朱华萍[1]2003年在《猕猴皮肤成纤维细胞与家兔去核卵母细胞构建异质重构胚的初步研究》文中指出本研究旨在探讨猕猴皮肤成纤维细胞与家兔去核卵母细胞构建异质重构胚的可能性及其体外发育的潜能。在实验中，建立起了猕猴皮肤成纤维细胞系，并观察了细胞的生物学特性；采用超数排卵和重复手术方法，收集和筛选出了足量、高质的家兔成熟卵母细胞；以猕猴皮肤成纤维细胞核为供体、以家兔去核卵母细胞为受体进行异种体细胞核移植的初步尝试，获得了二者异质重构胚，并探讨了各种因素对重构胚体外发育能力的影响。基本内容及结果如下： 1、猕猴皮肤成纤维细胞系的建立 1)从猕猴耳缘皮肤取材，12例原代培养成活率为91.67％。 2)采用常规组织块培养法，四种培养液中，DMEM、TCM199、RPMI1640、DMEM+F12，成活皮块数率分别为：80％、53％、93％、13％。说明DMEM和RPMI1640培养液适合猕猴皮肤成纤维细胞体外培养，RPMI1640培养中，细胞体外贴壁、生长增殖均迅速。 3)接种密度在2×10~4-1×10~5/cm~2范围内细胞生长增殖快。 4)在RPMI1640中分别添加10％、15％、20％的血清培养猕猴皮肤成纤维细胞，细胞生长无显着差异(p＞0.05)。10％血清浓度即可满足细胞正常生长要求。在添加0.5％血清的培养液中，细胞只能维持存活，不能进行增殖。 5)猕猴皮肤成纤维细胞冻存1、3、6、12个月，复苏后24h贴壁率均在80％以上，冻存1年之内细胞的复苏效果无显着差异(p＞0.05)； 6)猕猴皮肤成纤维细胞染色体众数2n=42。对其G3、G5、G7、G10进行核型检查，细胞二倍体染色体数率在81％以上，各代之间具有正常二倍体的一细胞比例无髓差异计）0．05）。 7）兔疫组化染色波形丝蛋白抗体、Ill型胶原抗体阳性，角蛋白抗体阴性。 Z、兔成熟卵母细胞的收集 采用 FSH和 FSH混合PVP（25％）两种激素进行超数排卵，并用正常排卵雌兔作对照，经过叁次手术法取卵（每次间隔至少50d以上）。经输卵管插管，由输卵管伞端收集卵母细胞并进行筛选。结果如下： 1）采用激素处理的两组获取总卵母细胞数和可用卵数比对照组均高出3倍以上（p＜0．05），两种超排方法之间超排效果无显着差异（P＞0．l）； 2）叁次连续手术成活的家兔中，FSH组叁次驭卵效果无显着差异（D＞0．05）；对照组叁次取卵效果也无显着差异（P＞0．05）；FSH－PVP组首次手术取卵与第叁次手术取卵效果有显着差异（P（．01）。 3、核移植重构胚的构建 以体外培养的猕猴皮肤成纤维细胞为核移植供核细胞，将超数排卵获得的家兔成熟卵母细胞去核，作为核移植受体，二者进行核移植构建重构胚，探讨各种因素对重构胚体外发育能力的影响。结果如下： 1）以Nocodazole（络可达哗）处理的成纤维细胞作供核细胞，其重构胚的卵裂率明显高于其它两组（P＜0．of），但血清饥饿法和 Nocodazole处理法两组间重构胚的囊胚发育率无显着差异（P）0．05），均高于一般培养法 （P＜0．01）。 2）直接胞质内注入法形成重构胚的卵裂率明显高于电融合法（P＜0．05），但二者的囊胚形成率无显着差异（n0．05）。 3）猕猴皮肤成纤维细胞3－9代作供核细胞构建的核移植胚体外培养的卵裂率和囊胚率之间没有显着差异（P＞0．05）。 4）两个激素处理组与正常排卵组在构建重构胚的数量、重构胚的存活率。卵裂率及囊胚发育率上均无显着差异（p＞0．1）。经过叁次重复手术获得的叁组卵母细胞用于核移植，其构建重构胚的数量、重构胚的存活率、卵裂率及囊胚发育率上均无显着差异（P）0．05）。 5）在两种不同融合液中，以相同电融合参数融合核移植胚。重构胚的 ．2一融合率、卵裂率和囊胚发育率，在添加有 CCB的融合液u组）中的表现均显着高于未添加 CCB的融合液（l组）的（P＜0．