一、检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究（论文文献综述）
徐峰,饶跃峰,张幸国,朱育银,车洋[1]（2020）在《宁波地区结核分枝杆菌基因突变位点确证及与异烟肼、利福平耐药关系研究》文中进行了进一步梳理目的阐明宁波地区初治肺结核患者结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因突变特征,深入分析基因突变与异烟肼、利福平耐药关系,为临床抗结核治疗提供科学依据。方法采用1%比例法对2 455例结核分枝杆菌临床分离株进行药敏检测,对其中的耐药菌株和部分全敏菌株提取DNA,PCR扩增,对耐药菌株katG、inhA、rpoB基因测序,分析3种基因特征及基因突变与单耐药、耐多药关联性。结果 2 455例结核分枝杆菌临床分离株中,发现108例耐药结核分枝杆菌,其中单耐药75例（单耐异烟肼51例,利福平24例）,单耐药率为3.05%;33例耐多药,耐多药率为1.34%。33例耐多药菌株中,5例发生inhA基因错义突变,突变率为15.15%（5/33）,rpoB基因450位点（ser450leu）突变率为51.52%（17/33）,katG基因315位点（ser315thr）突变率为87.88%（29/33）,463位点（arg463leu）突变率为78.79%（26/33）。24例单耐利福平菌株中有17例发生rpoB基因错义突变,突变率为70.83%（17/24）,主要在446位点（lys446lysarg）发生,该位点突变率为45.83%（11/24）。51例单耐异烟肼菌株中有45例发生katG基因错义突变,突变率为88.23%（45/51）,315位点（ser315thr）突变率为72.55%（37/51）,463位点（arg463leu）突变率为64.71%（33/51）;22例发生inhA基因错义突变,突变率为43.14%（22/51）,145位点（val145valgly）突变率为27.45%（14/51）;5例发生rpoB基因错义突变,突变率为9.80%（5/51）,位点较分散。另外,108例耐药菌株中,有11例菌株发生rpoB、katG、inhA多基因联合突变,且在大多数位点发生错义突变,突变率为10.18%（11/108）。结论 rpoB、katG、inhA基因在450（ser450leu）、315（ser315thr）、446（lys446lysarg）、463（arg463leu）、145（val145valgly）等位点突变和宁波区结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药密切相关,其中rpoB、inhA基因的主要突变位点和突变频率存在明显地区差异。
王丹吉[2]（2019）在《基因芯片应用效果评价及耐药基因突变与治疗结局关联研究》文中指出研究背景与目的中国是全球30个结核病高负担国家之一,据WHO最新报告结果显示结核病估算新发病人数为88.9万,发病人数位于高负担国家的第二位。2017年,全球有近60万利福平耐药/耐多药患者（RR/MDR-TB）,其中MDR-TB 45.7万例,MDR-TB已成为控制结核病流行的主要难点之一。根据WHO公布数据2017年中国估算新发MDR/RR-TB患者7.3万人,仅次于印度,位居全球第二,约占到全球估算总数的13.1%。但是我国的RR/MDR-TB患者登记数只有近1万人,仅占估算数的17%,在金砖五国中排末位,中国极低的MDR-TB发现率已成为MDR-TB疫情居高不下的关键因素。传统药敏耗时较长,灵敏度和时效性较差,严重影响了 MDR-TB的早期发现。为了提高耐药诊断速度,世界卫生组织2007-2015年陆续推荐了多种基因检测技术。基因芯片技术是基于多重PCR并结合反向杂交的耐多药基因检测试剂盒,该技术能根据检测位点的突变情况快速检测出利福平与异烟肼耐药结果,并判断结核分枝杆菌耐多药情况,既往研究显示该方法的灵敏度和特异度都很高。根据国家结核病“十三五”规划要求,全国将逐步推广MDR-TB快速诊断技术,2017年以来江苏省全面实施结核病分级诊疗综合防治服务模式,积极推广结核病新诊断技术,但是目前应用大样本痰标本直接评估基因芯片技术有效性和适用性的研究还很少。本研究收集大样本的涂片阳性患者的标本,以传统药物敏感结果为金标准,评估基因芯片技术在地市级结核病定点医院开展的效价性。2017年全球MDR/RR-TB患者平均治疗成功率为55%,而我国MDR/RR-TB患者治疗成功率仅为41%,在30个结核病高负担国家中居末位。MDR-TB患者极易在治疗中发生获得性耐药,引发对于喹诺酮类以及二线注射剂药物的进一步耐药,而标准耐多药治疗方案中又包含喹诺酮类药物与二线注射剂。全球9.7%的MDR-TB会进一步发展成为Pre-XDR-TB或XDR-TB。对于这些MDR-TB患者,临床医生一方面要监测与预防患者对其他药物发生耐药,另一方面,对于在治疗中获得性耐药的患者需要做到及时发现、变更治疗方案。国外研究发现耐药基因突变不仅可引发不同的耐药水平,甚至可以将耐药基因突变作为预测MDR-TB患者治疗结局的标志物。目前江苏省还未见报道过抗结核药物的耐药基因突变与MDR-TB患者治疗结局的关联研究。探寻分子层面的耐药基因突变对于治疗结局的影响将对于协助临床做出合理治疗决策有重要意义。