赵大庆[1]2003年在《活性软骨体外长期保存及其应用的研究》文中提出在整形外科领域移植软骨活性的保存始终是研究的热点。软骨作为一种生物性移植材料以其优越性而成为整形外科最常用的材料之一，它在修复缺损、矫正畸形等方面起到了良好的充填和支架作用。喉癌和喉狭窄是临床上较难处理疾病，喉狭窄及喉癌手术病人喉功能重建的研究已成为关注热点。喉成形重建术中关键问题是软骨支架的重建，而软骨支架的取材问题仍未根本解决。用自身移植物修补骨骼缺损在整形外科是最常用的，但也存在一些问题。有些病情必须进行延期或晚期的软骨移植术或多期重建术，如何保存软骨组织的活性，对保证移植物的成功至关重要。既往保 第四军医大学2000级博士论文存软骨的方法常用的有：化学保存方法如用甲醛和硫柳汞等保存的软骨都会导致软骨失去活性，此种无活性的软骨移植物因其易变形、吸收及排斥反应大等缺点，而使其应用大为受限。现今软骨库的来源多为用甲醛、硫柳汞、生理盐水等化学方法保存的软骨，而所有化学保存方法都有降低或消除软骨活性的缺点。近年，有人尝试用组织培养法来保存软骨，但其结论不一，各有其局限性。既往我们曾进行了用组织培养法于体外保存动物甲状软骨活性的实验，可在30天内较好地保存软骨活性，用所培养的软骨进行同种异体移植后，可较好地修复甲状软骨缺损。 临床治疗所需软骨的体积往往较大，且许多手术治疗需要带软骨膜的软骨。而既往所培养的软骨存在体积小及无软骨膜等缺点，所培养时间也较短，阻碍了其应用发展。此外，对人的软骨是否能用组织培养法在体外长期保存活性也未进行研究。为此，在以往实验基础上，本研究着重观察用组织培养法于体外长期保存动物及人较大体积活性软骨块及带软骨膜软骨的可行性，同时观察用所培养软骨进行同种异体及异种移植后其移植修复效果。为建立体外稳定软骨库提供理论基础，并为临床整形修复治疗提供一种新型的修复材料奠定基础。 －〕－ 第四军医大学2000级博士论文 实验取新西兰白兔全厚层喉甲状软骨、带膜及不带膜肋软骨和人带膜及不带膜肋软骨及鼻中隔软骨，大小约 smmXZmmX Inun至 25minX20mm X Zmm，用 RPMi－1640培养液进行组织培养，在保存 5天、10天、20天、30天、60天、90天、120天、150天及 180天时分别用倒置显微镜、光镜及台盼蓝排斥试验检测软骨活性。与此同时，取所培养软骨进行动物移植实验及临床应用观察。一方面，将自体软骨、新鲜的和培养的同种异体带膜及不带膜软骨以及所培养的人的带膜及不带膜软骨移植于同一兔背部，分别于7天、30天、60天、90天、120天、150天、180天、200天、300天及370天时取标本观察移植效果。另将培养的人的软骨移植于动物甲状软骨缺损处，观察移植修复效果。另一方面，将培养的人的软骨进行临床应用，观察其治疗效果。结果发现，用 yMI刁 640培养液所保存软骨在培养半年后仍保持较好活性。用新鲜的和培养的同种异体带膜及不带膜软骨进行移植后，与受体组织相容性好，移植排斥反应小。培养的人的带膜软骨进行异种移植后，其移植排斥反应明显弱于不带膜软骨。通过本实验得出结论，用组织培养法能较长期地在体外保存人及动物的软骨活性，并且用组织培养法保存的活性软骨进行同种异体移植时其移植排斥反应 －6． 第四军医大学2000级博士论文小，修复效果满意，异种带软骨膜软骨也有较好的移植效果。本实验为建立体外软骨库奠定了一定基础，有望为临床提供一种新型软骨材料。
曲福军[2]2005年在《转BMP7基因组织工程软骨的构建与移植修复兔膝关节软骨缺损》文中认为采用RT-PCR 技术从体外培养的幼兔膝关节软骨细胞中克隆得到BMP7 基因;并将该基因克隆入pcDNA3.1 真核表达载体,构建了重组pcDNA3.1-BMP7质粒;在脂质体介导下将该重组质粒转染入成年兔关节软骨细胞,通过实验证明了BMP7 基因在软骨细胞中表达BMP7mRNA 和BMP7 蛋白。应用转BMP7 基因软骨细胞,以胶原-纤维蛋白凝胶为支架构建了转BMP7基因组织工程软骨。转BMP7 基因组织工程软骨中细胞分裂、增殖速度快,细胞器发达,细胞外基质合成增多,DNA 与GAG 含量增高,BMP7 基因表达的目的蛋白具有生物活性。分析了与其同步构建的未转BMP7 基因组织工程软骨的生物学差别。确定了转BMP7 基因组织工程软骨的移植修复时间。通过组织工程和基因工程技术相结合,将构建的转BMP7 基因组织工程软骨移植到模型动物兔膝关节软骨缺损处,BMP7 基因能在移植部位表达活性BMP7 蛋白,加速了关节软骨缺损的修复。开创了转基因组织工程软骨促进关节软骨缺损修复的新领域。为其应用于临床奠定了基础。
杨宪法, 赵大庆, 崔鹏程, 徐凯[3]2008年在《保存人鼻中隔软骨活性的3种体外方法比较》文中指出背景:软骨损伤后难以自身修复,以活性软骨进行修复效果较好,但活性软骨的可靠来源尚未根本解决。目的:以3种不同方法体外保存成人鼻中隔软骨块的活性比较。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-06/2008-03在解放军第四军医大学唐都医院耳鼻喉科实验室及西京医院全军耳鼻咽喉-头颈外科中心实验室完成。材料:材料为临床常规手术中切除的成人正常鼻中隔软骨20块,按国务院2006年《医疗机构管理条例》规定,已与患者签订知情同意书。方法:将所取软骨,块剪成大小约15mm×10mm×2mm软骨块,分别置于4,-20,-80℃冷冻及RPMI-1640液于37℃培养保存,于保存24h,7,14,21d和30d时取样品。主要观察指标:以苏木精-伊红、AB/PAS及Masson叁色染色和锥虫蓝排斥试验检测软骨活性。结果:用RPMI-1640培养液保存的成人鼻中隔软骨,在整个保存期中均能保持较好活性,软骨细胞活性率保持在80%左右。以-80℃冷冻保存7d及-20℃保存14d时,软骨基本失去活性,当4℃保存在21d时,软骨可保持较好活性,保存30d时,软骨活性明显降低。结论:与低温保存方法相比,用组织培养法保存成人软骨块能较好地保持其活性,有望为临床治疗提供一种取材方便、新型有效的软骨修复材料。
