植物乳杆菌素Q7合成与代谢关键蛋白挖掘及调控研究

论文摘要

乳酸菌细菌素是一类由核糖体合成,具有抑菌活性的蛋白或多肽类物质。因其安全特性在食品生物防腐领域得到广泛应用。但是,目前只有Nisin实现了商业化生产,而Nisin抑菌谱较窄。因此,筛选出一株具有广谱、高产抑菌活性的新型细菌素菌株一直是细菌素研究领域的热点。本课题以产细菌素乳酸菌为研究对象,利用蛋白组学、生物信息学、基因敲除等方法对参与细菌素合成及反馈调控的关键蛋白进行挖掘,通过调控关键蛋白的表达量来提高细菌素合成量。其意义在于对增加细菌素产量提供新策略,也为大规模工业化发酵生产细菌素奠定基础。对实验室保存的乳酸菌所产细菌素的性能进行筛选,最终确定植物乳杆菌Q7所产细菌素具有较广的抑菌谱和良好的加工稳定性。对植物乳杆菌Q7的生长与细菌素合成关系进行研究,发现细菌素合成和菌体生长属于部分对应,当培养至对数末期时,细菌素的合成达到最大值。此外,阳离子交换和凝胶过滤两步纯化方法可以有效的分离纯化出高纯度的植物乳杆菌素Q7。研究碳源对植物乳杆菌素Q7合成的影响,发现果糖可显著加快植物乳杆菌素Q7的合成速率,作为刺激物能够诱导或调控植物乳杆菌素Q7合成相关基因的表达。利用蛋白组学技术构建菌体在葡萄糖和果糖培养下胞内差异蛋白表达图谱,发现在果糖培养条件下共有14个蛋白点相比于葡萄糖培养条件下高表达2.0倍以上。利用MALDI-TOF/TOF MS对高表达的蛋白点进行质谱鉴定,结合GO、KEGG Pathway、String Network及转录水平检测分析,发现与蛋白质的转录、翻译及加工相关。因此,这些蛋白点在果糖培养条件下高表达能够促使菌体快速合成蛋白类物质。其中,休克蛋白位于蛋白相互作用网络的中心,与其它蛋白具有高度的连通性,因此休克蛋白在菌体合成细菌素过程中扮演重要的角色。采用预热应激诱导菌体休克蛋白高表达,从而增加植物乳杆菌素Q7产量。结果发现在45℃下热激5 min可以促使菌体大量合成细菌素,产量达2873.08IU/mL,相比于未处理发酵中植物乳杆菌素Q7产量提高23.36%,表明预热应激处理是提高植物乳杆菌素Q7产量的一种行之有效的方法。荧光定量PCR检测发现,预热应激后休克蛋白GroEL表达量比未预热应激菌体内的表达量高10倍。同时,构建了groEL基因敲除突变菌株植物乳杆菌Q7ΔGroEL,发现敲除菌株植物乳杆菌Q7ΔGroEL的细菌素合成量显著低于野生菌株的细菌素合成量。证明了GroEL参与植物乳杆菌素Q7的合成,对植物乳杆菌素Q7的合成具有促进作用,是植物乳杆菌素Q7合成的关键蛋白。研究植物乳杆菌素Q7合成的反馈抑制现象,发现植物乳杆菌素Q7的合成依赖于培养基中细菌素的浓度,其合成受到产物的反馈抑制调控。使用不同粘土对植物乳杆菌素Q7的吸附作用进行研究,得到蒙脱土吸附效果最好,主要通过静电相互作用力、氢键及疏水相互作用力高效吸附植物乳杆菌素Q7,其吸附量达1276.19 IU/mL。通过原位吸附发酵技术解除反馈抑制提高植物乳杆菌素Q7产量,最终植物乳杆菌素Q7的产量达到3713.40 IU/mL,相比于正常发酵中的植物乳杆菌素Q7产量提高了41.61%。对植物乳杆菌素Q7反馈调控机制进行研究,发现植物乳杆菌Q7共有6对完整的组氨酸蛋白激酶和响应调节蛋白基因。通过定量PCR技术对这6对基因进行检测分析,发现植物乳杆菌素Q7的合成受到chrorf00356（HPK）和chrorf00355（RR）基因的反馈抑制调控。利用基因工程技术将植物乳杆菌Q7的chrorf00356（HPK）基因敲除,发现敲除后的植物乳杆菌Q7ΔHPK菌株其细菌素反馈抑制被解除,可以继续合成细菌素。证明了HPK（chrorf00356）在细菌素反馈抑制调控中起到了关键作用,是调控植物乳杆菌素Q7合成的关键蛋白。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章绪论