研究方法研究对象为2014年1月至2016年7月在江苏省连云港市第四人民医院连续纳入的痰涂片阳性的结核病患者,对其开展利福平、异烟肼的固体培养与传统比例法药物敏感性试验,同时直接应用痰标本开展基因芯片检测,检测位点包括利福平耐药基因rpoB531、526、516、533、511、513的六个位点,异烟肼的耐药基位点katG315与InhA-15。以传统药敏试验结果为金标准,计算基因芯片在检测利福平、异烟肼方面的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值以及一致率。2013-2014年在江苏省的连云港市、镇江市、南通市、泰州市、常州市连续纳入具有完整治疗记录的MDR-TB患者,并随访调查获取MDR-TB患者治疗结局的资料（见附录）。对耐多药患者进行利福平、异烟肼、氧氟沙星和卡那霉素的传统药敏试验。在开始标准耐多药方案治疗前,提取MDR-TB患者核酸并进行DNA测序,测序的耐药基因主要包括一线抗结核药物利福平的耐药基因rpoB相关突变位点、异烟肼的耐药基因katG和InhA启动子区域、吡嗪酰胺的耐药基因pncA、rpsA、二线抗结核药物喹诺酮类药物耐药基因gyrA和gyrB、以及二线注射剂药物耐药基因rrs基因和eis启动子区域。应用DNA测序比对软件ApE将测序结果与标准菌株H37RV的碱基序列比对,在EXCEL中整理各耐药基因在相关位点的突变频率与突变类型。最后将所有数据导入spss25.0中,应用卡方检验、多因素logistics回归分析方法探索耐多药结核病患者治疗结局的影响因素。研究结果在同时开展传统药敏试验与基因芯片检测的1297涂片阳性患者中,最终共有1100例纳入最终的基因芯片诊断价值的研究中。以传统药敏为金标准,基因芯片技术诊断利福平耐药的灵敏度与特异度分别为84.48%,98.18%,一致率为97.45%,阳性预测值与阴性预测值分别为72.06%,99.13%;基因芯片技术诊断异烟肼耐药性的灵敏度与特异度分别为81.91%,97.42%,一致率为96.09%,阳性预测值与阴性预测值分别为74.76%,98.29%。基因芯片技术诊断MDR-TB的灵敏度为80.56%,特异度为99.15%,一致率为98.55%,阳性预测值与阴性预测值分别为76.32%,99.34%。利福平耐药相关rpoB基因526、531、526、516、533、511、513位点上共检测突变68例,其中在rpoB531位点突变频率最高为36.76%、526位点上耐药突变率达到19.12%。异烟肼耐药相关katG基因315位点与InhA-15位点上共检测到突变103例,katG315位点突变达60.19%,InhA-15突变率分别达33.01%。基因芯片共检出38例耐多药患者,其中17例（44.74%）出现了 rpoB531位点突变、8例（21.05%）出现了 rpoB526位点突变,28例（73.68%）出现了 katG315位点突变、9例（23.68%）出现了 InhA-15位点突变。2013-2014年在江苏省五个地级市的结核病定点医院共纳入的87例的耐多药患者,71例MDR-TB患者有相关治疗结局信息。通过对71例MDR-TB患者菌株进行测序发现突变率最高的是rpoB基因,在71例MDR-TB中突变率为93%;其他耐药基因突变率由高到低依次是katG基因（77.5%,55/71）、pncA基因（33.8%,24/71）、gyrA 基因（32.4%,23/71）、eis 基因（15.5%,11/71）、rrs 基因（12.7%,9/71）、gyrB 基因（12.7%,9/71）、InhA（11.3%,8/71）、rpsA 基因（4.2%,3/71）。单因素logistic回归分析结果显示,复治患者（P=0.04,OR=2.79,95%CI:1.046-7.466）、非规范治疗（P=0.01,OR=4.72,95%CI:1.547-14,171）、PZA 基因型耐药（P<0.01,OR=4.16,95%CI:1.485-11.635）、pncA 基因突变（P<0.01,OR=5.29,95%CI:1.764-15.888）以及 gyrA 基因突变（P=0.02,OR=3.75,95%CI:1.245-11.299）是不良治疗结局的危险因素。多因素logistic分析结果显示年龄大于54岁（P=0.04,OR=6.11,95%CI:1.080-34.533）、非规范治疗（P<0.01,OR=7.47,95%CI:1.896-29.436）以及 pncA 基因突变（P=0.01,OR=7.68,95%CI:1.879-31.400）是 MDR-TB 患者不良治疗结局的危险因素。研究结论基因芯片技术直接检测痰标本的利福平与异烟肼的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标值均较高。基因芯片技术对MDR-TB诊断价值较高,可在结核病医院广泛推广应用。吡嗪酰胺的耐药基因pncA基因突变、未规范治疗、年龄大于54岁等因素是MDR-TB患者不良治疗结局间存在较强的关联性,复治患者以及喹诺酮的耐药基因gyrA可能是导致不良治疗结局的危险因子。