黄荣[4]2011年在《山羊骨髓间充质干细胞生物学特性、冷冻保存及基因转染研究》文中进行了进一步梳理骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类能高度增殖和自我更新,并具有多向分化潜能的成体干细胞。目前,已在人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛和羊等物种进行了研究,证明该类细胞在一定条件下能分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞和星形胶质细胞等多种成体细胞。另外,研究还发现BMSCs转染效率较高,是一种理想的核移植供体细胞。因此,BMSCs有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今关于山羊BMSCs分离培养、冷冻保存以及转基因等方面的系统研究报道甚少。因此,本试验利用黄淮山羊为对象,较系统全面地研究了BMSCs的分离培养、生长特性、细胞表面标志、体外诱导分化能力、冷冻保存体系以及基因转染效率等。具体研究内容如下：1.山羊BMSCs的分离培养和生物学特性研究从增殖情况、基因表达和分化潜力叁方面对山羊BMSCs的生物学特性进行研究。采用全骨髓贴壁法分离培养原代BMSCs,结果显示山羊BMSCs体外生长状态良好,镜下可见贴壁细胞增殖明显,培养9d即基本汇合,细胞形态均一,大部分呈梭形；传代后,以计数法检测第1代细胞和第7代细胞增殖水平,并绘制生长曲线,曲线呈“s”形,符合细胞生长的一般规律；取第5代细胞接触抑制2d后用流式细胞仪检测细胞周期,结果89.69%的细胞处于G0/G1期,同期化程度较高；通过免疫荧光法和RT-PCR检测,发现山羊BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106和CD166等表面标志,但是不表达造血干细胞的表面标志CD45；最后,用成骨细胞、脂肪细胞诱导剂成功诱导BMSCs定向分化为成骨细胞和脂肪细胞,鉴定其具有分化能力。2.山羊BMSCs冷冻保存研究从山羊BMSCs冷冻保存时冻存液的种类、浓度和冷冻程序优化其冷冻保存。首先研究冷冻保存对山羊BMSCs生物学特性的影响,结果复苏后细胞的生长曲线依然呈“S”型,同时用流式细胞仪检测接触抑制2d的山羊BMSCs细胞周期,结果显示G0/G1期的细胞达89.45%,与冷冻前比较,差异不明显。然后试验研究了DMSO浓度、蔗糖浓度以及叁种冷冻程序对细胞冻存的影响：(1)采用分级冷冻法冷冻细胞,研究含有2.5%、5%和10%DMSO的冻存液对山羊BMSCs冷冻效果的影响,结果,当DMSO含量为2.5%时,复苏后细胞活率为(97.76+1.3)%,显着高于5%和10%试验组,然而叁组细胞24 h后的贴壁率差异并不显着；(2)采用分级冷冻法冷冻细胞,在含有10%DMSO的冻存液中,分别添加0.05 M、0.15 M和0.25 M的蔗糖,结果发现这叁个试验组复苏后细胞活率差异不显着,另外叁组之间24 h贴壁率差异也不显着；(3)采用含有10%DMSO的冻存液,应用叁种冷冻程序对山羊BMSCs进行冷冻保存,分别为：分级冷冻法、异丙醇控温盒冷冻法和直接-80℃冷冻法,结果发现直接-80℃冷冻法复苏后细胞活率显着高于其他两组,但是叁个试验组24 h贴壁率差异不显着。结果表明,2.5%的DMSO可以满足山羊BMSCs冻存的需要,并且分级冷冻法较适合该细胞的冷冻。3.山羊BMSCs基因转染研究研究山羊BMSCs的基因转染效率。本试验将pEGFP-C1分别转染山羊耳成纤维细胞和山羊BMSCs,进行转染效率比较,结果显示：山羊BMSCs对脂质体LTX较敏感,以敏感细胞的体系进行转染(100μL LDMEM-LG中加入0.25μg质粒、0.5μLPLUSTM Reagents和1.25μL LipofectamineTM LTX),细胞依然呈纤维样且死亡较少,山羊BMSCs转染效率达(67.91±5.3)%,显着高于山羊耳成纤维细胞转染效率(17.79±3.9)%,说明山羊BMSCs是一种转染效率较高的转基因核移植供体细胞。
李连[5]2016年在《低分子量硫酸软骨素的制备、抗补体活性构效关系及治疗骨性关节炎的实验研究》文中指出研究目的骨性关节炎(osteoarthritis,OA)的发病机理非常复杂,现在的研究表明补体系统在OA的发病过程中发挥着重要的作用,而补体系统的替代途径在OA中又占据主要位置。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是由D-葡糖醛酸残基和N-乙酰-D-半乳糖胺残基组成的双糖单位线性连接组成的一类糖胺聚糖,大量的研究表明其具有缓解、治疗OA的生物学功能。其中低分子量硫酸软骨素(1owmolecular weight chondroitin sulfate,LMWCS)在缓解、治疗OA方面效果更加明显。但是1MWCSs通过与补体系统相互作用起到防治OA的作用目前尚未有研究。同时LMWCSs由于来源不同、制备工艺不同等导致其具有不同的生物活性,探讨LMWCS s与抗补体活性的构效关系,阐明LMWCSs的结构对补体活性的影响,将对LMWCSs防治OA奠定一定的理论基础,同时对LMWCSs的生产具有指导意义。为了探讨CS抗补体作用与其结构的关系及抗补体作用在其防治OA中发挥的作用,本研究采用4种不同的降解方法对3种不同来源的CS进行降解得到一系歹LMWCSs,然后对这些LMWCSs的抗补体活性进行评价,研究LMWCSs结构与抑制补体替代途径活性之间的构效关系,并选出一种抗补体活性较高的LMWCS。通过对活性较高的LMWCS的体内、体外的活性评价,证明其抗补体活性与其防治OA的关系。最后,针对于目前筛选CS的抗补体活性的方法存在费时、费力的问题,通过利用近红外光谱分析技术建立一种快速无损的高通量筛选CS抗补体活性的方法。研究方法1 LMWCSs的制备及表征本研究拟采用氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波辅助碱降解法对鲨鱼来源、猪来源和牛来源的CS进行降解得到不同的LMWCSs。采用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)、紫外可见光谱法、分子排阻色谱-多角度激光散射法(size exclusion chromatography-multi angle light scattering, SEC-MALLS)、核磁(ruclear magnetic resonance,NMR)等方法对LMWCSs的性质进行表征和研究。