王国芬[1]2004年在《化学诱导小麦条锈菌毒性突变研究》文中进行了进一步梳理小麦条锈病是我国小麦上最重要的病害之一，小麦条锈病菌的毒性变异是造成小麦品种抗锈性丧失导致病害流行主要原因。关于锈菌的毒性变异机制已提出了多种途径，普遍认为突变是产生新毒性基因的主要途径。由于在自然界中尚未发现小麦条锈菌的有性态，对由于毒性基因的突变而产生的新小种很难进行深入的遗传分析，所以关于小麦条锈菌的毒性变异研究较其它锈菌少，而关于毒性突变研究则更少。本研究应用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)对小麦条锈菌夏孢子进行诱变处理，对小麦条锈菌受诱变剂影响的各项生物学效应和毒性突变的特点进行研究，主要取得了以下几项结果： 1. 建立了化学诱导小麦条锈菌毒性突变的优化体系：研究中发现诱变剂对处理当代条锈菌夏孢子的各项生物学特性有明显的削弱性影响，使其夏孢子存活力降低，致病力减弱和繁殖能力下降。不同处理时间和浓度的夏孢子萌发率经 CurveExpert(1.3)MMF 和Harris 两个模型拟合的曲线为倒 S 型，表明小麦条锈菌夏孢子萌发率在 EMS 处理的浓度曲线和时间曲线上均有一个最适拟合系数，且夏孢子对低剂量 EMS 十分敏感。据此构建的 EMS 对小麦条锈菌毒性突变的优化体系为：室温下，pH＝7.0，C=0.03mol/L ,T=6～8min。小麦条锈菌夏孢子在此处理环境下的致死率在 80%～90%之间，根据微生物诱变筛选最佳诱变剂量的选择标准，上述参数可作为小麦条锈菌化学诱变的主要参量。 2. 筛选了具有不同毒性变异特点的小麦条锈菌 CY17 和 CY31 突变菌系：CY17 有 5个毒性突变菌系17M1～17M5，17M1中9个突变菌株都对早洋发生了无毒性突变；17M2对维尔发生了毒性突变；17M3 对南大 2419 发生了毒性突变；17M4 同时对南大 2419和水源 11 都发生了毒性突变；17M5 对阿勃、水源 11 也同时为毒性突变。CY31 有 4个毒性突变菌系 31M1～31M4，31M1 中 6 个菌株对尤二和 T.E 为毒性突变体，31F14-1对丹麦 1 号只为中感，而 31MutS1是 CY32；31M2 对多个品种产生了无毒性突变；31M3和 31M4 分别为两个无毒性突变体 31C7-1和 31C7-2，它们在繁殖一代时对其筛选品种中四有致病能力，但在繁殖 3～4 代后，其致病力丧失，且对大部分鉴别寄主的反应型也随着降低，表明了 EMS 的多位点诱变作用。聚类图表明各突变菌系与其原始菌株的相关系数都在 85%以上，每个菌系中都有对不同品种发生多种微小突变的菌株，说明突变菌系与原始菌株既有一定的同源关系，又有微小的毒性变异区别，是化学诱变剂 EMS诱导单点突变和逐步突变后的结果。而且 CY17 以无毒性突变体居多，CY31 则以毒性突变体居多, 表明诱导后的弱毒菌株多为无毒性突变，而强毒性小种则主要为毒性变异。 3. 研究了突变体与其原始菌株的寄生适合度：发现 CY17 各突变菌株之间的差异主要显示在夏孢子的生活能力和夏孢子在小麦叶片上的侵染和扩展能力上。根据贡献值排
王阳[2]2007年在《小麦条锈菌遗传转化体系的构建》文中研究说明小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis West. f.sp tritici)引起的气流传播性病害,是世界各主要麦区,也是我国小麦上最重要的病害和主要监控研究对象。国内外研究和生产实践证明,种植抗锈良种是综合控制小麦条锈病最经济、有效、易行和对环境安全的核心措施。但是小麦条锈菌毒性变异频繁,可以通过变异产生新的毒性小种,导致小麦品种抗病基因失效,引起小麦条锈病周期性流行危害。因此,阐明小麦条锈病菌毒性变异的原因和规律,提出有效对策,以延长小麦品种使用寿命,是小麦条锈病防治和小麦育种中亟需解决的关键问题。小麦条锈菌主要是通过突变和异核作用产生致病性变异,病原菌突变体库的构建是对其进行分子遗传分析的重要手段,也是克隆致病相关基因的捷径。本研究探索了产生小麦条锈菌突变体的途径,建立了一套有效的条锈菌遗传转化体系,主要研究结果如下:1.比较了电击转化,EMS化学诱变以及基因枪轰击产生条锈菌毒性突变体的效果,结果表明,电击转化不能有效的产生条锈菌毒性突变体,EMS化学诱变以及基因枪轰击均可有效的产生毒性变异,可以用来建立转化体系。2.建立了化学诱导小麦条锈菌毒性突变的最佳体系:研究中发现诱变剂对处理当代条锈菌夏孢子的各项生物学特性有明显的削弱性影响,使其夏孢子存活力降低,致病力减弱和繁殖能力下降。