王先化[3]（2015）在《新疆地区TB合并HIV感染流行病学分析及耐药结核分子机制研究》文中指出研究背景及目的:我国目前结核病疫情仍十分严重,艾滋病感染率呈现逐年增多,两者合并感染的机会显着增加,使结核或艾滋病治疗和控制愈加困难,死亡危险性更高。因此,对高危人群进行HIV感染早期筛查,并同时在HIV感染者中筛查结核病患者,为早期治疗、改善预后以及有效地防控结核感染和与HIV合并感染的传播提供科学依据。然而,结核疫情防治更为严峻的是结核耐药菌株不断增多,结核的发病率逐年增加,严重威胁着人们的身体健康;因此,开展新疆地区的耐药分布情况的调查分析十分重要。初步的科学研究显示结核菌耐药与其基因的突变有关,从基因水平上了解结核耐药的分子机制,有利于建立一种特异、敏感检测方法用于结核感染筛查和耐药患者治疗方案筛选;尤其受到环境因素的影响,不同地区的结核耐药菌株的基因突变情况可能存在较大差异。因此,研究一个地区的结核杆菌基因突变及结核菌的耐药突变基因情况,探讨细胞因子诱导SRC同源2域蛋白（Cytokine-inducible SRC homology 2（SH2）domain protein,CISH）对机体结核感染易感性,了解新疆地区维吾尔族人群CISH基因多态性对当地人群结核发病的影响;可为结核病有效防控提供科学依据。研究方法:采用流行病学横断面调查方法,通过对新疆地区TB/HIV双重感染患者的流行病学特征以及危险因素进行分析,了解我国西部边疆少数民族地区TB合并HIV感染情况。采用分子流行病学方法,收集了2012-2013年乌鲁木齐市四区登记的结核菌培养阳性的菌株,并对菌株进行药敏检测,对药物耐药情况进行分析,观察在初治和复治患者中的结核耐药菌株分布情况。采用改良罗氏培养基比例法计算菌株的耐药百分比,基因测序法进行测序,采用Lasergene软件中的GeneAlign将测序结果与标准菌株H37Rv的基因序列进行比对,确定基因突变位点。采用病例对照研究方法,通过Haploview软件选择CISH基因SNP位点,利用SnapShot法进行SNP基因型的检测,并构建SNPs单倍型。研究结果:1.本次调查共登记结核病人3657例,检测HIV抗体2645例,HIV抗体检测率为72.3%,HIV抗体阳性者128例,阳性检出率为4.8%。≥35岁的结核病患者感染HIV的风险为18-35岁患者的0.26倍（95%CI:0.18-0.40）,痰涂片呈阳性的肺结核患者、肺外结核患者感染HIV的风险分别是痰涂片阴性患者的0.43倍（95%CI:0.28-0.66）和1.79倍（95%CI:1.09-2.94）。此次调查共登记HIV感染/AIDS病人2714例,随访到1284例,其中进行结核病筛查1195例,筛查率为93.1%,共发现结核病感染91例,感染率为7.6%。男性HIV感染者/AIDS病人感染结核杆菌的风险为女性的12.2倍（95%CI:6.4-23.1）,CD4细胞数量≤200的HIV感染者/AIDS病人感染结核杆菌的风险为CD4细胞数量>200的20.4倍（95%CI:11.8-35.3）。2.新疆地区结核菌株除对AMK的耐药率低于20%外,对其它一线及二线抗结核药物的耐药率都高于30%。而且复治患者的结核菌耐药率明显高于初治患者的结核菌耐药率。对一线抗结核药物的耐药率为54.9%,初治患者对一线抗结核药物的耐药率为35.7%,复治患者对一线抗结核药物耐药率为81.6%。在4种一线抗结核药物中对INH的耐药率最高为46.1%。对EMB的耐药率最低为26.8%。对二线抗结核药物的耐药率为46.1%,初治患者对二线抗结核药物的耐药率为33.3%。复治患者对二线抗结核药物的耐药率为64.3%。在3种二线抗结核药物中,对OFLX的耐药率最高为36.7%,对AMK的耐药率最低为16.2%。3.rpoB基因突变率为59.77%。突变范围为从505位密码子至572位密码子,共有11个位点和14个类型。52例突变菌株中有1例为密码子CAC-TGC的双碱基突变,剩余的都是密码子单碱基突变。基因突变类型有点突变和两个密码子的联合突变。其中52例突变菌株中点突变有44株（84.6%）。突变的密码子为505、516、526、531、533等5个密码子,531位密码子突变最常见。排在第二位的是526位密码子的突变。剩余的8例突变结核菌株为存在两个密码子的联合突变。有18例突变菌株存在katG或inhA基因突变,或两者同时突变。4.与健康对照组相比,CISH基因多态性位点rs17051025在结核病组中的等位基因A的频率高于对照组（P<0.05）,基因型AA在结核病组中的频率也是高于健康对照组（P<0.05）。与健康对照组相比,CISH基因多态性位点rs2239751在结核病组中等位基因A的频率较高（P<0.05）。主要的6种单倍体中有三种单倍体（TCCG,ACAG,TCAG）因为其频率小于5%,所以没有进行相关统计。还有三种单倍体组间没有差异。结论:新疆地区结核合并HIV双重感染的比例较高,≥35岁/涂片呈阳性/肺外结核的结核病患者和男性/CD4细胞数量≤200的HIV感染者为高危人群。应进行TB/HIV双向筛查。新疆地区结核菌株对一线及二线抗结核药物的耐药率较高。新疆地区大部分结核菌株耐药基因的突变类型与以往的研究结果是一致的。我国维吾尔族人群中CISH基因SNPs与结核易感性相关,在4个多态性位点中rs17051025及rs2239751是危险因素。建议加强我国西部边疆少数民族地区TB和HIV以及耐药的防控工作,尤其要重视TB合并HIV感染以及耐药结核分子机制方面的探索。