1.1 课题背景及目的和意义

1.2 乳酸菌细菌素分离纯化及合成调控

1.2.1 乳酸菌细菌素分离纯化

1.2.2 乳酸菌细菌素的合成调控

1.3 Ⅱ类细菌素分类及其特性

1.3.1 Ⅱa类细菌素

1.3.2 Ⅱb类细菌素

1.3.3 Ⅱc类细菌素

1.3.4 Ⅱd类细菌素

1.4 乳酸菌Ⅱ类细菌素生物合成及降解途径

1.4.1 生物合成途径

1.4.2 降解途径

1.5 代谢调控增加Ⅱ类细菌素产量的策略

1.5.1 增加底物浓度,提高前体物的供应

1.5.2 改造转运系统,解除胞内反馈抑制

1.5.3 切断降解途径,加强产物胞外积累

1.6 细菌素原位分离发酵研究

1.6.1 蒙脱土的结构及其吸附作用

1.6.2 膨润土的结构及其吸附作用

1.6.3 硅藻土的结构及其吸附作用

1.7 主要研究内容及课题来源

第2章实验材料与方法

2.1 实验材料与设备

2.1.1 仪器和设备

2.1.2 实验试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 菌株及其培养条件

2.2 细菌素活性及菌体密度测定

2.2.1 无细胞发酵液的制备

2.2.2 抑菌直径测定及标准曲线绘制

2.2.3 细菌素活性检测

2.2.4 菌体密度测定

2.3 细菌素特性及分离纯化研究

2.3.1 不同来源细菌素特性比较

2.3.2 植物乳杆菌素Q7合成与菌体生长关系研究

2.3.3 植物乳杆菌素Q7的分离纯化

2.4 碳源对细菌素合成的影响

2.4.1 不同种类碳源对细菌素合成的影响

2.4.2 葡萄糖/果糖培养下对细菌素合成及菌体生长的影响

2.5 植物乳杆菌素Q7合成差异蛋白挖掘

2.5.1 菌体胞内蛋白提取及测定

2.5.2 单向SDS-PAGE电泳初步分离差异蛋白

2.5.3 蛋白双向电泳图谱构建

2.5.4 电泳图谱分析及差异点质谱鉴定

2.5.5 生物信息学分析

2.5.6 差异蛋白RT-qPCR验证

2.6 诱导调控关键蛋白提高植物乳杆菌素Q7合成量

2.6.1 热及酸应激对植物乳杆菌素Q7合成的影响

2.6.2 利用热激菌体方法提高植物乳杆菌素Q7产量

2.6.3 热激条件下菌体热休克蛋白转录水平检测

2.7 基因敲除对植物乳杆菌素Q7合成的影响

2.7.1 基因敲除载体构建

2.7.2 基因敲除突变株的筛选及鉴定

2.7.3 野生菌株和敲除菌株的生长及细菌素合成量测定

2.8 植物乳杆菌素Q7合成的反馈抑制研究

2.8.1 植物乳杆菌Q7的反馈抑制现象

2.8.2 粘土对植物乳杆菌素Q7的吸附研究

2.8.3 粘土对植物乳杆菌素Q7的吸附机理

2.8.4 吸附植物乳杆菌素Q7蒙脱土的解析

2.8.5 植物乳杆菌素Q7原位吸附发酵研究

2.9 植物乳杆菌素Q7合成的反馈抑制机制研究

2.9.1 植物乳杆菌Q7双组分系统预测

2.9.2 RT-PCR检测双组分基因的表达情况

第3章乳酸菌细菌素特性及分离纯化研究

3.1 引言

3.2 不同来源细菌素特性比较

3.2.1 抑菌谱比较

3.2.2 热稳定性比较

3.2.3 酸碱稳定性比较

3.2.4 蛋白酶敏感性比较

3.2.5 金属离子对细菌素活性的影响

3.2.6 乙醇浓度对细菌素活性的影响

3.2.7 氯化钠浓度对细菌素活性的影响

3.3 植物乳杆菌素Q7合成与菌体生长关系研究

3.4 植物乳杆菌素Q7的分离纯化研究

3.4.1 SP Sepherose Fast Flow纯化植物乳杆菌素Q7

3.4.2 Superdex Peptide10/300 GL纯化植物乳杆菌素Q7

3.5 本章小结

第4章植物乳杆菌素Q7合成最佳碳源确定及关键蛋白挖掘

4.1 引言

4.2 碳源对植物乳杆菌素Q7合成的影响