不同处理时间和浓度的夏孢子萌发率经CurveExpert(1.3)MMF和Harris两个模型拟合的曲线为倒S型,表明小麦条锈菌夏孢子萌发率在EMS处理的浓度曲线和时间曲线上均有一个最适拟合系数,且夏孢子对低剂量EMS十分敏感。据此构建的EMS对小麦条锈菌毒性突变的最佳诱导体系为:室温下,pH=7.0,C=0.03mol/L,T=6-8min。小麦条锈菌夏孢子在此处理环境下的致死率在80%～90%之间,根据微生物诱变筛选最佳诱变剂量的选择标准,上述处理可作为小麦条锈菌化学诱变的主要参数。3.建立并优化了小麦条锈菌基因枪法转化体系:影响基因枪转化率的因素很多,包括微弹的速度、射程、金粉用量、小麦条锈菌夏孢子的密度和水化时间、轰击时的氦气压,爆破膜承载压力,金粉颗粒的直径等多种因子。本实验研究表明在爆破膜承载压力为650、900Psi,爆破膜与承载膜之间的距离为2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压力2.7×104 Pa以及金粉颗粒直径为0.6μm时,萌发率较高但是转化率低,而在爆破膜承载压力为1100、1350和1550 Psi,爆破膜与承载膜之间的距离2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压2.7×104Pa以及金粉颗粒直径为0.6μm时,萌发率相对较低但是转化率较高。此外,在对小麦条锈菌转化体系的其它条件研究发现,每一枪锈菌用量0.2mg,金粉用量每枪500μg,质粒1μg,水化2h时所得转化率较高,以上结果作为基因枪转化小麦条锈菌的主要参数。4.明确基因枪法转化条锈菌后报告基因的瞬时表达特点:以携带报告基因GUS基因的质粒(pGUS6L20)转化小麦条锈菌,随爆破膜承载压力增大GUS基因瞬时表达率逐渐升高,小麦条锈菌夏孢子在承载膜压力为1100、1350、1550psi下时均可瞬时表达。在1350psi和1550psi爆破膜承载压力下转化率相对较高可达到0.2%和0.34%,但是转化后的夏孢子萌发率只有25%左右。还发现x-gluc染色后,有些孢子颜色呈深蓝色,有些孢子则呈浅蓝色,表明在锈菌孢子中GUS的拷贝数和表达量有差别。以携带抗性基因hpt的质粒(pKLHyg14)转化条锈菌夏孢子,在爆破膜承载压力为650Psi、900Psi、1100Psi下,转化后的条锈菌夏孢子在含有50μg/ml潮霉素B的培养基上的萌发率都比对照有显着的提高,说明hpt抗性基因已在夏孢子中表达。因此报告基因GUS和抗性基因hpt均可作为条锈菌转化体的筛选标记。5.筛选了具有不同毒性变异特点的小麦条锈菌CY17和CY31突变菌系:CY17有4个毒性突变菌系17M1～17M4:17M1中7个突变菌株都对早洋发生了无毒性突变;17M2对南大2419发生了毒性突变;17M3同时对南大2419和水源11都发生了毒性突变;17M4对阿勃、水源11也同时为毒性突变。CY31有3个毒性突变菌系31M1～31M3:31M1中5个菌株对尤二和T.E为毒性突变体、31F14-1对丹麦1号只为中感,而31MutS1是CY32; 31M2和31M3分别为两个无毒性突变体31C7-1和31C7-2,它们在繁殖一代时对其筛选品种中四有致病能力,但在繁殖3～4代后,其致病力丧失,且对大部分鉴别寄主的反应型也随着降低。表明了EMS的多位点诱变作用。聚类图表明各突变菌系与其原始菌株的相关系数都在85%以上,每个菌系中都有对不同品种发生多种微小突变的菌株,说明突变菌系与原始菌株既有一定的同源关系,又有微小的毒性变异区别,是化学诱变剂EMS诱导单点突变和逐步突变后的结果。而且CY17以无毒性突变体居多,CY31则以毒性突变体居多,表明诱导后的弱毒菌株多为无毒性突变,而强毒性小种则主要为毒性变异。6.基因枪法转化条锈菌毒性突变体的获得及其生物学特性:以小麦条锈菌白化单孢菌系-5为转化受体,以分别含有GUS基因和潮霉素抗性基因(hpt)的质粒为载体,采用基因枪法转化小麦条锈菌。以携带报告基因GUS基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌后,在可裂膜为1350和1550Psi时,检测到GUS基因在其后代中表达;以携带抗性基因hpt的质粒pKLHyg14转化小麦条锈菌后,在可裂膜为1100Psi时,得到两个稳定的毒性突变菌株M1100-4-2、M1100-4-3。