/gDW,是未处理空白对照组中总黄酮得率(441.91 ± 7.35μg/g DW)的6.83倍。(2)IAN诱导能够使内源NO,SA和JA信号分子在菘蓝毛状根中发生顺序瞬时积累;NO在IAN诱导处理的菘蓝毛状根中会迅速产生和积累,在12 h时达到峰值(67.35 ± 5.61μmol/g FW),是未处理空白对照组中NO含量的7.21倍;SA的产生与积累稍微滞后于NO,在24 h时达到峰值(202.22 ±17.98 ng/gW),是未处理空白对照组中SA含量的8.15倍;JA的产生与积累则稍微滞后于SA,在48 h时达到峰值(20.74 ± 1.66 ng/g FW),是未处理空白对照组中JA含量的6.50倍。(3)通过qRT-PCR分析菘蓝生物碱和黄酮生物合成路径中11个候选酶基因的转录表达水平,并结合LC-MS/MS分析生物碱和黄酮类活性成分含量的变化规律,进一步阐明了 YUCCA可能是IAN通过内源SA信号分子介导调控菘蓝生物碱生物合成路径中的关键酶基因,CHI和F3'H可能是IAN通过内源JA信号分子介导调控菘蓝黄酮生物合成路径中的关键酶基因。此外,IAN菌球具有较好的重复使用性,在连续使用5次之后能够保持良好的生物诱导效果。本研究所建立的稳定高产生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的菘蓝毛状根培养体系,一方面为未来利用该离体器官培养体系工业化生产生物碱和黄酮类活性成分奠定理论基础,同时也为研究菘蓝这一非模式植物中生物碱和黄酮类活性成分生物合成调控机制提供一个理想的模式平台。此外,本研究利用诱导子技术既增强了菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类活性成分的产量,也初步明确了菘蓝毛状根中调控这些目标活性成分生物合成的一些关键酶基因,为未来利用代谢工程技术手段高效生产菘蓝药用次生代谢活性成分提供了重要的理论依据。同时,本研究为利用诱导子技术调控其他植物组织培养体系高效生产次生代谢活性成分以及阐明其生物合成关键调控酶基因提供了一定的实践经验和参考借鉴。(本文来源于《东北林业大学》期刊2017-03-01）
周姗,袁伯川,马永生,杨瑞,王礼强[5]（2016）在《特异性过表达SQS1基因的甘草毛状根培养体系的建立》一文中研究指出目的:建立根特异性过表达鲨烯合酶(SQS)基因的甘草毛状根培养体系。方法:构建根特异性过表达甘草SQS1基因的发根农杆菌ACCC10060工程菌;侵染甘草无菌苗胚轴,共培养48 h,以诱导毛状根的形成;多次除菌后,利用PCR法及测序法对诱导获得的甘草毛状根进行验证。结果:PCR结果显示扩增得到了长度约为730、580和1400 bp的基因片段,分别与烟草根特异性启动子TobRB7、发根农杆菌rolC基因和甘草SQS1基因长度一致;测序结果进一步确定了PCR扩增序列的正确性,从而证明了甘草根特异性过表达SQS1基因毛状根诱导成功。结论:获得了大量生长良好的特异性过表达SQS1基因的甘草毛状根,为研究功能基因SQS1与甘草酸次生代谢的相关性,及提高甘草毛状根中的甘草酸含量奠定了良好的实验基础。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2016年05期）
史美葳,杨淼,金秋,魏继承[6]（2016）在《罗勒毛状根培养体系的优化》一文中研究指出为寻找最佳罗勒毛状根培养体系优化方案,用四种发根农杆菌A4,R1601,C58C1,15834诱导药用植物罗勒外植体产生毛状根.实验从外植体、菌株、侵染时间、共培养四个因素优化罗勒毛状根培养体系.结果表明,用发根农杆菌R1601诱导罗勒叶片,预培养时间48h、共培养时间48h、侵染时间6min时,出根效果最好;用1/2MS液体培养基继代培养30d最佳.(本文来源于《牡丹江师范学院学报(自然科学版)》期刊2016年03期）