2不同LMWCSs的抗补体活性研究与构效关系分析采用溶血法测定LMWCSs抑制替代途径活性的IC50值,通过利用性质的表征结果对LMWCSs的结构和LMWCSs的抗补体活性之间的构效关系进行研究,分析其构效关系,进而选择出一种具有较好的抗补体活性的LMWCS用于进一步的体内外活性研究。3LMWCS对软骨细胞的影响体外研究采用酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的方法研究LMWCS对补体替代途径激活过程中补体蛋白3(complement 3,C3)沉积的影响；采用补体介导的软骨细胞死亡的方法研究LMWCS通过抑制补体活性保护软骨细胞的作用；采用RT-PCR的方法研究替代途径激活的情况下,LMWCS对软骨细胞C3 mRNA水平的影响。4 LMWCS对实验性骨性关节炎的影响研究通过采用小鼠内侧半月板不稳定(destabilization of the medial meniscus,DMM)的方法诱导建立OA模型。考察LMWCS通过口服给药调节补体系统缓解、治疗OA的情况。利用测定小鼠后腿支撑力差值的方法考察小鼠OA的疼痛程度；利用番红固绿染色对LMWCS缓解OA的程度进行分析；利用ELISA和免疫组化的方法分别检测小鼠体内C5b-9的含量水平以及小鼠关节软骨的C5b-9的含量。5基于近红外光谱分析技术的CS抗补体活性筛选方法的建立收集不同来源、不同相对分子质量(Mr)的CS样品。采用漫反射的方式采集近红外光谱,利用溶血法测定样品抑制替代途径补体活性的IC50。通过利用因子实验设计的方法优选最佳预处理方法,利用无信息变量消除(uninformativevariable elimination, UVE),竞争自适应加权采样(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)和随机蛙跳(rondom frog)的方法选择有效信息建立偏最小二乘(partial least square,PLS)回归模型,采用预测集均方根误差(root-mean-squares error of prediction,RMSEP)、相对分析误差(residual predictive deviation,RPD)等参数对模型的预测能力进行评价。研究结果1 LMWCSs的制备及表征采取氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波辅助碱降解法对鲨鱼来源、猪来源和牛来源的CS进行降解共获得12种LMWCSs。FTIR结果显示LMWCSs和CS的骨架结构一致；采用HPLC进行双糖分析,结果表明不同来源的双糖组成不同,同种来源的CS和LMWCS组成相同,不同的降解方法对硫酸根的损失不同,酸降解和微波辅助碱降解的硫酸根丢失严重,氧化降解和酶降解对硫酸根含量影响不大；采用紫外分析表明酶解法产生的LMWCSs含有不饱和糖醛酸结构；NMR结果表明酶降解法的LMWCSs的非还原端产生了不饱和糖醛酸,而其它LMWCSs的非还原端结构与未降解的CS一致；分子排阻色谱-多角度激光散射测定LMWCSs的重均相对分子质量(厨w)的结果表明,通过利用不同的方法制备了厨w在1217 Da到8085 Da的LMWCSs.2不同LMWCSs的抗补体活性研究与构效关系对LMWCSs的结构和活性之间的关系进行研究。结果表明,利用鲨鱼来源的CS采用氧化降解的方法制备的LMWCS(LMWCS-S-O)具有更好的抗补体活性。对于LMWCSs与抗补体活性进行构效分析表明：△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S双糖结构有利于提高LMWCS的抗补体活性,而△Di-6S和△Di-OS不利于提高抗补体活性。LMWCS-S-O在缓解、治疗OA中可能具有更好的疗效。并且选择出具有较好活性的LMWCS-S-O和较低活性的猪来源CS(CS-P)进行进一步的活性研究。3 LMWCS对软骨细胞的影响采用ELISA的方法研究LMWC S对补体替代途径激活过程中C3沉积的结果表明,LMWCS-S-O在400 μg/mL时可以显着性地抑制C3b的产生,从而抑制替代途径激活。而猪来源CS(CS-P)在1.2mg/mL时才显着性的抑制替代途径；对提取的软骨细胞进行形态学和阿利新蓝染色结果表明软骨细胞提取正确；MTT实验表明在500 μg/mL的浓度下,LMWCS-S-O和CS-P对软骨细胞并没有毒性；补体介导的软骨细胞死亡的实验结果表明400 μg/mL的LMWCS-S-O可以显着性地抑制补体活性保护软骨细胞；RT-PCR的结果表明,LMWCS-S-O可以显着性地抑制由脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的软骨细胞C3mRNA水平,从而抑制软骨细胞的C3表达水平。4 LMWCS对实验性骨性关节炎的影响通过利用DMM的方法成功的建立了小鼠OA模型；小鼠支撑力结果表明LMWCS-S-O可以显着性地缓解OA带来的疼痛。番红固绿染色结果表明LMWCS-S-O可以减少小鼠骨关节表面软骨的损失,缓解OA的进程；ELISA和免疫组化的结果表明LMWCS-S-O可以抑制C5b-9的水平,其可以通过调节补体活性实现缓解、治疗OA的作用。CS-P同样表现出了缓解OA的效果,但作用不显着。5基于近红外光谱分析技术的硫酸软骨素抗补体活性快速筛选方法的建立通过漫反射方式采集了60个不同来源、不同Mw的CS样品的光谱,并利用溶血法测定其一级数据(IC50)；利用因子设计实验选择了一阶导数-SNV-SG亚滑-MC的最佳预处理方法；利用CARS法选择了47个变量建立PLS模型；模型的校正集的相关系数Rc=0.983,验证集的相关系数Rp=0.969,验证集的RMSEP=0.376 mg,RPD=5.46,建立的模型可以用于CS的抗补体活性筛选。结论和意义通过本研究制备了一系列的LMWCSs,研究了LMWCSs与抗补体活性之间的构效关系,揭示△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S双糖结构有利于提高LMWCS的抗补体活性,在缓解、治疗OA中可能具有更好的效果。并对LMWCS-S-O通过调节补体活性缓解OA进行了体外、体内的初步探索,证明鲨鱼来源LMWCS具有通过调节补体系统防治OA的潜在的药用价值。最后建立CS抗补体活性的快速筛选方法,有利于实现CS抗补体活性的快速筛选。