4.2.1 不同种类碳源对植物乳杆菌素Q7合成的影响

4.2.2 葡萄糖/果糖培养下对植物乳杆菌素Q7合成及菌体生长的影响

4.3 植物乳杆菌素Q7合成相关差异蛋白图谱构建

4.3.1 蛋白标准曲线绘制及胞内蛋白含量测定

4.3.2 单向SDS-PAGE电泳初步分离差异蛋白

4.3.3 胞内全蛋白双向电泳图谱构建

4.4 差异蛋白质谱鉴定及生物信息学分析

4.4.1 差异蛋白的质谱鉴定

4.4.2 差异蛋白的GO分析

4.4.3 差异蛋白的KEGG Pathway分析

4.4.4 差异蛋白的String Network分析

4.5 RT-qPCR分析差异蛋白转录水平的变化

4.5.1 胞内总RNA提取和定量

4.5.2 普通PCR验证引物特异性

4.5.3 RT-qPCR检测差异蛋白转录水平表达情况

4.6 本章小结

第5章关键蛋白的诱导调控及其对植物乳杆菌素Q7合成的影响

5.1 引言

5.2 诱导调控休克蛋白提高植物乳杆菌素Q7合成量的研究

5.2.1 热及酸应激对植物乳杆菌素Q7合成的影响

5.2.2 利用热激菌体方法提高植物乳杆菌素Q7产量研究

5.2.3 热激条件下菌体热休克蛋白转录水平检测

5.3 基因敲除载体的构建

5.3.1 植物乳杆菌Q7基因组的提取

5.3.2 质粒pUC19及pBR322 的扩增与提取

5.3.3 四环素抗性基因tet的扩增和鉴定

5.3.4 groEL基因上下游同源臂的扩增和鉴定

5.3.5 中间载体pUC19-GroELS构建

5.3.6 中间载体pUC19-GroELSX构建

5.3.7 敲除载体pUC19-GroELSX-Tet构建

5.4 基因敲除突变株的筛选及鉴定

5.5 野生菌株和敲除菌株的生长及细菌素合成量比较

5.6 本章小结

第6章植物乳杆菌素Q7合成的反馈抑制及其调控机制研究

6.1 引言

6.2 植物乳杆菌素Q7的反馈抑制现象

6.3 不同粘土对植物乳杆菌素Q7的吸附及解析研究

6.3.1 不同粘土对植物乳杆菌素Q7吸附的影响

6.3.2 蒙脱土吸附植物乳杆菌素Q7的特性研究

6.3.3 吸附植物乳杆菌素Q7蒙脱土的解吸

6.4 植物乳杆菌素Q7原位吸附发酵研究

6.5 植物乳杆菌素Q7反馈调控机理研究

6.5.1 植物乳杆菌Q7双组分系统预测

6.5.2 RT-PCR检测组氨酸蛋白激酶和响应调节蛋白基因的表达情况

6.6 组氨酸蛋白激酶基因对植物乳杆菌素Q7合成的影响

6.6.1 基因敲除载体构建

6.6.2 基因敲除突变株的筛选及鉴定

6.6.3 野生菌株和敲除菌株的生长情况及细菌素合成量比较

6.7 本章小结

结论

创新点

展望

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢

个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 章检明

导师: 韩雪

关键词: 植物乳杆菌素,关键蛋白,代谢调控,反馈抑制

来源: 哈尔滨工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 哈尔滨工业大学

基金: 中国国家自然基金(NO.31571850,NO.31771988,NO.31771987)

分类号: Q93;TQ920.1

DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.000192

总页数: 159

文件大小: 3960K

下载量: 321

植物乳杆菌素Q7合成与代谢关键蛋白挖掘及调控研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