王礼强[7]（2016）在《甘草离体培养条件优化及转HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根培养体系的构建》一文中研究指出甘草是我国最常用的大宗药材之一,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等作用。但是近些年来人工栽培甘草的质量差异较大,存在着品质退化和甘草酸含量低等问题,难以达到《中国药典》规定的标准。为了解决甘草资源可持续发展以及甘草酸药源匮乏等问题,甘草组织培养的相关研究受到了越来越多的重视。本论文试图从甘草再生植株、原生质体以及毛状根叁个方面对甘草的离体培养进行研究,通过确定最佳的甘草再生植株诱导方案、甘草原生质体分离条件以及甘草毛状根诱导条件来建立完整的甘草组织培养体系,以期为基因工程研究及代谢工程研究奠定基础。此外,在确定了最佳甘草毛状根诱导条件的基础上,本论文进一步尝试了转基因甘草毛状根的诱导及培养,以甘草酸代谢途径上的叁个关键酶基因：3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)基因、鲨稀合成酶(squalene synthetase,SQS)基因以及β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因为目标基因,诱导根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因的甘草毛状根,不仅为进一步揭示甘草酸合成途径的分子调控机制奠定理论基础,也为离体条件下提高甘草酸的积累水平奠定研究基础。本论文共取得了如下研究结果：(1)建立了最佳的甘草离体培养再生体系,即：诱导培养基(MS+6.BA 0.5 mg·L-1 +2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1)、分化培养基(MS+6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1)及生根培养基(1/2MS+IAA 0.6mg·L-1)。(2)确定了最佳的甘草原生质体分离条件,即：以生长7 d甘草无菌苗的子叶为外植体材料,在4℃条件下于MS基本培养基上预培养12 h；以含有0.7 mol·L-1甘露醇作为渗透保护剂的CPW溶液进行酶液(1.5%纤维素酶+0.5%果胶酶)的配制；在25℃条件下静置酶解14 h。(3)从是否预培养、是否添加AS、外植体来源以及培养基类型4个方面对甘草毛状根的诱导条件进行了研究,并确定了最佳的诱导方案,即：以甘草胚轴为外植体,以6,7-V培养基作为基本培养基,且无需预培养,无需添加AS。(4)成功构建了根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因发根农杆菌工程菌并成功诱导得到根特异性过表达HMGR、SQS1、α-AS基因甘草毛状根。(5)利用Real time PCR检测了11份根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因甘草毛状根中各外源基因拷贝数,结果显示过表达ê-AS基因毛状根中ê-AS基因拷贝数为3、4或7个,过表达HMGR基因毛状根中HMGR基因拷贝数为3或5个,过表达SQS1基因毛状根中SQS1基因拷贝数为5或6个。(6)利用HPLC检测了35份毛状根样品,其中24份空白毛状根以及全部的根特异性过表达HMGR及SQS1基因毛状根样品中均未检出甘草酸,仅在3份根特异性过表达ê-AS基因的毛状根B1、B2及B3中检出甘草酸,从而证实了ê-AS基因相比于HMGR、 SQS1基因对甘草酸合成的影响更为直接。(本文来源于《北京中医药大学》期刊2016-06-01）