许媛媛[6]2008年在《胶原海绵的改性及其作为活性因子载体的研究》文中研究指明目的胶原海绵是组织提取物胶原经冻干制成的海绵状轻质片。本研究旨在通过对胶原海绵进行化学改性,改善胶原海绵机械强度不足、降解过快、过高的凝血酶活性和过度溶胀造成负载药物或活性细胞因子快速释放等缺点,使其在化学组成、物理结构、分子结构和生物学功能等方面尽可能与细胞外基质相似。改性后的胶原海绵不仅具有良好的生物相容性、较高的孔隙率、适中的机械强度和细胞粘附生长的结合位点,而且可以通过包埋和释放活性因子为损伤修复提供一个传输和诱导性环境。制备出一种理想的深度创伤敷料或组织修复支架,调节组织生长的环境,加速组织修复再生的血管化进程。方法采用酶解法从猪皮中提取胶原,通过HAc溶解制成均匀的胶原凝胶,SDS-PAGE鉴定其组成成分。-80℃冷冻保存,冷冻干燥制成胶原海绵。再分别采用零长度EDC/NHS交联一步法和EDC/NHS交联与肝素复合同步法对胶原海绵改性加工,主要从交联度、变性温度、焓、红外光谱峰值、微观形貌、吸水力、酶解稳定性、机械强度、细胞复合及增殖实验、复合bFGF的缓释周期和活性保持情况几方面比较分析未经处理的对照组、EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组胶原海绵在理化性能、生物性能和对复合bFGF的缓释和活性保持作用几方面的差异。初步考察上述两种改性方法的优越性。结果胶原SDS–PAGE图谱表明提取纯度较高,主要是Ⅰ型胶原,无Ⅲ型胶原存在。甲苯胺蓝分光光度法测定肝素均匀复合在胶原海绵表面,复合量为30mg/g。红外光谱峰值的改变说明了胶原分子间或胶原与肝素分子间或胶原分子内酰胺间的形成,部分–NH2转变为–NH,–COOH参与了交联反应,而且活化的肝素分子通过–COOH与–NH2共价键结合牢固结合胶原海绵表面,经改性处理后任意的α螺旋结构没有减少,反而在交联作用和肝素的共价结合下,肽链结合更牢固,螺旋结构的稳定性增强,体现在改性两组胶原海绵吸收峰的差异。TNBS比色法测定EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组自由氨基数大幅度减少,从对照组381(±7.36)nmol/mg分别降低到230(±5.53)nmol/mg和203(±16.27)nmol/mg,且EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin两组之间存在显着性差异(One way, ANOVA; p=0.023),反映两种改性方法在增强材料交联度方面的差异。改性胶原基质的湿热稳定性大大增强,变性温度从27.5℃分别升高到71℃和65℃。在两组之间交联度和成分差异的基础上,改性胶原海绵吸水力的增强程度也有不同,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组分别是36.85(±2.17)和32.41(±1.78)mg/mg,两组之间有显着性差异(One way, ANOVA; p=0.043)。另一方面,在干燥湿润状态下,胶原海绵形态稳定性增强。酶解稳定性方面也得到提高,经过9d的酶解后,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组剩余海绵基质分别是原始质量的81.4%和84.7%,而对照组在1.5-2h内几乎完全降解,EDC/NHS交联处理(One way, ANOVA; p<0.0001)和酶作用时间(One way ANOVA; p<0.0001)对胶原海绵基质降解有显着性差异,酶解后海绵微观结构和表面形态同样证实了这一结论。在机械性能的对比研究中,在干燥状态下,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组的最大载荷、断裂应力和弹性模量均显着增强,且存在差异性;在湿润状态下,两组最大载荷、断裂应力和断裂应变大幅度降低,但弹性模量均高于对照组。在HUVECs复合和共培养研究中,对照组细胞存活良好,但与后者相比,增殖速度较慢。而细胞在EDC/NHS组海绵支架上,细胞存活良好,沿微孔孔壁粘附伸展良好,增殖速度高于对照组。EDC/NHS-Heparin组,细胞不仅能存活粘附生长,而且在相同的时间内增殖速度明显高于另外两组,细胞沿孔壁生长,分布较均匀,大部分细胞融合且沿着海绵孔壁形成孔状结构,部分细胞向孔中央迁移。同时,共培养早期,对照组胶原海绵在内皮细胞分泌的蛋白酶作用下部分降解,叁维网状结构彻底塌陷,无孔状结构;而EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组在长时间共培养期间,叁维网状结构均保持良好,无任何塌陷。在进一步的bFGF复合、缓释和bFGF活性保持方面的评价中,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组的释放时间明显延长,且复合bFGF的EDC/NHS-Heparin组海绵在第1d内的突释量18%明显低于EDC/NHS组19.5%和对照组30.9%,缓释周期较长,在37d时释放量约94%。负载bFGF的海绵基质活性检测表明胶原海绵负载bFGF有利于生长因子的缓释,经MTT检测,叁组海绵载体复合bFGF,对bFGF的活性保持作用有明显差异。对照组在57d时仅21.9%具有活性,而EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组分别约有48.4%和58.6%保持活性。结论改性处理使胶原海绵交联度、热变稳定性、吸水力和酶解稳定性大大增强,孔径变大,形态稳定性和机械强度显着提高。相对EDC/NHS组,EDC/NHS- Heparin组交联度和酶解稳定性均有所提高,而变性温度和焓有少许降低,吸水力减小,且干燥/湿润状态下形态稳定性避免了胶原海绵接触体液后形变过大带来的不便和负载的生长因子或药物快速释放的缺点。EDC/NHS-Heparin组不仅能蓄积充足的营养液促进细胞快速增殖迁移,叁维网状结构保持良好,有利于长期培养过程中氧与营养成分的传输和代谢物的排出。HUVECs接种到EDC/NHS- Heparin组海绵支架上,快速黏附伸展,生长良好,且在短时间内增殖迅速,融合并向海绵微孔中央迁移,明显高于EDC/NHS组和对照组。体外评价表明改性海绵促内皮细胞增殖,预示其具备加速组织血管化速度的能力,创伤修复速度将会明显高于另外两组,且在肝素的作用下,修复处皮肤疤痕会比较小,且光滑。复合微量bFGF的释放和活性检测试验表明,与对照组相比,改性两组降低了突释量,延长释放周期,活性保持良好。说明改性的胶原海绵有利于bFGF缓释和活性保持,且EDC/NHS-Heparin组优于EDC/NHS组。总之,EDC/NHS交联和肝素复合同步法不仅简化通常两步法繁琐的操作,而且在不明显降低活性的情况下,对改善材料理化性能、生物性能和缓释bFGF方面有显着作用。
