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好氧硝酸盐还原菌Delftia tsuruhatensis NF4的筛选、固定化及nap基因的克隆与表达研究

2020-12-10阅读(285)

好氧硝酸盐还原菌Delftia tsuruhatensis NF4的筛选、固定化及nap基因的克隆与表达研究

论文摘要

近年来,污水中排放的含氮物质是导致水体富营养化严重污染的主要因素,引起了人们的广泛关注。氮去除是污水处理过程中的重要环节,传统的硝化-反硝化处理模式,由于其反硝化过程缓慢,需要分离硝化和反硝化反应器,具有成本较高,实现较难的问题。因此近年来,好氧反硝化研究逐渐发展起来,其反硝化过程可以在好氧状态下,将硝酸盐化合物还原成无害的氮气,具有经济有效的生物除氮前景。但目前在实验室条件下对好氧反硝化菌的调查和分离还不足,需要完善补充好氧反硝化微生物资源,为实现好氧硝化-反硝化高效除氮应用奠定重要基础。本文以成都市凤凰河二沟污水处理系统的水体为研究对象,比较了自然状态和实验室好氧条件下,好氧硝化和好氧反硝化细菌的功能多样性;从中筛选了一株具有较强好氧硝酸盐还原能力的代尔夫特菌（Delftia tsuruhatensis NF4）,克隆硝酸盐还原酶nap基因并进行原核表达和固定化脱氮功能研究,主要研究结果如下:（1）采用高通量Illumina Miseq测序技术对污水处理生态系统的总进水口,CRI出水口和总出水中的细菌多样性进行研究,并比较了在好氧硝化和好氧反硝化培养基上的培养物与自然水体中细菌多样性的区别。结果共得到509,464条高质量细菌16S rRNA序列,将序列进行分类得到九个细菌门,分别为厚壁菌门（Firmicutes）,拟杆菌门（Bacteroidetes）,变形菌门（Proteobacteria）等。其中变形菌门（Proteobacteria）是污水处理生态系统的优势类群。人工快渗系统（CRI）出水中变形菌门在自然条件下和在好氧硝化及好氧反硝化培养物中的丰度变化不大。而总进水和总出水样品在好氧硝化和好氧反硝化的培养基中,变形菌门丰度显著下降,拟杆菌门显著增加。基于主坐标分析（PCoA）可知,对于相同采样点水样用好氧硝化和好氧反硝化培养基培养,其两两聚合度均很高。说明利用好氧硝化和好氧反硝化培养基分离到的细菌在很大程度上是重叠的,这类细菌可能同时具有好氧硝化和反硝化功能。CRI的3个样品的聚合度较进水口和出水口样品的聚合度更高,说明人工快渗系统的水样通过好氧硝化,好氧反硝化培养基培养后可以得到与自然水体更为接近的群落组成。（2）基于高通量测序结果,采用平板分离技术对CRI出水口的好氧硝酸盐还原菌进行了分离纯化和鉴定。得到一株好氧硝酸盐还原能力较强的菌株NF4,对硝酸盐去除率为96.8%。染色镜检为革兰氏阴性杆菌,与食酸代尔夫特菌（Delftia]acidovorans）和Delftia tsuruhatensis的生化指标,包括发酵葡萄糖、木糖、乳糖、尿素,双水解精氨酸,还原硝酸盐进行比对发现,与Delftia tsuruhatensis的相似度最高,且三株菌均具有硝酸盐还原能力。16S rDNA分子生物学分析,初步鉴定为代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis。该菌原来属于丛毛单胞菌属（Comamonas）,随着近年对于该菌的深入进化分支研究,将其单独归入代尔夫特菌属。（3）通过海藻酸钠包埋法,对游离Delftia tsuruhatensis NF4和固定化Delftia tsuruhatensis NF4的反硝化能力进行了比较测定。结果表明,两者对硝酸盐均有去除能力。在33 mg/L的硝态氮初始浓度、接种量5%（V/V）、温度30℃、转速140 r/min、初始pH 7.0的条件下,固定化菌株的硝态氮降解率、亚硝态氮积累量、总氮去除率分别为98.06%、27.46 mg/L、26.17%,为游离态菌株的1.5倍。因此,用海藻酸钠固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4,能够提高菌株反硝化性能。此外对固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4的固定化条件进行了优化,其它条件不变,通过改变培养液中初始硝态氮浓度、初始pH值及培养温度,研究固定化菌株Delftia tsuruhatensis NF4的硝酸盐去除性能的影响,找到最优硝酸盐去除条件。结果表明,固定化Delftia tsuruhatensis NF4在pH值3-9、温度20-45℃、硝态氮初始浓度16.5-165 mg/L均有硝酸盐去除活性。在初始pH 7.0、温度为30℃,硝态氮初始浓度为16.5 mg/L和33 mg/L时,去除率均为100%。硝态氮初始浓度16.5-165 mg/L之间时,24 h时硝酸盐降解活性随着初始浓度的增大而增强。（4）以Delftia tsuruhatensis NF4为出发菌,利用NCBI收录的Delftia tsuruhatensis strain CM13菌的基因组硝酸盐还原酶基因序列（登录号:CP017420.1）为模板,设计nap基因的特异性引物,TA克隆构建重组克隆载体pMD 19-T-nap。利用Nde I/Xho I双酶切和T4连接酶连接构建pET28a（+）-nap重组质粒载体,转化E.coli BL21（DE3）获得BL21（DE3）-pET28a（+）-nap E.colli工程菌并验证。