陈宇[8]（2016）在《白英毛状根培养与薯蓣皂苷元的获得》一文中研究指出白英(Solanum lyratum Thunb),常作为抗癌中草药用于治疗多种癌症。甾体皂苷类及甾体生物碱是白英全草及根中的主要药用活性成分,其中白英自然合成的一种非常重要的药用成分是薯蓣皂苷元。薯蓣皂苷元是一种重要的生产甾体避孕药和甾体激素类药物的原材料。目前作为工业化生产甾体药物重要原料的薯蓣皂苷元,资源消耗非常巨大,产量也不能满足市场的需要,如何开辟新的薯蓣皂苷元资源成为了一个亟待解决的课题。本研究建立了白英离体培养体系及快繁体系,为实验室快速获得白英无菌苗提供了技术支撑;建立了白英毛状根的遗传转化及培养体系并对其薯蓣皂苷元含量的动态变化进行了探索,为薯蓣皂苷元的生产提供了新的资源;同时,本实验建立了白英毛状根再生植株体系,并对比了野生型白英植株与白英毛状根再生植株中薯蓣皂苷元的含量,为获得遗传稳定的薯蓣皂苷元高产植株奠定了基础。1.本实验以白英叶片为外植体,消毒后进行离体培养,筛选得到了白英愈伤组织诱导及分化的最佳培养基。实验结果表明,白英外植体消毒的最佳方案是75%酒精消毒10 s后,用0.1%HgCl2消毒6 min;白英外植体愈伤组织诱导的最佳培养基是MS+1.0 mg?L-1 6-BA+0.15 mg?L-1 NAA;愈伤组织分化为丛生芽的最佳培养基是MS+2.0 mg?L-1 6-BA+0.1 mg?L-1 NAA。2.以白英叶片为外植体,利用农杆菌C58C1介导建立了白英毛状根的遗传转化体系,并对遗传转化的条件进行了优化,测定毛状根的生长曲线及薯蓣皂苷元含量的动态变化;利用HPLC检测不同白英毛状根单克隆中薯蓣皂苷元的含量。实验结果表明,白英叶片在菌液中浸染10 min,共培养4 d,抑菌培养时抗生素(Cef)浓度为500 mg?L-1时为毛状根诱导的最佳条件;白英毛状根的生长曲线及薯蓣皂苷元的动态合成曲线表明,培养36 d的白英毛状根中薯蓣皂苷元含量达到最高;对毛状根中薯蓣皂苷元含量的检测发现,实验获得的毛状根中薯蓣皂苷元含量均不同程度地高于野生型白英,获得的薯蓣皂苷元高产毛状根系中,薯蓣皂苷元含量和积累效率分别是野生型白英根的4.516倍和10.043倍。3.在白英毛状根液体培养的过程中发现,液体培养基中的毛状根生长10 d左右可自发产生不定芽,移出单独培养后可获得完整植株,经PCR检测鉴定这些植株为毛状根再生植株;实验以白英毛状根为原料,在含有不同浓度配比的激素培养基中诱导毛状根再生植株的产生,毛状根再生植株的诱导采用“一步法”,实验得到诱导丛生芽的最佳培养基为2.0 mg?L-16-BA+0.1 mg?L-1NAA+MS固体培养基,丛生芽诱导率为93.33%;利用HPLC对获得的毛状根再生植株进行检测,检测结果表明,两种方法得到的再生植株根、茎、叶中薯蓣皂苷元含量均高于野生型白英。其中含量最高的毛状根再生植株根、茎、叶中薯蓣皂苷元含量分别为3.430mg?g-1、2.993 mg?g-1、5.429 mg?g-1,分别是野生型白英根、茎、叶的3.060、3.127、3.117倍。将白英毛状根再生植株移入盆中进行栽培,生长状态良好,可迅速成活。本实验表明,利用发根农杆菌诱导得到的白英毛状根及毛状根分化得到的白英毛状根再生植株薯蓣皂苷元含量均有提高,为薯蓣皂苷元的工业化生产提供了新的资源。(本文来源于《西南大学》期刊2016-04-20）