谈华平[7]2007年在《生物活性软骨组织工程支架的制备与性能研究》文中指出针对软骨组织的特点,设计化学结构仿生化的支架,再将细胞生长因子和生物活性基团引入其中,以增强支架的生物活性。用含有配体RGD的生物大分子和多肽修饰合成高分子微球,使其能与细胞发生特异性结合,来促进细胞粘附和铺展。设计生物活性大分子梯度分布的表面与界面,来调控软骨细胞的粘附行为。这些工作对具有诱导细胞增殖和迁移的软骨组织工程活性支架的设计和制备有重要意义。选用天然生物大分子明胶、壳聚糖和透明质酸模拟天然软骨化学组成,以冻干法制备了叁组分多孔支架,其中明胶、壳聚糖和透明质酸含量分别为82.6%,16.5%和0.9%。以碳化二亚胺(EDAC)为缩合剂,将肝素接枝固定于明胶/壳聚糖/透明质酸多孔支架表面,肝素接枝率可达到23%。通过对支架体外性能的对比研究,发现接枝肝素之后支架体外失重率降低,肝素在支架中能增加聚电解质分子之间的相互作用,稳定支架结构。在支架中加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),获得了复合有生长因子的活性多孔支架。体外软骨细胞培养结果表明,负载bFGF的肝素化明胶/壳聚糖/透明质酸多孔支架能提高细胞活性、促进细胞生长与功能表达。用细胞特异性配体分子对壳聚糖改性。以NaBH_3CN为催化还原剂,将乳糖接枝到壳聚糖分子上,制备了含有β-半乳糖基结构的壳聚糖-g-乳糖(Chitosan-g-lactose)。采用FTIR和~1HNMR证明了乳糖在壳聚糖分子上的接枝,测得壳聚糖氨基接枝率为66%。壳聚糖-g-乳糖膜的溶胀比和体外失重速率均很大,但和肝素共混之后,由于分子间的静电作用,使溶胀比和体外失重明显下降。体外细胞培养结果表明,壳聚糖-g-乳糖的细胞相容性显着优于壳聚糖;和肝素结合后,进一步促进了软骨细胞的粘附、增殖和基质分泌。采用冻干法制备了明胶/壳聚糖-g-乳糖/透明质酸多孔支架,该支架比前文的叁组分支架具有更强的促进软骨细胞增殖和基质分泌的能力。设计了将力学性能较好的PLGA微球与天然高分子复合,制备天然/合成复合支架。将PLGA微球和明胶/壳聚糖/透明质酸溶液混合,采用冻干法制备了PLGA/明胶/壳聚糖/透明质酸多孔支架,并考察了微球含量对复合支架力学性能、孔隙率、降解性能和吸水性能影响。当PLGA微球的含量不超过50%时,复合支架的多孔结构保持较好,孔径适合,孔隙率较高(＞90%)。支架压缩模量随PLGA微球含量的增加而增大,当微球含量为50%和70%时,压缩模量分别达到0.53MPa和0.68MPa;同时,支架体外失重速度和吸水率随着PLGA微球的含量的增加而降低。体外软骨细胞培养表明,软骨细胞在PLGA微球含量为50%的复合支架中能够正常生长和增殖。PLGA微球复合的明胶/壳聚糖/透明质酸支架具有较好的力学性能和生物活性,是一种比较理想的软骨组织工程支架。用含有RGD配体的活性生物大分子和多肽对可注射性PLGA细胞微载体进行了改性研究。采用乳液溶剂挥发法制备了PLGA/明胶复合微球,然后以EDAC为交联剂,将RGDS多肽接枝到PLGA/明胶复合微球上。羟脯氨酸和蛋白含量测试结果表明,在改性PLGA/明胶复合微球中,明胶含量为0.9mg╱20mg(明胶/微球),RGDS的接枝量为2.1μg╱20mg(RGDS/微球)。采用SEM对改性微球的表面形貌进行了对比观察。体外降解实验表明,在PBS中PLGA/明胶和PLGA/明胶-RGDS微球失重速度较快,而在DMEM/FBS培养基中则明显变慢。体外软骨细胞培养表明,与PLGA微球比较,PLGA/明胶-RGDS微球更有利于细胞的粘附和生长,因此更适合用作细胞微载体或注射型支架。利用微量注射和胺解技术相结合的方法在PLLA膜表面制备胶原生物大分子梯度。通过控制注射速度在PLLA膜表面实现梯度胺解,获得氨基梯度分布的聚合物表面;以戊二醛为偶联剂,将生物大分子胶原固定在膜表面,获得了表面具有胶原梯度分布的PLLA膜。分别采用茚叁酮法和羟脯氨酸法测定了梯度表面上氨基和胶原的浓度分布;扫描力显微镜(SFM)和静态接触角测试证明了材料表面的化学和物理性质的渐变过程。采用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察了荧光素标记胶原(FITC-Col)梯度的PLLA膜表面。梯度氨基浓度分布呈“S”型。建立了数学模型对其进行了拟合,通过拟合计算得到梯度表面的氨基总量。细胞粘附结果表明,胶原梯度表面可以有效调控软骨细胞的粘附和铺展程度,这对研究具有诱导性的支架研发具有重要的指导意义。
任翔[8]2016年在《挤压式生物3D打印机初建与仿生细胞分布组织工程软骨体外初步验证》文中研究说明研究背景细胞是生命结构和功能的基本单位,生物打印技术将细胞作为生物墨水打印构建组织和器官,标志着3D打印技术与生命科学的真正融合。与通常3D打印技术强调产品的制造精度和机械强度不同,生物打印技术更多的考虑的是细胞生物学表现。生物打印平台的构建、打印方案的设计和打印后产品的评价都围绕着细胞展开。由于生命科学极端复杂、多变,人类对细胞的理解十分粗浅,有太多的未知等待着探索,即使在科技发展日新月异的今天,生物打印技术仍然处在萌芽阶段,现阶段生物打印技术的研发与应用仍然属于概念验证,距离实现具备生理功能的组织、器官的人工打印再造的目标仍有很长的路要走。生物打印平台的建立是实现生物制造的必要条件,亦是生物打印领域内面临诸多挑战之一。生物打印机绝不是简简单单堆砌细胞和生物材料的装置,打印平台的建立代表了细胞生物学、生物材料学、自动控制、信息学等诸多学科高水平交叉综合应用的实力,体现了对生物打印核心技术的掌握。目前生物打印平台的搭建技术并不成熟,根据打印的细胞、生物材料以及打印的目的不同,生物打印平台构建形式也多种多样。世界上仅有少数几个发达国家有能力开发商品化细胞生物打印机,虽然这种生物打印机具有产品集成化程度高,操作简便等优点,但由于打印材料有限,打印平台软硬件受专利保护,无法根据打印实际需要进行参数修改和软硬件升级、优化,商品化细胞生物打印机并未得到广泛应用。