于璐,孟存仁,张朝霞[4]（2014）在《聚合酶链反应-单链构象多态性检测rpoB基因突变对结核分支杆菌耐利福平诊断价值的Meta分析》文中认为目的系统评价聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）对结核分支杆菌rpoB基因突变耐利福平的诊断价值。方法计算机检索PubMed、Web of Science、h e Cochrane Library（2014年第2期）、CBM、VIP和WanFang Data,查找PCR-SSCP与金标准（常规体外药敏试验结果）比较检测结核分支杆菌rpoB基因突变的诊断性研究,检索时限均为从建库至2014年1月。由2位评价员按照纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料和方法学质量评价后,采用Meta-DiSc 1.4和Stata 12.0软件进行Meta分析。结果最终纳入10个研究,包括1 229例标本。Meta分析结果显示:①SEN合并=0.92[95%CI（0.90,0.94）,P=0.019 3]、SPE合并=0.97[95%CI（0.95,0.98）,P<0.000 1]、+LR合并=23.68[95%CI（8.71,64.37）,P<0.000 1]、–LR合并=0.10[95%CI（0.06,0.15）,P=0.023 1]和DOR合并=257.16[95%CI（96.82,683.02）,P=0.020 0],SROC曲线下面积（AUC）为0.971 5,Q*指数0.922 3。②分别剔除样本量<100例、中文研究以及QUADAS评分>10分的研究行敏感性分析,结果显示剔除文献后各诊断结果稳定,提示结论较为可靠。结论 PCR-SSCP检测rpoB基因突变诊断结核分支杆菌耐利福平具有较高的临床应用价值。
唐佩军[5]（2012）在《基因芯片法快速检测结核分枝杆菌KatG、inhA和rpoB基因突变及其与INH和RFP耐药相关性的研究》文中研究表明由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）感染引起的肺结核（Pulmonary tuberculosis, PTB）是世界范围内的重大流行病和传染病。抗结核常规有效药物异烟肼（INH）、利福平（RFP）等对耐多药（Multiple drug resistant-tuberculosis, MDR-TB）及广泛耐药结核的治疗是无效的,对此类肺结核的早期、快速和灵敏诊断有利于临床采取有效、合理的治疗药物与方案。利用基因芯片技术对耐多药结核的诊断具有快速,灵敏和高通量等许多优点。采用罗氏固体培养法对结核分枝杆菌进行传统药敏试验；利用博奥公司生产的晶芯⑧结核分枝杆菌耐药检测试剂盒和相关仪器通过核酸提取、PCR扩增、芯片杂交与清洗和芯片扫描,分别对结核分枝杆菌的INH和RFP耐药相关基因KatG315、inhA-15和rpoB常见突变位点进行检测和药敏判断；通过抽提结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR扩增KatG和rpoB基因片段,核酸电泳鉴定后进行纯化和测序；将基因芯片检测的耐药情况与传统药敏试验结果的一致性进行分析,并将基因芯片法检测的位点突变情况与DNA测序结果进行比较分析。基因芯片法的研究结果表明：（1）相对于inhA-15突变（C→T）,苏州地区结核分枝杆菌INH耐药相关基因KatG主要突变形式为（AGC→ACC） Ser→Thr（S315T）,占耐药突变总比例的96.3%；以罗氏固体培养法获得的INH耐药结果为标准,基因芯片法对菌株INH药敏检测的准确率为73.8%；以DNA测序法结果为标准,基因芯片法对KatG315突变型检测的准确率为88.9%。（2）苏州地区结核分枝杆菌RFP耐药相关基因rpoB主要突变形式为RRDR-531（TCG→TTG） Ser→Leu为主要突变形式,占检测标本rpoB-RRDR相关位点总突变的76.9%；以罗氏固体培养法获得的RFP耐药结果为标准,基因芯片法对菌株药敏检测的准确率为93.3%；以DNA测序结果为标准,基因芯片法对rpoB基因的RRDR相关位点的检测的准确率为82.4%。上述研究获得部分的结果已整理成文,并在投稿中。
张文艳,柯文鸿,张洁莹,徐东芳,王莉丽[6]（2012）在《合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究》文中研究表明目的:了解合肥地区结核分枝杆菌利福平（RFP）耐药株rpoB基因突变特点。方法:应用PCR-直接测序法对合肥地区肺结核病人痰液中分离的90株结核分枝杆菌的rpoB基因629 bp（包括rpoB基因利福平耐药决定区（RRDR）的81 bp）序列进行测定分析。结果:90株结核分枝杆菌中69株对RFP耐药,21株对RFP敏感;69株耐利福平临床分离株中53株发生rpoB基因突变,突变率为76.8%;突变发生在531位丝氨酸的31株,发生率为44.9%,发生在526位组氨酸的8株,发生率为11.6%;还有6株发生了联合突变,发生率为8.7%。21株敏感株中1株rpoB基因发生突变,突变位点是533位亮氨酸。结论:合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB基因的RRDR发生了突变,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。