焦骄[9]（2016）在《黄芪毛状根培养体系的优化及其主要活性成分生物合成的诱导调控研究》一文中研究指出黄芪是黑龙江省极具发展和应用前景的大宗林下药用植物资源,通常以3-5年所采收的干燥根入药,由于多年的滥采滥挖,黑龙江省的野生黄芪资源已濒临灭绝,而黄芪栽培种的品质退化以及皂苷和异黄酮类有效成分含量易受环境变化和病虫害等影响,已造成它们质量下降和临床治疗效果不佳等不良后果。利用植物组织培养技术生产药用次生代谢活性成分并阐明其生物合成机制,现已成为现代林业生物制剂和森林植物次生代谢工程研究的重要内容。本研究优化并建立了一个高效快速的黄芪毛状根体外诱导体系,系统筛选出了高产皂苷和异黄酮类活性成分的毛状根株系,并通过PCR分析实现对其分子鉴定。同时利用相关数理统计实验设计和动力学模型,系统优化了黄芪毛状根的液体培养条件,并对其中皂苷和异黄酮次生代谢活性成分进行了LC-MS/MS定性和定量分析检测。通过外源理化和生物诱导子胁迫处理黄芪毛状根培养体系,利用LC-MS/MS技术分析诱导处理前后黄芪毛状根中皂苷和异黄酮类活性成分含量的变化规律,并结合qRT-PCR技术分析诱导处理前后黄芪毛状根中皂苷和异黄酮生物合成酶基因的表达差异性规律,最终初步阐明黄芪中皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分生物合成路径中的关键调控酶基因。本论文的主要研究内容及结果如下：1、优化黄芪毛状根培养体系高效生产皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分(1)选取3周龄黄芪无菌苗叶片作为外植体,经发根农杆菌LBA9402侵染后在含有100μM乙酰丁香酮浓度的MS培养基上共培养2天,然后转移到含500 mg/L头孢噻肟钠浓度的抑菌培养基中培养,最终能够达到66.84%的毛状根诱导率,而且整个诱导周期只需13天。以毛状根生长量和次生代谢活性成分积累量为考察指标,筛选得到高产皂苷的毛状根株系AMHRL Ⅵ和高产异黄酮的毛状根株系AMHRL Ⅱ,并进行了PCR分子鉴定。(2)利用CCD实验设计和Slogistic动力学模型对高产皂苷的黄芪毛状根株系AMHRLVⅥ液体培养条件进行了系统的优化,得到最佳液体培养条件如下：培养温度27.8℃,接种量1.54%,蔗糖浓度3.24%和培养时间36天。利用BBD实验设计对高产异黄酮的黄芪毛状根株系AMHRL Ⅱ液体培养条件进行了系统的优化,得到最佳液体培养条件如下：培养温度27.8℃,接种量1.44%,蔗糖浓度3.39%和培养时间34天。利用LC-MS/MS对黄芪毛状根中的6种皂苷类单体成分和5种异黄酮类单体成分进行了定性和定量分析。在最佳培养条件下,黄芪毛状根培养体系中总皂苷(2.657±0.088 mg/g DW)和总异黄酮(234.77土4.27μg/g DW)产率,明显高于3年生栽培黄芪中的总皂苷(2.435±0.093 mg/g DW)和总异黄酮产率(187.38土7.25 gg/g DW)。2、植物信号分子对黄芪毛状根培养体系中皂苷和异黄酮生物合成的诱导调控(1)利用茉莉酸甲酯(MJ)、乙酰水杨酸(ASA)和水杨酸(SA)信号分子对黄芪毛状根中皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分的生物合成进行了诱导调控。诱导实验策略结果表明MJ对生长处于平台期的黄芪毛状根(34日龄)中次生代谢活性成分的生物合成诱导效果最佳。利用CCD实验设计优化并确定了最佳MJ诱导条件。MJ诱导增强34日龄黄芪毛状根培养体系Ⅵ生产皂苷的最佳条件为：MJ浓度157.4μM和诱导时间18.4 h。在此条件下总皂苷得率为5.547±0.133 mg/g DW,是未处理空白对照组中总皂苷得率(2.685±0.051mg/gDW)的2.07倍。MJ诱导增强34日龄黄芪毛状根培养体系Ⅱ生产异黄酮的最佳条件为：MJ浓度283 μM和诱导时间33.75 h。