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成,没有血管、神经和淋巴,几乎没有自我修复能力。一旦发生软骨损伤往往导致关节功能不可逆损害,最终引起骨关节炎发生,严重影响生活质量。软骨损伤修复尚无理想的治疗手段,软骨组织工程联合应用生命科学和工程制造的方法人工合成软骨组织,是当前最有希望解决软骨缺损修复困境的方法。分层构建组织工程软骨是软骨组织工程领域内的研究热点,强调从结构和功能上模拟天然软骨分层变化的规律。在哺乳动物关节软骨组织中,都存在着软骨细胞密度由软骨浅层至深层成梯度下降的分布规律,这是关节软骨发育和力学环境共同作用的结果,是关节软骨重要的分层结构特点之一。复习文献,国内外尚无研究关注构建具备仿生软骨细胞密度梯度分布规律的组织工程软骨。本研究期望自主建立挤压式水凝胶细胞生物打印机验证平台,初步掌握3D生物打印核心技术,尝试通过生物打印技术构建具备仿生软骨细胞密度梯度分布的组织工程软骨,验证生物打印技术在软骨组织工程中的应用,观察软骨细胞密度梯度分布生物学作用,探索一种分层构建组织工程软骨的新策略。方法本研究利用开源软硬件资料尝试自主搭建挤压式水凝胶生物打印验证平台,硬件系统包括:Prusa i3叁维打印机移动系统,数控微量凝胶挤压系统;软件应用包括:叁维电脑辅助设计软件(CAD软件)Solidworks、切片软件Slic3r、打印机上位控制软件Repetier-Host;选用3ml螺旋接口注射器作为水凝胶容器(生物打印墨水墨盒),25#平头针头作为挤压成型喷头,10%猪膝关节软骨II型胶原蛋白盐酸(0.15M)水溶胶作为打印墨水;安装Prusa i3叁维打印机移动系统和数控微量凝胶挤压系统构成挤压式水凝胶生物打印验证平台,使用Solidworks软件设计叁维实体模型,在切片软件Slic3r中设置打印层厚、打印条带走形方向及打印速度等参数,分割叁维实体模型生成连续的二维轮廓,生物打印机在生成的Gcode代码文件控制下完成水凝胶打印,打印成型的II型胶原溶胶块置于37℃孵箱内30分钟完成交联;本研究通过生物打印技术构建具备仿生软骨细胞密度梯度分布的组织工程软骨,实验参考正常成人膝关节股骨髁软骨中软骨细胞总体密度约为1×107cell/m L,关节软骨浅、中、深叁层细胞密度之比约3:2:1,使用复合不同软骨细胞密度的10%II型胶原蛋白水溶胶作为生物墨水,设计A组(细胞总体密度约为2×107cell/ml)、B组(细胞总体密度约为1×107cell/m L)、C组(细胞总体密度约为0.5×107cell/m L)叁组组织工程软骨,每组分别构建具有仿生软骨细胞密度梯度分布和细胞均匀分布的两类细胞分布形式组织工程软骨,体外培养,分别于第0、1、2、3周取材,进行细胞学、生化、组织学等相关检测,对比分析仿生软骨细胞密度梯度分布和细胞均匀分布的两类组织工程软骨,验证生物打印技术,观察仿生细胞密度梯度分布的生物学意义。结果挤压式水凝胶生物3D打印验证平台得到初步建立,挤压头与叁维运动系统匹配,系统运行平稳,打印过程全程可控,通过优化打印参数,3D细胞生物打印过程对细胞活性无明显影响;挤压式水凝胶生物3D打印平台能够实现仿生软骨细胞密度梯度分布组织工程软骨模型的构建,组织工程软骨体外培养3周,RT-q PCR结果显示:组织工程软骨中软骨细胞基因COL1A1持续低水平表达且出现下调趋势,基因COL2A1和ACAN表达水平随培养时间延长呈上调趋势,且具有统计学差异;核酸定量法测定组织工程软骨细胞总量结果显示:各时间点A、B、C叁组中两类组织工程软骨(细胞均匀分布组织块与细胞梯度分布组织块)细胞总量无统计差异,随培养时间延长各组组织工程软骨细胞总量均出现无统计学意义的下降趋势;组织工程软骨样本GAG定量结果显示:体外培养第1周,A、B、C叁组GAG总量与支架中细胞总体密度呈正相关,A组GAG含量最高,C组最低;培养第2、3周,C组GAG总量仍然最低,A组和B组GAG含量无统计学差异,为评估单个细胞GAG合成活性,分别将各组GAG总量与细胞总数标准化处理,体外培养第1周,各组间单细胞GAG合成量无统计学差异,在第2、3周,A组单细胞GAG合成量最低,B组具有最高的单细胞GAG合成量,B组中两类细胞分布组织块单细胞GAG合成量无统计差异,但B组细胞密度梯度分布组织块单细胞GAG合成量与A、C两组有统计差异,培养第3周,B、C两组中细胞均匀分布组织块单细胞GAG合成量有统计差异;免疫组化染色及阿尔新兰染色结果显示:免疫组化阳性染色细胞呈棕黄色,免疫组化阴性染色细胞呈蓝色,GAG成分被阿尔新兰染成蓝色,组织工程软骨中绝大多数软骨细胞表现为II型胶原蛋白阳性染色,一部分软骨细胞表现为PRG4阳性,只有少数软骨细胞出现I型胶原阳性染色,细胞密度梯度组软骨细胞新和成的II型胶原蛋白、PRG4和GAG成分呈现梯度分布规律,由浅层至深层逐渐减少。结论在熟悉并掌握生物3D打印相关基本原理和各系统软硬件组成基础之上,综合应用机械自动控制技术和生命科学理论,能够根据具体生物墨水和实际打印需要,利用开源软硬件资料自主设计并建立挤压式水凝胶生物打印验证平台,通过仿生细胞分布组织工程软骨模型的建立,验证了挤压式水凝胶生物打印验证平台能够实现软骨细胞在水凝胶支架中精确的空间定位,通过优化支架中细胞种植密度和分布模式能够提高细胞活性,研究结果表明生物打印仿生密度梯度分布组织工程软骨是一种分层构建组织工程软骨的新策略。
李雪峰[9]2012年在《转染LMP-1基因人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞体外双层细胞微球叁维条件下共培养的实验研究》文中研究说明目的：探讨人退变髓核细胞的体外分离、培养扩增及鉴定方法，并观察细胞微球叁维培养对其生物学特性的影响。方法：收集25例人退变椎间盘手术髓核标本组织，体外采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法将原代髓核细胞分离并连续培养扩增传代。利用倒置相差显微镜观察髓核细胞形态变化，通过Ⅱ型胶原及aggrecan免疫荧光化学染色法鉴定髓核细胞类软骨表型分子的表达。分别采用常规单层培养和细胞微球叁维培养退变髓核细胞，共设3个观察时间点（7、14、21天）。通过RT-PCR方法检测两组细胞aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9等基因的表达变化。