M1100-4-2菌株对南大2419的毒性减弱,反应型由野生菌系的4型变为2型;M1100-4-3菌株在南大2419的反应型由野生菌系的4型变为2 ,3型,毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明,各突变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。转化获得的突变体生物学特性发生了较大的变异,对多数筛选品种的毒性丧失,且潜育期延长。进一步用Hyg基因特异PCR在两个突变菌系中均扩增到目的片段,表明M1100-4-2、M1100-4-3的突变是由Hyg基因插入引起的。本项目采用化学诱变法建立了小麦条锈菌毒性突变菌系,采用基因枪轰击导入外源基因标记,获得条锈菌致病性变异的突变体,建立了条锈菌致病性遗传研究新的技术体系,为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。
张如佳[3]2007年在《基因枪介导小麦条锈菌毒性突变的研究》文中指出小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis West. f.sp tritici)引起的气流传播性病害,是世界各主要麦区,也是我国小麦上最重要的病害和主要监控研究对象。国内外研究和生产实践证明,种植抗锈良种是综合控制小麦条锈病最经济、有效、易行和对环境安全的核心措施。但是小麦条锈菌毒性变异频繁,可以通过变异产生新的毒性小种,导致小麦品种抗病基因失效,引起小麦条锈病周期性流行危害。因此,阐明小麦条锈病菌毒性变异的原因和规律,是小麦抗病育种,延长小麦品种使用寿命,防治小麦条锈病亟需解决的关键问题。小麦条锈菌主要是通过突变和异核作用产生致病性变异,构建病原菌突变体库是对其进行分子遗传分析的基础,也是克隆致病相关基因的捷径。本研究探索了插入突变产生小麦条锈菌突变体的途径,建立了一套有效的条锈菌遗传转化体系,主要研究结果如下:1.建立了小麦条锈菌基因枪法转化体系:本研究对影响基因枪轰击转化率的爆裂膜承载压力、射程、金粉用量、金粉颗粒的大小、小麦条锈菌夏孢子的密度和水化时间以及轰击时的氦气压等多种因子进行了优化。建立了优化的小麦条锈菌基因枪法转化体系:轰击前将0.2mg夏孢子均匀的涂布于12cm面积的琼脂糖培养基表面,置于4℃下水化2h。1μg质粒DNA包裹500μg直径为0.6μm的金粉颗粒为轰击体。最适爆裂膜承载压力为1100和1350psi,爆裂膜与承载膜之间的距离为2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm,氦气压为2.7×104Pa。2.明确基因枪法转化条锈菌后报告基因的瞬时表达特点,确认GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可作为条锈菌转化体的筛选标记:以携带GUS基因的质粒(pGUS6L20)转化小麦条锈菌,GUS基因在经爆裂膜承载压力为900、1100、1350、1550psi时所转化的小麦条锈菌夏孢子中均有表达,随爆裂膜承载压力增大GUS基因瞬时表达率逐渐升高。经爆裂膜承载压力为1350和1550psi处理后,GUS基因在夏孢子中的表达率相对较高可达到0.2%和0.34%,但是转化后的夏孢子萌发率却只有25%左右。同时还发现经X-Gluc染色后,有些孢子颜色呈深蓝色,有些孢子则呈浅蓝色,表明在锈菌孢子中GUS基因的拷贝数和表达量有差别。以携带潮霉素抗性基因hpt的质粒(pKLHyg14)转化条锈菌夏孢子,在爆裂膜承载压力为650、900、1100psi时,转化后的条锈菌夏孢子在含有50μg/mL潮霉素B的培养基上的萌发率都比对照有显着的提高,说明hpt基因已在夏孢子中表达。因此GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可作为条锈菌转化体的筛选标记。3.获得了基因枪法转化的条锈菌毒性突变体:以小麦条锈菌白化单孢菌系-5为转化受体,以分别含有GUS基因和潮霉素抗性基因(hpt)的质粒为载体,采用基因枪法转化小麦条锈菌。以携带GUS基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌,经爆裂膜承载压力为1350和1550psi处理后,在其后代中检测到GUS基因表达,随着代数的增加表达量减少,叁代后检测不出来。以携带潮霉素抗性基因hpt的质粒pKLHyg14转化小麦条锈菌后,经爆裂膜承载压力为1100psi处理后,得到两个稳定的毒性突变菌株M1100-4-2、M1100-4-3。