基因Ⅶ型新城疫病毒重组沙门氏菌微环DNA疫苗的构建及免疫效应研究

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是严重危害禽类养殖的疾病之一。作为我国一类动物疫病,目前防止该病主要手段以疫苗为主,然而目前商品化疫苗依然存在生产成本高、免疫方式繁琐等缺点。因此研究针对基因Ⅶ型新城疫病毒的新型疫苗具有重要的意义。DNA疫苗由于其不受母源抗体干扰等独特优势,近年来引起了研究人员极大兴趣。然而传统DNA疫苗由于尺寸等因素的限制减弱了其向细胞核转移的能力,降低了抗原蛋白的表达效率,减弱了免疫反应。为了克服以上缺点,本研究应用微环DNA（minicircle DNA,mcDNA）作为抗原表达框。mcDNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框,其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列,提高了在临床应用中的安全性。同时利用一种延迟裂解型减毒沙门菌作为疫苗活载体,进一步提高疫苗的递送效率,为新型基因Ⅶ型新城疫疫苗的研发提供思路。本研究的主要内容及结果如下。1.微环质粒的构建本研究选取Cre/loxP系统介导mcDNA的产生,并通过严格真核表达启动子PGK来调控Cre在细胞内的表达,避免其在进入细胞之前的表达,影响疫苗效果。将片段PGK-Cre与含有Cre识别位点lox66/71的真核表达载体pYL19连接得到微环生产质粒pYL46。2.微环质粒效果评价将质粒pYL46转染HEK-293T后通过间接免疫荧光验证了Cre重组酶及EGFP的表达,同时提取细胞DNA,通过PCR验证了mcDNA的产生。提取转染后细胞核,通过荧光定量PCR,证明了mcDNA入核效率高于亲本质粒（patental plasmids,PP）2倍左右。提取转染后细胞RNA,反转录荧光定量PCR证明了mcDNA EGFP相对表达量高于亲本质粒1.5-2倍左右。转染后细胞提取蛋白后Western-blot灰度值分析结果与荧光定量PCR结果一致,EGFP相对表达量高于亲本质粒2倍左右。将mcDNA转化至沙门菌χ11218后,灌服30日龄雏鸡,7日后肝脏荧光成像结果表明其在肝脏EGFP表达量高于亲本质粒2倍左右。肝脏荧光定量PCR结果与荧光结果一致。综上,体内外实验证明微环生产质粒pYL46具有入核效率高、外源基因转录数量多、相对表达量高的优点。3.疫苗菌株的构建及其免疫效果评价将质粒pYL19、pYL46的EGFP替换为基因Ⅶ型新城疫病毒抗原HN分别命名为pYL43、pYL47并电转至延迟裂解型沙门菌载体χ11218中,获得疫苗株χ11218（pYL43）和χ11218（pYL47）。第一次动物实验选取肉鸡作为实验动物,第0、14、28、42天（首次免疫为0天）对雏肉鸡进行免疫,免疫剂量为1×109CFU/羽。流式细胞术检测外周血中T淋巴细胞数量的变化,CD3+CD4+T细胞χ11218（pYL47）组和生理盐水组与χ11218（pYL43）组相比差异显著（P<0.05）,分别增加20%与15%左右,但效果不如商品化疫苗组;CD3+CD8+T细胞χ11218（pYL47）组和χ11218（pYA4545）组与χ11218（pYL43）组相比差异显著（P<0.05）,均增加12%左右,与疫苗组相比没有显著差异。淋巴增殖刺激指数（Stimulate Index,SI）结果表明χ11218（pYL47）与对照组相比能增加淋巴细胞增殖能力,差异极显著（p?0.001）,与χ11218（pYL43）相比,有升高趋势,但差异不明显。血清ELISA结果显示χ11218（pYL47）与对照组相比能使雏鸡机体产生更多的IL-4（50ng/L）与NDV特异性抗体（500pg/mL）。四免后两周对雏鸡进行攻毒保护实验,使用NDV NA-1株,攻毒剂量为106ELD50/羽。攻毒保护实验中χ11218（pYL47）（80%）与对照组（20%）相比能提高雏鸡存活率。第二次动物实验使用蛋鸡作为实验动物,补充了第一次实验的不足,免疫后χ11218（pYL47）依然能增加蛋鸡血清中NDV特异性抗体的含量,攻毒后肺部病毒TCID50结果显示,与对照组相比,χ11218（pYL47）能降低肺部病毒滴度,10天后χ11218（pYL47）组雏鸡存活率为50%,高于χ11218（pYL43）（37.5%）及对照组（12.5%）。两次动物实验攻毒后肺部病理切片显示χ11218（pYL43）,χ11218（pYL47）均能在一定程度上减轻雏鸡肺部病变,对雏鸡有一定的保护作用。以上结果说明了含有微环质粒的延迟裂解型重组沙门菌具有一定保护作用,为基因Ⅶ型新城疫病毒的重组沙门氏菌微环DNA疫苗的研发提供了新的方法和思路。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高兴

导师: 王春凤,姜延龙

关键词: 微环,基因,基因型新城疫,延迟裂解型减毒沙门菌

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

基金: 国家自然科学基金项目(31602092,31672528),国家重点研发计划项目(2017YFD0501000)

分类号: S852.4

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000092

总页数: 53

文件大小: 3291K

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标签：微环论文;  基因论文;  基因型新城疫论文;  延迟裂解型减毒沙门菌论文;