结果：应用0.025%的Ⅱ型胶原酶37℃消化4小时即可分离出一定数量的原代人退变髓核细胞；体外培养观察发现其平均8天贴壁，细胞呈梭形、类圆形或多角性，细胞达到80%融合平均约需4周。免疫荧光化学及甲苯胺蓝染色法检测发现分离培养的髓核细胞可表达Ⅱ型胶原及aggrecan蛋白。RT-PCR检测结果显示细胞微球叁维培养组髓核细胞aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白及SOX-9基因的表达显着高于单层培养组（P<0.05）。结论：采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法可从退变椎间盘手术标本中分离出一定数量退变髓核细胞。该细胞呈类软骨表型（表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原）。与常规单层培养相比，细胞微球叁维培养可较好地保持其类软骨表型。目的：体外分离、培养扩增人脂肪组织来源的间充质干细胞，并通过流式细胞仪及多向诱导分化对其干细胞特性进行鉴定。方法：取10例剖腹产手术皮下脂肪标本，采用0.075%的Ⅰ型胶原酶消化法结合反复贴壁法分离培养并纯化人脂肪间充质干细胞；倒置显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞仪检测干细胞表型分子。随后分别在单层和细胞微球叁维环境下诱导人脂肪间充质干细胞定向成脂、成骨及成软骨分化，并采用油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色、甲苯胺蓝染色、aggrecan及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法检测。此外，应用RT-PCR方法检测单层诱导和细胞微球叁维诱导环境下，人脂肪干细胞成软骨分化后的基因表达。结果：应用0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化约1小时即可分离出较多的人脂肪间充质干细胞。原代人脂肪干细胞平均3天贴壁，达到80%融合约需9天；传至3代后，转变成均一的长梭形，并呈漩涡状排列。流式细胞仪检测分析发现人脂肪间充质干细胞高表达CD29、CD90、CD105分子，低表达CD34、CD45分子及HLA-DR。单层环境下多向诱导21天后，油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色均呈阳性。细胞微球叁维环境下成软骨诱导21天后，细胞团呈明显的软骨样形态，切片HE染色可见清晰的软骨特征样的细胞和细胞外基质分层排列。甲苯胺蓝、Masson叁色染色、及II型胶原、aggrecan免疫组化染色均呈阳性。RT-PCR结果显示细胞微球叁维环境下诱导的人脂肪干细胞软骨样表型基因（aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9）高于单层诱导组（P<0.05）。结论：通过Ⅰ型胶原酶消化结合反复贴壁法可获得大量纯化的人脂肪间充质干细胞，该细胞体外具有多向分化潜能，并且细胞微球叁维诱导环境更适合其成软骨分化。目的：构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体并对其进行鉴定，以获得高滴度的携带LMP-1基因慢病毒载体用于脂肪干细胞的转染。观察LMP-1基因对细胞微球叁维诱导环境下人脂肪间充质干细胞成软骨分化效应的影响。方法：根据人LMP-1基因（GeneBank序号：NM_005451）mRNA，设计并合成全基因的引物。从购买的cDNA文库中，利用PCR方法钓取目的基因。将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。最后将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提得到较高滴度、可表达LMP-1-GFP基因及GFP基因的慢病毒载体。并分别用于转染脂肪干细胞得到表达LMP-1-GFP基因或GFP基因的人脂肪干细胞。将转染LMP-1-GFP基因和GFP基因的人脂肪干细胞分别置于细胞微球叁维环境中进行成软骨诱导分化。其中，转染LMP-1-GFP基因的脂肪干细胞分别采用含TGF-β3的成软骨诱导基和不含TGF-β3的成软骨基础诱导基进行成软骨诱导，同时用含TGF-β3的软骨诱导基对单纯表达GFP基因的脂肪干细胞进行成软骨诱导并设为对照组。诱导21天后，采用RT-PCR方法检测各组诱导细胞软骨表型基因的表达，观察LMP-1基因能否诱导细胞微球叁维环境下人脂肪干细胞成软骨分化及其与TGF-β3诱导效应之间是否存在差异。结果：通过上述方法获得了高滴度(2x109TU/ml)的携带LMP-1基因的慢病毒。成软骨诱导对比实验表明TGF-β3诱导的转染LMP-1基因的人脂肪干细胞成软骨分化效应最强，其次为采用不含TGF-β3的成软骨基础诱导基诱导的转染LMP-1基因的脂肪干细胞，而采用含TGF-β3的成软骨诱导基诱导的转染GFP基因的人脂肪干细胞分化效应相对较弱，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：慢病毒是一种良好的基因转导载体工具，可有效地转染人脂肪干细胞并获得相关基因大量表达。与BMP-2、-7成软骨效应类似，LMP-1基因也可诱导细胞微球叁维诱导环境下人脂肪干细胞成软骨分化，并且该效应高于传统的诱导因子TGF-β3。此外，两者之间存在协同效应。目的：观察并检测LMP-1基因对人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞在双层微球微球共培养环境下相互效应的影响，并分析相关机制。方法：采用携带LMP-1-GFP或GFP基因的慢病毒载体转染人脂肪间充质干细胞，获得表达LMP-1-GFP或GFP基因的人脂肪干细胞。将其与退变髓核细胞在双层细胞微球叁维环境下共培养，同时设立混合细胞微球叁维共培养及单独细胞微球叁维培养组作为对照。