刘丹,陈俊林,顾德林,曹文忠,陈晓丽[7]（2011）在《L型结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性研究》文中研究说明目的:探讨L型结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法:采用PCR和PCR-DS技术对23例初治肺结核和45例复治肺结核患者L型结核分枝杆菌临床分离株进行rpoB基因检测和序列分析。结果:初治肺结核L型结核分枝杆菌rpoB基因突变率为4.3%,复治肺结核耐L型结核分枝杆菌rpoB基因突变率为40.0%。结论:复治肺结核L型结核分枝杆菌rpoB基因突变率高于初治肺结核,L型菌rpoB基因突变是造成结核分枝杆菌形成利福平耐药性的主要机制。
杜蓬,李峰,董兆麟,陈超[8]（2012）在《西安市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变型分析》文中提出目的西安市结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因RRDR的基因型分析。方法采用PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析32株结核分枝杆菌耐RFP株和10株RFP敏感株的rpoB基因PCR产物,并对8株具有代表性的菌株rpoB基因片段通过DNA测序进行验证。结果 rpoB基因PCR-SSCP分析灵敏度为56.3%（18/32）,特异性为80%（8/10）。8株结核分枝杆菌rpoB基因经测序,6株耐RFP菌株中有5株的rpoB基因突变均发生在531或526密码子上。其中有两株在526密码子均发生了双碱基突变;1株PCR-SSCP呈现阴性的耐RFP结核分枝杆菌存在513密码子突变;两株RFP敏感株出现PCR-SSCP假阳性,其rpoB基因均涉及2～3个密码子的突变,其中518密码子突变型AAC→GAC为首次报道。结论 531和526密码子除了单点突变之外,亦出现同密码子双碱基突变型;RFP敏感株多密码子突变型值得关注。
陈丹华[9]（2011）在《膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株检测领域的应用》文中认为近些年来,结核病在全球表现出了死灰复燃的现象,这为预防和治疗结核病带来了巨大的挑战。特别是耐药（ DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病具有分布广,传播快的特点,所以结核病已被认为是当前在全球控制传染性疾病所面临的严峻课题之一。在结核病的治疗中,所用到的一线抗结核药物主要有异烟肼（ INH）、利福平（ RFP）、链霉素（ SM）等,因此各个国家都非常重视对耐此类药物的结核分枝杆菌的研究。在当前,对结核分枝杆菌的耐药性分析的规范方法和金标准是传统的培养方法,但是这种方法在整个检测的过程中消耗的时间特别长,因而不能有效地了解并进行正确地治疗结核病。异烟肼（INH）与利福平（RFP）是二种很高效的抗结核药物,所以一直以来都在对结核治疗中起相当重要的作用。其中耐异烟肼的产生原因是因为过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因katG基因的缺失和突变造成,常见的是第315位的丝氨酸突变为苏氨酸,这一突变导致此酶对于其底物INH的亲和性降低,使得过氧化氢酶一过氧化物酶丧失了近一半的酶活性,在所有INH耐药株中大概有50%的突变为这种形式并导致对INH高度耐药。耐利福平的产生与其核心区域rpoB基因突变有关。此区域65%-86%的突变发生在第526位由组氨酸突变为酪氨酸和第531位由丝氨酸突变为亮氨酸,而且此突变将导致对利福平的高度耐药（MIC>32ug/ml）。因此,着眼于当今已知的耐药突变位点的代表性,本研究选取katG （315）和rpoB （531）突变位点作为研究检测的对象。本研究通过对膜反向斑点杂交技术在检测结核耐药性的最佳条件的反复摸索,最终确立采用孔径为0.45μm的尼龙膜,探针的终浓度为1.5 pmol/μL,杂交温度60℃、杂交时间30 min、洗膜温度为60℃,洗膜时间20 min的条件来检测结核分枝杆菌的耐药性。并且通过实验结果显示,在此条件下应用膜反向斑点杂交技术成功地检测了结核分支杆菌耐异烟肼katG基因及耐利福平rpoB基因的突变,并且与DNA测序技术做比较,检测准确性为100%。所以膜反向斑点杂交技术以简便、快速、灵敏、特异的方式直接检测结核分支杆菌katG、rpoB基因突变,可以为临床检测结核分支杆菌的耐药性提供辅助诊断手段,为开发检测结核耐药性试剂盒奠定了实验基础。
许蕴怡,李冰,谭守勇,谭耀驹,蔡杏珊,易小萍[10]（2010）在《广东地区结核分枝杆菌利福平耐药与基因rpoB突变关系分析》文中研究指明目的为了解广东地区结核分枝杆菌rpoB基因突变特点,并探讨其与利福平耐药之间的关系。方法本研究根据结核病诊断细菌学检验规程从临床结核病疑似患者痰液中分离鉴定结核分枝杆菌,采用绝对浓度法对其进行药敏试验,并用PCR-DNA直接测序法对结核分枝杆菌rpoB基因进行序列分析。结果结果分离得到利福平耐药株27株,其中低浓度耐药8株,高浓度耐药19株。经测序分析,所有利福平敏感株rpoB基因均未发生氨基酸突变;利福平耐药株rpoB基因的突变率为81.5%（22/27）,突变均发生在利福平耐药决定区内,突变位点为526、531及533,以Ser531Leu突变最为常见（55.6%,15/27）,并且高浓度耐药株的突变率明显高于低浓度耐药株。结论结果表明广东省结核分枝杆菌rpoB基因突变是结核分枝杆菌利福平耐药性产生的主要分子机制,突变位点同国内外研究基本一致,但各位点突变形式所占比例有自身特点。