M1100-4-2菌株对南大2419的毒性减弱,反应型由野生菌系的4型变为2型;M1100-4-3菌株在南大2419的反应型由野生菌系的4型变为2、3型,毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明,各突变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。进一步用hpt基因特异PCR在两个突变菌株中均扩增到目的片段,初步证明M1100-4-2、M1100-4-3的突变是由hpt基因插入引起的。本项目采用基因枪轰击导入外源标记基因,获得条锈菌致病性变异的突变体,建立了条锈菌致病性遗传研究新的技术体系,为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。
于秀梅[4]2006年在《条锈菌诱导的小麦抑制差减杂交文库构建（SSH）及其表达序列标签（ESTs）研究》文中研究说明由Puccinia striiformis f. sp. Tritici引起的小麦条锈病是我国小麦生产上最重要的病害之一,它分布广、传播快、危害大。选育并合理利用抗病品种是防治麦类锈病最为经济而有效的措施之一。然而,由于条锈菌毒性变异频繁,新的毒性小种不断出现,往往导致小麦品种抗锈性丧失,这已成为抗病品种应用中一个突出的问题。开展小麦与条锈菌互作的分子机理研究,不但可以揭示病原物的致病机理和寄主植物的抗病机制,而且对小麦抗条锈品种的合理利用及病害的可持续控制具有重要的理论和实际意义。本研究利用抑制差减杂交技术构建了条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,对文库中序列进行了功能注释和分类,初步探明了条锈菌诱导后小麦的基因表达情况,并对筛选到的抗病相关基因进行了克隆,为从分子水平阐明小麦的抗病机制奠定了基础。本论文主要包括以下几方面内容:1.采用4种方法对小麦不同器官的总RNA进行了提取。比较后发现NaAC/无水乙醇沉淀法适于小麦各器官总RNA的提取,具有沉淀时间短、产量高、操作简便、价格便宜等优点;不同器官的总RNA以小麦乳熟期籽粒中含量最高;研究表明小麦叶片的rRNA组成比较复杂,除含有细胞质25S和18S rRNA,还存在大量的叶绿体23S、16S和9S rRNA。2.本研究以小麦品种水源11和条锈菌CY23为试验材料,构建了接种后24 h、48 h、72 h混合的小麦叶片非亲和SSH文库。对文库中包含的2 606个阳性克隆提取质粒并测序,共得到2 167条高质量ESTs。经Cap3软件聚类后获得652个Unigenes,包括333个Contigs和319个Singlets。功能注释和分类后发现,在已知功能的Unigenes中,以能量和基础代谢类最多,占27%;抗病与防御类、膜和转运类基因分别占11%和10%;信号转导类、氨基酸合成加工类各占4%;次生代谢类占3%;DNA和RNA结合类、转录和翻译类分别占2%和1%;还有34%的未知功能Unigenes,包括未知功能蛋白和在非冗余蛋白数据库中无显着匹配的序列。3.对SSH文库中获得的抗病相关基因进行了分析,推测锌指蛋白、苯丙氨酸解氨酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶和甘氨酸脱羧酶等参与了小麦的主要抗病过程;过敏性反应诱导蛋白、伤诱导蛋白、胁迫反应蛋白、铁缺乏诱导蛋白等可能也在抗病过程中发挥作用。对信号转导相关基因分析后发现,GTP结合蛋白、Ran结合蛋白、MAP激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、丙酮酸脱氢酶激酶、信号识别颗粒蛋白等可能参与了抗病信号转导过程;1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)和S-酰苷甲硫氨酸合成酶在SSH文库中同时存在,推测乙烯信号途径可能也参与启动抗病防卫反应过程。对文库中转运相关基因分析发