在此条件下总异黄酮得率为2250.10±71.88μg/gDW,是未处理空白对照组中总异黄酮得率(231.64±6.51μg/g DW)的9.71倍。(2)通过qRT-PCR分析皂苷和异黄酮生物合成路径中19个酶基因的转录表达水平,并结合LC-MS/MS分析皂苷和异黄酮类活性成分含量的变化规律,初步阐明了MJ诱导调控皂苷和异黄酮生物合成路径中的关键酶基因。实验结果表明MVD、IDI、FPS和SS是MJ诱导调控黄芪皂苷生物合成路径中的关键酶基因；CHI和IFS是MJ诱导调控黄芪异黄酮生物合成路径中的关键酶基因。此外,MJ诱导后黄芪毛状根培养体系中抗氧化酶的活力以及提取物的抗氧化活性显着增强,确定了黄芪毛状根对MJ诱导表现出了显着的氧化应激防御响应。3、UV辐射对黄芪毛状根培养体系中皂苷和异黄酮生物合成的诱导调控(1)利用UV-A、UV-B和UV-C对黄芪毛状根中皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分的生物合成进行了诱导调控,实验结果表明UV-B对这两种次生代谢活性成分的生物合成诱导调控效果最好。UV-B诱导32日龄黄芪毛状根培养体系Ⅵ生产皂苷的最佳辐射剂量为54 kJ/m2,在此条件下总皂苷得率为3.431±0.092 mg/g DW,是未处理空白对照组中总皂苷得率(2.645±0.073 mg/g DW)的1.30倍。UV-B诱导增强34日龄黄芪毛状根培养体系Ⅱ中异黄酮积累的最佳辐射剂量为86.4 kJ/m2,此条件下总异黄酮得率为533.54±13.61μg/g DW,是未处理空白对照组中总异黄酮得率(232.93±3.08μg/g DW)的2.29倍。(2)利用qRT-PCR分析了黄芪皂苷和异黄酮生物合成路径中19个酶基因的转录表达水平,并结合LC-MS/MS分析皂苷和异黄酮类活性成分含量的变化规律,初步阐明了UV-B诱导调控黄芪皂苷和异黄酮生物合成路径中的关键酶基因。实验结果表明HMGR是UV-B诱导调控黄芪皂苷生物合成路径中唯一的关键酶基因;PAL和C4H是UV-B诱导调控黄芪异黄酮生物合成路径中的两个关键酶基因。此外,UV-B诱导后黄芪毛状根培养体系中抗氧化酶的活力以及提取物的抗氧化活性显着增强,确定了黄芪毛状根对UV-B诱导表现出了显着的氧化应激防御响应。4、真菌生物转化和生物诱导双重作用促进黄芪毛状根培养体系中黄芪甲苷的富集(1)基于课题组首次分离出来的一株可产脱乙酰化酶的灰变青霉属真菌Penicillium canescens,本研究构建了海藻酸钙固定化的P. canescens孢子小球(IPC)和黄芪毛状根共培养体系,一方面利用IPC所具有的脱乙酰化作用将一些低活性的黄芪甲苷前体衍生物(黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和异黄芪皂苷Ⅱ)转化为高活性的黄芪甲苷,另一方面利用其生物诱导效应进一步增强黄芪毛状根中黄芪甲苷和异黄酮类活性成分的合成与积累。(2)IPC在黄芪毛状根培养体系Ⅵ中脱乙酰生物转化的最佳条件为：固定化孢子量为105个/瓶、共培养温度30℃、pH 7.0和共培养时间60 h。在此条件下,黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和异黄芪皂苷Ⅱ几乎能够完全转化为黄芪甲苷。同时,IPC还能够显着诱导大部分皂苷生物合成酶基因(AACT、HMGS、HMGR、MK、FPS、SS、SE和CAS)转录表达水平上调。在IPC脱乙酰化生物转化及其生物诱导双重作用之下,黄芪甲苷得率(2.816±0.052 mgg/g DW)相对于未处理空白对照组(0.193±0.007 mg/gDW)增加了14.59倍。