二、检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究（论文提纲范文）
（1）宁波地区结核分枝杆菌基因突变位点确证及与异烟肼、利福平耐药关系研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 DNA提取及光度值测定 |
| 1.3.2 PCR扩增 |
| 1.3.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.3.4 测序及结果分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 药敏结果 |
| 2.2 DNA光密度值 |
| 2.3 基因的扩增及琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.4 基因突变和菌株关联分析 |
| 2.4.1 rpoB基因 |
| 2.4.2 katG基因 |
| 2.4.3 inhA基因 |
| 2.4.4 多基因联合突变 |
| 3 讨论 |
（2）基因芯片应用效果评价及耐药基因突变与治疗结局关联研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一章 基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的诊断价值研究 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 耐药基因突变与耐多药结核病患者治疗结局的关联研究 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）新疆地区TB合并HIV感染流行病学分析及耐药结核分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 新疆地区结核分枝杆菌与艾滋病病毒双重感染的流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 调查方法 |
| 1.2.1 相关诊断标准 |
| 1.2.2 艾滋病的诊断标准 |
| 1.2.3 结核病合并艾滋病双重感染的界定 |
| 1.2.4 双向筛查技术 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.3.1 调查人员的培训 |
| 1.3.2 预调查 |
| 1.3.3 调查过程 |
| 1.3.4 资料录入过程 |
| 1.4 统计学分析 |
| 1.5 伦理学考虑 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 结核病人HIV感染特点及危险因素 |
| 2.2 HIV感染者/AIDS病人结核病感染特点及危险因素 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二章 新疆地区结核分枝杆菌的耐药现状的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及病例来源 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 标本釆集 |
| 1.3.2 结核分枝杆菌培养 |
| 1.3.3 结核分枝杆菌菌种鉴定 |
| 1.3.4 药敏试验 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 纳入病例一般情况分析 |
| 2.2 药敏敏感性试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 新疆地区结核病耐药基因突变特征研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 耐药基因突变分析病例纳入 |
| 1.2 菌种鉴定和药敏试验 |
| 1.3 菌基因组DNA提取 |
| 1.4 实验材料和试剂 |
| 1.4.1 主要实验试剂及配制 |
| 1.4.2 主要仪器设备 |
| 1.5 耐药基因扩增及测序 |
| 1.5.1 耐药基因扩增及测序 |
| 1.5.2 测序结果比对 |
| 1.5.3 数据处理与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 耐药基因序列比对结果 |
| 2.2 耐多药结核分枝杆菌rpoB基因突变特征 |
| 2.3 耐多药结核分枝杆菌katG基因突变特征 |
| 2.4 inhA基因突变及其特点 |
| 2.5 katG基因与inhA基因联合突变 |
| 2.6 基因突变与药敏的关系 |
| 3 讨论 |
| 第四章 新疆地区结核病患者CISH基因遗传易感性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂和仪器 |
| 1.2.1 主要试剂、试剂盒 |
| 1.2.2 实验仪器 |
| 1.2.3 溶液配制 |
| 1.2.4 琼脂糖凝胶的配置 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 血液基因组DNA的提取 |
| 1.3.2 CISH基因SNP位点的选择 |
| 1.3.3 遗传平衡定律 |
| 1.3.4 SNP基因型的检测 |
