论文摘要
任何生物都是在一定的温度范围内活动,温度是对生物影响最为明显的环境因素之一。温度能影响生物的生活状态、栖息分布、性别决定、生长发育以及存活。极端温度会造成生物体的损伤,如高温会使生物机体处于应激状态,发生代谢功能紊乱,活性氧异常且迅速增多,损伤细胞中核酸、脂质以及蛋白质,导致机体内氧化还原失衡,发生氧化应激反应,破坏正常的生理功能。因此高温是引发生物体氧化应激的最常见的原因。生物体内的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）等,维持着体内氧化平衡,而这些酶会受到相应基因的调控。FoxO是Forkhead转录因子家族中的成员,广泛存在于各种真核生物中,参与多种生物学功能包括抗氧化应激、凋亡和自噬、DNA损伤与修复、细胞周期以及能量代谢。已有研究报道哺乳动物FoxO家族中FoxO3a通过调控锰超氧化物歧化酶（MnSOD）来清除细胞内ROS从而降低细胞氧化损伤,表明FoxO参与了哺乳动物中的氧化应激调控。家蚕是历史悠久的经济动物,为中华民族经济发展和丝绸文化传播做出了卓越贡献。以“框架图、精细图和遗传变异图”为标志的家蚕基因组计划“三部曲”的完成,推动了家蚕转基因等功能基因研究与应用关键技术平台的建立。家蚕属于鳞翅目模式昆虫且是变温动物,外界的温度变化对家蚕生长发育起着关键性作用。高温处理导致家蚕存活率降低,这与体内的ROS增多有关。我国养蚕主要在南方高温地区较多,研究家蚕的抗高温机制以及培育抗高温品种对于养蚕业的发展具有较重要的意义。然而在家蚕中BmFoxO是否参与调控高温胁迫产生的氧化应激以及如何调控尚未见报道,因此本研究首先明确家蚕受到高温或者H2O2氧化胁迫后的分子变化以及造成的损伤情况,通过在BmE细胞过量表达BmFoxO来探究其对高温及氧化应激的影响,最后以BmE细胞作为对象,阐述BmFoxO调控家蚕氧化应激的分子机制。主要研究结果如下:1.家蚕响应高温以及H2O2诱导的氧化应激用37℃高温处理家蚕,与对照25℃相比,脂肪体中ROS含量逐渐升高,利用荧光定量PCR技术检测家蚕脂肪体氧化应激相关基因表达水平,结果显示在高温胁迫处理一定时间内BmFoxO以及抗氧化酶相关基因BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCAT以及BmGADD45基因均出现上调表达,而抗氧化酶BmGpx下调表达。利用生理生化试剂盒检测结果显示SOD和CAT酶活呈现先升高后降低的趋势。在H2O2胁迫处理一定时间内BmFoxO及抗氧化酶相关基因出现与高温处理一致的变化趋势。利用生理生化试剂盒检测结果显示ROS含量逐渐升高,而SOD和CAT酶活也出现与高温处理一致的变化趋势。以上结果表明高温或者H2O2会诱导家蚕氧化应激反应,且会使BmFoxO发生上调表达。2.在BmE细胞胞中中BmFoxO抵抗抗氧氧化化应应激激损损伤伤为了探索其高温或者H2O2诱导氧化损伤的机制,我们首先在BmE细胞中验证高温或者H2O2造成氧化损伤并在细胞上探索其机制。首先使用CCK-8试剂盒检测BmE细胞在37℃处理0、12、24和48 h后的活力变化,结果显示细胞活力随处理时间延长逐渐降低,并且用DCFH-DA探针检测显示细胞在37℃处理12 h后ROS含量明显增多。荧光定量PCR结果显示细胞受到高温诱导后氧化应激相关转录因子和抗氧化酶基因（除BmGpx外）表达量均上调。生理生化试剂盒检测结果表明高温处理后,细胞内SOD和CAT酶活上升,MDA和H2O2含量显著增加。结果表明高温胁迫会诱导BmE细胞氧化应激反应。高温和H2O2在家蚕中造成的氧化损伤趋势一致,为了更好地阐释氧化损伤的分子机制,我们选择H2O2处理进行后续的实验。分别使用终浓度为0、250、500、1000、2000μM的H2O2处理细胞后检测其活力变化,发现在浓度为1000μM以上的H2O2处理细胞后细胞活力出现不可逆下降,同时ROS含量明显增多。随H2O2浓度增加,BmFoxO、BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCAT和BmGADD45基因表达量逐渐升高,与家蚕中的表达变化趋势一致。SOD和CAT酶活和MDA含量持续升高。为了探究BmFoxO在细胞氧化应激中发挥何种功能,构建了BmFoxO过表达载体,并转染进细胞,发现过表达BmFoxO的细胞在高温或H2O2处理后ROS含量相较于对照组明显降低,细胞DNA损伤和死亡率显著降低。以上结果说明高温或者H2O2处理BmE细胞造成的氧化损伤与家蚕中一致,并且过表达BmFoxO能够减少BmE细胞受到氧化应激损伤。3.BmFoxO参与家蚕氧化应激的机制探究FoxO是蛋白激酶B（PKB或者Akt）的主要底物,其活性取决于磷酸化水平。胰岛素和生长因子会使FoxO定位到细胞质最终被降解,而磷酸化的FoxO会定位于细胞核从而调控下游靶基因的表达。为了明确BmFoxO受高温、H2O2处理后的活性影响,我们检测了BmFoxO的亚细胞定位情况,构建了带有EGFP的BmFoxO过表达载体,转染细胞后,发现37℃或H2O2处理都会使BmFoxO的定位从细胞质转移到细胞核,Western blot结果显示细胞受到H2O2胁迫后,BmFoxO大量在细胞核蛋白中被检测到,表明BmFoxO转录活性在高温和氧化应激损伤中增加。在H2O2处理后检测到细胞中Akt的磷酸化水平降低,说明H2O2抑制了Akt蛋白的磷酸化水平。为了探索BmFoxO的转录调控机制,我们对抗氧化酶基因启动子序列进行分析,预测到了Forkhead转录因子的结合基序。为了明确BmFoxO是否直接调控这些基因,设计引物并构建了双荧光素报告载体,双荧光素酶活实验显示BmFoxO能上调SOD1,SOD2,CAT,GADD45这些抗氧化酶基因的启动子活性,而且组成型形式的BmFoxOCA对这些启动子活性的上调效果更为明显。为了进一步确定BmFoxO对抗氧化基因的调控作用,设计了带有生物素标记的探针,EMSA实验表明BmFoxO可以与CRE3探针发生特异性的结合。综上结果表明H2O2通过抑制Akt磷酸化使BmFoxO定位于细胞核,从而增强抗氧化酶基因转录活性,来清除细胞内ROS,降低细胞受到的氧化损伤。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 文茂羽
导师: 卢忠燕
关键词: 高温,活性氧,抗氧化酶,家蚕
来源: 西南大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 西南大学
分类号: Q965
总页数: 83
文件大小: 6055K
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