汤春蕾[5]2008年在《小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测及小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析》文中进行了进一步梳理第一部分小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. Tritici)引起的小麦条锈病是世界范围内小麦生产上的一个重要病害,主要发生在气候凉爽潮湿的地区。在条锈菌夏孢子越冬时期,被病原菌侵染的小麦叶片在潜伏期不表现任何症状,一种快速可靠的检测方法有助于提早预测小麦条锈病的爆发,有效控制病害发生。基于组织学,形态学等检测小麦条锈菌的传统方法费时耗力,还需要具备丰富的植物病理学知识。为加速并简化小麦条锈菌的检测方法,本研究建立了利用特异性高,灵敏度好的巢式PCR方法对小麦条锈菌进行检测。1.引物特异性检测。根据小麦条锈菌的PSR序列设计特异引物Pst1-Pst2,利用小麦条锈菌7个不同的生理小种夏孢子及6种其他小麦病原菌DNA为模板检测其特异性。小麦条锈菌的7个生理小种都产生约470bp的目的条带,而其他小麦病原菌无产物。这说明,引物Pst1-Pst2具有小麦条锈菌特异性,而无小种特异性,适于小麦条锈菌的检测。2.巢式PCR检测小麦条锈菌。第一轮PCR反应以依次稀释10倍的小麦条锈菌DNA为模板,利用引物Pst1-Pst2扩增,可检测到1pg小麦条锈菌。第二轮PCR反应以第一轮PCR产物为模板,利用内引物Nest1-Nest2扩增,检测灵敏度可达1fg。利用接种条锈菌的小麦叶片基因组DNA为模板,巢式PCR在接种24h后即可检测到病原菌的存在。巢式PCR特异性强,灵敏度高,在小麦条锈菌侵染早期即可检测到微量病原菌,为小麦条锈病的早期诊断提供了有利工具。第二部分小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析蛋白激酶是酶中的一个大家族,其可逆蛋白磷酸化作用在所有真核细胞基础功能调节中起重要作用,如细胞周期控制、能量代谢、细胞与细胞之间的通讯和介导与周围环境的复杂相互作用等。为阐明小麦-小麦条锈菌互作过程中的一些分子事件及有关蛋白激酶的功能,本研究在本实验室已建立的小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合cDNA文库及小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合SSH文库中挑选蛋白激酶类基因,通过斑点杂交检测其在小麦与条锈菌互作中的表达趋势。选取表达水平有明显变化的蛋白激酶类基因,通过实时荧光定量PCR更精确的检测小麦条锈菌感染小麦过程中,小麦相关激酶类基因表达水平的变化。1.斑点杂交检测小麦相关蛋白激酶类基因表达趋势。在实验室已建立的小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合cDNA文库及小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合SSH文库中挑选出94个蛋白激酶类基因的EST序列。对挑选出的93个EST质粒进行斑点杂交,检测在亲和及非亲和组合中,小麦在接种条锈菌0h,18h,24h,48h,72h后表达水平的变化。检测根据杂交结果,挑选出30个表达水平变化明显的激酶类基因。2.相关激酶类基因的real-time PCR分析。以18SrRNA持家基因为内参,利用SYBR GreenⅠreal-time PCR方法分析了19个激酶类基因在亲和及非亲和组合中,小麦在接种条锈菌0h,12h,18h,24h,48h,72h,120h后表达水平的变化。在非亲和组合中,多数蛋白激酶类基因在条锈菌侵染前期表达量较高,尤其在接种后12h和24h,可能参与植物感受病原菌刺激的信号转导过程。另外一些表达量基本没有变化或者在亲和及非亲和组合中表达趋势基本一致,可能为组成型表达基因或与植物其他抗逆反应或生物学功能有关。由于小麦基因组的复杂性,使小麦蛋白激酶的研究还属于零星的研究,远未能形成对蛋白激酶在各反应中的完整认识。小麦与条锈菌的互作是一个很复杂的过程,互作中小麦蛋白激酶的研究将为小麦的基础代谢、抗逆和抗病害的机理研究奠定基础。
参考文献：
[1]. 化学诱导小麦条锈菌毒性突变研究[D]. 王国芬. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 小麦条锈菌遗传转化体系的构建[D]. 王阳. 西北农林科技大学. 2007
[3]. 基因枪介导小麦条锈菌毒性突变的研究[D]. 张如佳. 西北农林科技大学. 2007
[4]. 条锈菌诱导的小麦抑制差减杂交文库构建（SSH）及其表达序列标签（ESTs）研究[D]. 于秀梅. 西北农林科技大学. 2006
[5]. 小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测及小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析[D]. 汤春蕾. 西北农林科技大学. 2008