| 1.3.5 构建SNPs的单倍型 |
| 1.3.6 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 样本DNA质量检测 |
| 2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 |
| 2.3 病例-对照人群SNP等位基因及其基因型比较 |
| 2.4 病例-对照人群单倍型比较 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）聚合酶链反应-单链构象多态性检测rpoB基因突变对结核分支杆菌耐利福平诊断价值的Meta分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 纳入与排除标准 |
| 1.1.1 研究类型 |
| 1.1.2 研究对象 |
| 1.1.3 诊断方法 |
| 1.1.4 结局指标 |
| 1.1.5 排除标准 |
| 1.2 检索策略 |
| 1.3 文献筛选、资料提取与质量评价 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 文献检索结果 |
| 2.2 纳入研究的基本特征与质量评价 |
| 2.3 异质性检验 |
| 2.3.1 阈值效应 |
| 2.3.2 非阈值效应 |
| 2.4 Meta分析结果 |
| 2.4.1 合并统计量 |
| 2.4.2 亚组分析 |
| 2.4.2. 1 按扩增片段长度分组 |
| 2.4.2. 2 按不同DNA抽提方式分组 |
| 2.4.2. 3 纳入研究根据标本类型分组 |
| 2.4.3 敏感性分析 |
| 2.4.4发表偏倚评估 |
| 3 讨论 |
| 3.1 质量评价结果分析 |
| 3.2 异质性检验结果分析 |
| 3.3 Meta分析结果分析 |
| 3.4 亚组结果分析 |
| 3.4.1 选择DNA扩增长度为研究对象 |
| 3.4.2 选择DNA提取方式进行亚组分析 |
| 3.4.3选择标本类型进行亚组分析 |
| 3.5 本研究的局限性和对未来研究的启示 |
（5）基因芯片法快速检测结核分枝杆菌KatG、inhA和rpoB基因突变及其与INH和RFP耐药相关性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 第一部分 基因芯片法快速检测苏州地区结核分枝杆菌KatG、inhA基因突变特点及其与INH耐药相关性的研究 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 基因芯片法快速检测苏州地区结核分枝杆菌rpoB基因突变特点及其与RFP耐药相关性的研究 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 本研究获得的基金资助 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（6）合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 结核分枝杆菌标准株 |
| 1.2 临床菌株 |
| 1.3 DNA的提取 |
| 1.4 引物序列 |
| 1.5 rpoB基因目的片段的扩增 |
| 1.6 PCR产物纯化及DNA测序 |
| 1.7 序列比对与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RFP耐药性检测结果 |
| 2.2 rpoB基因PCR扩增结果 |
| 2.3 rpoB基因测序分析结果 |
| (1) 利福平敏感株测序结果: |
| (2) 利福平耐药菌株测序结果: |
| 3 讨论 |
（7）L型结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 rpoB基因的检测结果 |
| 2.2 对比结核分枝杆菌培养与药敏结果 |
| 3 讨论 |
（8）西安市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变型分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 结核分枝杆菌标准株及临床分离株基因组DNA的提取 |
| 1.3 结核分枝杆菌rpoB基因RRDR片段的PCR检测 |
| 1.4 基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的RRDR片段PCR产物的SSCP分析 |
| 1.5 RRDR扩增片段的DNA测序分析 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 结核分枝杆菌临床分离株rpoB等位基因的PCR-SSCP分析 |
| 2.2 基于PCR-SSCP分析结果的DNA测序验证 |
| 3 讨 论 |
（9）膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株检测领域的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结核分枝杆菌耐药的分子机制 |
| 1.1.1 结核病现状及结核分枝杆菌耐药性 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌耐药的分子机制 |