此外,IPC处理的黄芪毛状根中总异黄酮得率为673.21土10.75μg/g DW,是未处理空白对照组中总异黄酮得率(236.97±3.50μg/g DW)的2.84倍。IPC同样能够显着诱导异黄酮生物合成酶基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHR、CHI、IFS和13'H)转录表达水平上调。IPC还具有优异的稳定性,能够在60天贮存周期内保持其脱乙酰化活性和生物诱导效果稳定。此外,IPC在重复使用6次之后仍能保持良好的脱乙酰化活性和生物诱导效果,为后续利用该技术手段工业化生产黄芪甲苷奠定了坚实的基础。皂苷和异黄酮类化合物不仅仅是植物次生代谢活性成分,还可以作为植保素用以提高植物的抗逆性,确定它们生物合成路径中的关键酶,为未来利用分子育种来改良和培育新的抗性药用植物品种,或利用植物次生代谢工程技术手段高效生产药用活性成分,都具有重要的意义!(本文来源于《东北林业大学》期刊2016-03-01）
李林轩,韦坤华,姚绍嫦,唐美琼,韦范[10]（2016）在《山豆根毛状根培养体系的建立与优化》一文中研究指出为探索定向培养山豆根植物细胞及器官获取有效药用成分的新途径,为山豆根有效药用成分的大规模生产奠定基础,采用共培养法研究发根农杆菌R1601感染诱导山豆根无菌苗子叶产生毛状根,并在此基础上从不同培养液、不同蔗糖浓度和外源激素对毛状根生长的影响方面筛选山豆根毛状根生长的最佳培养液。结果表明:利用发根农杆菌R1601感染山豆根无菌苗子叶16min,在MS+AS 100μmol/L的固体培养基上培养可诱导产生毛状根,且诱导率最高,达66.67%;1/2 MS+IAA 0.5mg/L+5%蔗糖的培养液最有利于山豆根毛状根的生长。(本文来源于《贵州农业科学》期刊2016年01期）
毛状根培养论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
毛状根培养体系作为生物技术在中药中应用的一种技术,是药用植物研究领域的新途径、新方法,受到很多物理因素和化学因素的影响。就药用植物毛状根培养体系的影响因素进行综合阐述,为相关研究和应用提供参考。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
毛状根培养论文参考文献
[1].尹彦超.基于毛状根培养体系的甘草CHS及CHI基因功能研究[D].北京中医药大学.2019
[2].齐立雨,李汶聪,赵雪.不同因子对药用植物毛状根培养的影响[J].黑龙江科学.2019
[3].邹凯,刘泽波,许小向,上官新晨,尹忠平.甜叶菊毛状根培养系统的建立及绿原酸类成分的诱导[J].现代食品科技.2017
[4].盖庆岩.菘蓝毛状根培养体系的建立及其主要成分的诱导调控机制研究[D].东北林业大学.2017
[5].周姗,袁伯川,马永生,杨瑞,王礼强.特异性过表达SQS1基因的甘草毛状根培养体系的建立[J].生物技术通讯.2016
[6].史美葳,杨淼,金秋,魏继承.罗勒毛状根培养体系的优化[J].牡丹江师范学院学报(自然科学版).2016
[7].王礼强.甘草离体培养条件优化及转HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根培养体系的构建[D].北京中医药大学.2016
[8].陈宇.白英毛状根培养与薯蓣皂苷元的获得[D].西南大学.2016
[9].焦骄.黄芪毛状根培养体系的优化及其主要活性成分生物合成的诱导调控研究[D].东北林业大学.2016
[10].李林轩,韦坤华,姚绍嫦,唐美琼,韦范.山豆根毛状根培养体系的建立与优化[J].贵州农业科学.2016
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