05）。 6）在重构胚激活实验中，以 6－DMAP＋电激活（第 l组）和 CHX。电激活 （第2组）激活重构胚，其卵裂率、囊胚发育率均显着高于以6－DMAP＋CCB （第 3组）和 CHX＋CCB（第 4组）法激活的重构胚（P＜0．（）5）；第 1、2组之间，第3、4组之间卵裂率、囊胚发育率均无差异（P＞0．05）。 7）用兔颗粒细胞单层和猴vero细胞单层两个共培养体系分别培养重构胚，二者的卵裂率、桑堪胚形成率及囊胚发育率均显着高于用TCM199＋10％OCS培养的对照组（P＜0．05）。结论： 获得了体外发育至囊胚的猕猴－家兔异种核移植重构胚，表明家兔去核卵母细胞质支持猕猴成纤维细胞进行发育程序重编，形成的核移植重构胚在体外具有发育潜能性。同期证实，供体细胞同步化处理、受体细胞来源、融合激活方法、体外培养体系等因素对异种核移植重构胚体外发育能力均有影响。
章志国[2]2003年在《波尔山羊—兔异种克隆胚胎连续核移植及克隆胚移植研究》文中研究指明本试验首先以经过接触抑制、新鲜消化的波尔山羊耳部成纤维细胞作为核供体，以超排家兔卵母细胞为受体，构建波尔山羊-兔异种克隆胚，然后进行了异种克隆胚连续核移植及异种克隆胚移植研究。旨在观察异种克隆胚(原代)与异种继代克隆胚早期发育的差异性以及探索山羊-兔异种克隆胚在山羊体内继续发育的可能性，为发展动物克隆技术提供理论和实践依据。 在山羊-兔异种克隆胚的连续核移植研究中，共构建原代重构卵858枚，经电融合后，获得重构胚440枚，重构卵融合率为51.3％，经体外培养后，获得桑椹胚155枚，囊胚45枚，囊胚率10.2％。随后，分别以获得的异种原代和异种继Ⅰ代克隆桑椹胚卵裂球为核供体移入去核的兔卵母细胞中，共构建继Ⅰ代重构卵73枚，继Ⅱ代重构卵20枚。在原代重构胚和继代重构胚发育率比较研究中，共挑选出145枚原代重构卵与上述73枚继Ⅰ代重构卵、20枚继Ⅱ代重构卵，经电融合后，进行体外共培养，所获得的重构胚分别为90枚、58枚及14枚，即融合率分别为62.1％、79.5％和70％。这162枚重构胚经过体外共培养后，卵裂率分别为72.2％、75.9％和28.9％；囊胚率分别为10％、13.8％和0。试验结果表明：融合率方面，原代、继Ⅰ及继Ⅱ代重构卵之间无显着差异(p＞0.05)；早期胚胎发育率方面，继Ⅰ代重构胚高于原代重构胚，但差异不显着(P＞0.05)，相反，继Ⅱ代却大大低于前两者，差异极为显着(P＜0.05)，并且在本试验中没有获得继Ⅱ代桑椹胚或囊胚；发育速度方面，继Ⅰ代明显快于原代，两者发育至囊胚所需时间分别为4～5d和5～6d，正常情况下相差1～2d，差异突出表现在体外培养后的第1个24h，在此期间，继Ⅰ代重构胚能发育到8～16细胞期，而原代重构胚却只能发育到4～8细胞期，其至有些胚胎只能达到2细胞期，但在随后的培养时间内发育速度又无差异。 在克隆胚移植研究中，试验分原代胚移植组和继代胚移植组，共移植受体羊43头，原代胚78枚，继代胚12枚，最终没有获得克隆后代。①原代移植组，移植克隆胚后，有6头受体山羊停止发情并维持1个月以上，其中1头达到60天，期间出现妊娠症状，在其返情后腹腔镜探查发现，一侧子宫体明显比另一侧粗大。②继代胚移植组，有2头受体母羊在移植胚胎后30天才返情，检测血清内孕酮含量，没有发现持续居高现象。试验结果表明：异种原代克隆胚移植后，在山羊体内形成早期着床，而继代克隆胚没有形成着床。
参考文献：
[1]. 猕猴皮肤成纤维细胞与家兔去核卵母细胞构建异质重构胚的初步研究[D]. 朱华萍. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 波尔山羊—兔异种克隆胚胎连续核移植及克隆胚移植研究[D]. 章志国. 安徽农业大学. 2003