| 1.1.3 结核分枝杆菌耐利福平的分子机制 |
| 1.1.4 结核分枝杆菌耐异烟肼的分子机制 |
| 1.2 结核分枝杆菌耐药性检测方法的近况 |
| 1.2.1 常规药敏试验方法 |
| 1.2.2 BACTEC 液体培养基法 |
| 1.2.3 噬菌体生物扩增法(Phage amplified biologically assay，PhaB) |
| 1.2.4 DNA 测序法 |
| 1.2.5 基因芯片法 |
| 1.2.6 反向杂交技术 |
| 1.3 本论文的研究意义及技术路线 |
| 1.3.1 本论文的研究意义 |
| 1.3.2 本论文的技术路线 |
| 第二章 膜反向斑点杂交技术检测结核耐药性条件的优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 主要药品与试剂 |
| 2.1.3 主要设备与仪器 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的提取 |
| 2.2.2 PCR 扩增 |
| 2.2.3 膜反向斑点杂交过程 |
| 2.2.4 探针的优化与设计 |
| 2.2.5 探针浓度的优化 |
| 2.2.6 最适杂交温度的优化 |
| 2.2.7 杂交时间的优化 |
| 2.2.8 洗膜温度的优化 |
| 2.2.9 杂交液盐浓度的优化 |
| 2.2.10 生物素标记的扩增产物浓度对杂交结果的影响 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 质粒的电泳鉴定结果 |
| 2.3.2 PCR 扩增结果 |
| 2.3.3 探针的优化与设计结果 |
| 2.3.4 探针浓度的优化结果 |
| 2.3.5 最适杂交温度的优化结果 |
| 2.3.6 杂交时间的优化结果 |
| 2.3.7 洗膜温度的优化结果 |
| 2.3.8 杂交液盐浓度的优化结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 膜反向斑点杂交检测结核的耐药性 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒和菌株 |
| 3.1.2 主要药品与试剂 |
| 3.1.3 主要设备与仪器 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物及寡核苷酸探针的设计与膜的制备 |
| 3.2.2 质粒的提取 |
| 3.2.3 PCR 扩增 |
| 3.2.4 膜反向斑点杂交过程 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 引物和寡核苷酸探针的设计结果 |
| 3.3.2 质粒的电泳鉴定结果 |
| 3.3.3 PCR 扩增结果 |
| 3.3.4 katG 基因引物的PCR 扩增敏感性结果 |
| 3.3.5 katG 基因PCR-膜反向斑点杂交探针敏感性结果 |
| 3.3.6 膜反斑点杂检测耐药结核分枝杆菌结果 |
| 3.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 |
四、检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究（论文参考文献）
- [1]宁波地区结核分枝杆菌基因突变位点确证及与异烟肼、利福平耐药关系研究[J]. 徐峰,饶跃峰,张幸国,朱育银,车洋. 中国现代应用药学, 2020(20)
- [2]基因芯片应用效果评价及耐药基因突变与治疗结局关联研究[D]. 王丹吉. 东南大学, 2019(05)
- [3]新疆地区TB合并HIV感染流行病学分析及耐药结核分子机制研究[D]. 王先化. 青岛大学, 2015(04)
- [4]聚合酶链反应-单链构象多态性检测rpoB基因突变对结核分支杆菌耐利福平诊断价值的Meta分析[J]. 于璐,孟存仁,张朝霞. 中国循证医学杂志, 2014(06)
- [5]基因芯片法快速检测结核分枝杆菌KatG、inhA和rpoB基因突变及其与INH和RFP耐药相关性的研究[D]. 唐佩军. 苏州大学, 2012(04)
- [6]合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究[J]. 张文艳,柯文鸿,张洁莹,徐东芳,王莉丽. 中国卫生检验杂志, 2012(03)
- [7]L型结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性研究[J]. 刘丹,陈俊林,顾德林,曹文忠,陈晓丽. 南通大学学报(医学版), 2011(06)
- [8]西安市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变型分析[J]. 杜蓬,李峰,董兆麟,陈超. 西安交通大学学报(医学版), 2012(01)
- [9]膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株检测领域的应用[D]. 陈丹华. 华南理工大学, 2011(12)
- [10]广东地区结核分枝杆菌利福平耐药与基因rpoB突变关系分析[J]. 许蕴怡,李冰,谭守勇,谭耀驹,蔡杏珊,易小萍. 国际医药卫生导报, 2010(23)