共设立7个细胞培养组，分别为转染GFP基因脂肪干细胞叁维细胞微球单独培养组，转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球叁维共培养组、转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球叁维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞叁维细胞微球单独培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球叁维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球叁维共培养组及髓核细胞叁维细胞微球单独培养组。设立3个观察时间点：7、14、21天，采用阿利新蓝法检测各自蛋白聚糖含量，并通过流式细胞分选方法将表达GFP基因的脂肪干细胞与GFP表达阴性髓核细胞分离开来，采用RT-PCR方法检测共培养脂肪干细胞和退变髓核细胞各自aggrecan、Ⅰ、Ⅱ型胶原及SOX-9基因表达变化，并与单独培养组相比较。此外，我们还采用Western-blot蛋白免疫电泳法对各培养组脂肪干细胞上述基因变化在蛋白水平的表达进行了检测。结果：自培养的第14天起，双层细胞微球叁维共培养组蛋白多糖合成高于其余各细胞培养组（P<0.05）,此外，转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组蛋白多糖合成量显着高于转染GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组（P<0.05）。RT-PCR检测显示，自培养第7天起，细胞微球叁维共培养组髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan等基因表达均高于单独髓核细胞叁维微球培养组(P<0.05)。但双层细胞微球叁维共培养组髓核细胞上述基因表达与混合细胞微球叁维共培养组髓核细胞表达无显着性差异(P>0.05)。此外，与转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan基因表达高于与转染GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞（P<0.05）。此外，所有细胞微球叁维培养组髓核细胞Ⅰ型胶原基因表达均随时间增长逐渐降低（P<0.05）。除I型胶原外，脂肪干细胞叁维细胞微球单独培养组未见上述基因表达。双层细胞微球叁维共培养组脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球叁维共培养组（P<0.05）。此外，转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于转染GFP基因脂肪干细胞（P<0.05）。叁维细胞微球单独培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达逐渐增高，但细胞微球叁维共培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达呈逐渐下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，除I型胶原外，双层细胞微球叁维共培养组转染GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球叁维共培养组转染LMP-1基因脂肪干细胞（P<0.05）。结论：双层细胞微球叁维共培养较混合细胞微球叁维共培养更有利于髓核细胞对脂肪干细胞的类软骨诱导效应，同时，LMP-1基因可增强此效应，但双层共培养方式占主导作用。此外，脂肪干细胞对髓核细胞具有一定的营养效应，LMP-1基因也可增强此效应，而细胞微球叁维共培养方式（双层或混合）对该效应无明显影响（P>0.05）。
赵大庆, 李青, 陈广生, 马钰, 李航[10]2006年在《体外保存人鼻中隔软骨活性的实验研究》文中提出目的观察用组织培养法保存人鼻中隔软骨块活性的可行性。方法取临床常规手术中切除的成人正常的鼻中隔软骨27块,软骨大小约20 mm×20 mm×2mm,以RPMI-1640液于 37℃培养保存,于保存7天、14天、21天、30天、 60天、90天、120天、150天及180天时取样品, 分别用HE、AB／PAS及Masson叁色染色和台盼蓝排斥试验检测软骨活性。结果用RPMI-1640培养液保存的成人鼻中隔软骨,在整个180天培养期中均能保持较好活性,软骨细胞活性率保持在 80％以上。结论用组织培养法能较好地长期保存成人的软骨块活性,有望为临床治疗提供一种取材方便、新型有效的软骨修复材料。
参考文献：
[1]. 活性软骨体外长期保存及其应用的研究[D]. 赵大庆. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 转BMP7基因组织工程软骨的构建与移植修复兔膝关节软骨缺损[D]. 曲福军. 吉林大学. 2005
[3]. 保存人鼻中隔软骨活性的3种体外方法比较[J]. 杨宪法, 赵大庆, 崔鹏程, 徐凯. 中国组织工程研究与临床康复. 2008
[4]. 山羊骨髓间充质干细胞生物学特性、冷冻保存及基因转染研究[D]. 黄荣. 南京农业大学. 2011
[5]. 低分子量硫酸软骨素的制备、抗补体活性构效关系及治疗骨性关节炎的实验研究[D]. 李连. 山东大学. 2016
[6]. 胶原海绵的改性及其作为活性因子载体的研究[D]. 许媛媛. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[7]. 生物活性软骨组织工程支架的制备与性能研究[D]. 谈华平. 浙江大学. 2007
[8]. 挤压式生物3D打印机初建与仿生细胞分布组织工程软骨体外初步验证[D]. 任翔. 第叁军医大学. 2016
[9]. 转染LMP-1基因人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞体外双层细胞微球叁维条件下共培养的实验研究[D]. 李雪峰. 苏州大学. 2012
[10]. 体外保存人鼻中隔软骨活性的实验研究[C]. 赵大庆, 李青, 陈广生, 马钰, 李航. 中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编. 2006
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