NCBI Blastp蛋白序列比对,表明代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis NF4硝酸盐还原酶氨基酸序列与Delftia tsuruhatensis的硝酸盐还原酶（Sequence ID WP047325778.1）同源性最高,为98.94%,与Delftia acidovorans的硝酸盐还原酶（Sequence ID:WP034399787.1,Sequence ID:WP034399787.1）同源性也高于98%。该蛋白属于Molybdopterin-Binding超家族成员。重组子表达的目的蛋白分子量约为101.375 kDa,与预测的蛋白大小相符合。20℃,0.2 mM IPTG条件下诱导的超声破碎上清液表达量比0.4 mM IPTG诱导的略高。结合SDS-PAGE和Western Blot检测结果可知,0.2 mM IPTG诱导主要以包涵体的形式表达,上清表达量低,0.4 mM IPTG诱导的以包涵体的形式表达。通过比较pET28a（+）-nap-BL21工程菌和pET28a（+）-BL21的硝酸盐还原酶活,前者为40.28 U/L,后者为21.62 U/L。表明本实验构建的pET28a（+）-nap-BL21工程菌能够表达具有活性的硝酸盐还原酶。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 前言
  •   1.1 脱氮技术
  •     1.1.1 物理脱氮法
  •     1.1.2 化学脱氮法
  •     1.1.3 生物脱氮技术
  •   1.2 生物的反硝化作用
  •   1.3 硝酸盐还原酶（nitrate reductase）
  •   1.4 微生物细胞的固定化
  •     1.4.1 固定化材料
  •     1.4.2 固定化方法
  •     1.4.3 微生物固定化技术在生物生物脱氮中的应用
  •   1.5 研究目的及意义
  •   1.6 本课题的主要内容
  •   1.7 实验路线
  • 第2章 污水处理生态系统水体群落多样性研究
  •   2.1 培养基
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 水样采集
  •     2.2.2 样品处理
  •     2.2.3 基因组DNA提取和PCR扩增
  •     2.2.4 PCR产物的混样和纯化
  •     2.2.5 文库构建和上机测序
  •     2.2.6 测序数据优化
  •     2.2.7 数据处理
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 样品有效性验证
  •     2.3.2 细菌的相对丰度和多样性
  •     2.3.3 自然水体与在硝化/反硝化培养基培养菌群的丰度差异
  •   2.4 讨论
  •     2.4.1 环境中细菌多样性的分析方法
  •     2.4.2 自然水体与在硝化/反硝化培养基培养菌群的丰度差异
  •     2.4.3 根瘤菌科细菌（Rhizobiaceae）的反硝化作用
  •   2.5 本章小结
  • 第3章 好氧硝酸盐还原菌Delftia tsuruhatensis NF4 的筛选、分离和鉴定
  •   3.1 实验材料与仪器
  •     3.1.1 样品来源
  •     3.1.2 实验仪器
  •     3.1.3 实验试剂
  •     3.1.4 培养基
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 凤凰河二沟CRI出水口水样采集
  •     3.2.2 好氧硝酸盐还原菌的富集分离方法
  •     3.2.3 好氧硝酸盐还原菌的筛选
  •     3.2.4 好氧硝酸盐还原菌NF4 的鉴定
  •     3.2.5 生长曲线测定方法
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 好氧硝酸盐还原菌种筛选结果
  •     3.3.2 好氧硝酸盐还原菌NF4 的鉴定结果
  •     3.3.3 Delftia tsuruhatensi NF4 生长曲线测定
  •   3.4 讨论
  •   3.5 本章小结
  • 第4章 Delftia tsuruhatensis NF4 的固定化及好氧反硝化功能研究
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 实验仪器
  •     4.1.2 试剂与耗材
  •     4.1.3 培养基
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 固定化菌的制备
  •     4.2.2 Delftia tsuruhatensis NF4 的脱氮功能测定
  •     4.2.3 温度对固定化Delftia tsuruhatensis NF4 的脱氮功能影响
  •     4.2.4 pH对固定化Delftia tsuruhatensis NF4 的脱氮功能影响
  •     4.2.5 硝态氮浓度对固定化Delftia tsuruhatensis NF4 的脱氮功能影响
  • 3--N，NO2--N 和 TN 测定方法'>    4.2.6 NO3--N，NO2--N 和 TN 测定方法
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 海藻酸钠固定化Delftia tsuruhatensis NF4 的结果
  •     4.3.2 Delftia tsuruhatensis NF4 的反硝化功能测定结果
  •     4.3.3 温度对固定化Delftia tsuruhatensis NF4 反硝化功能的影响
  •     4.3.4 pH值对固定化Delftia tsuruhatensis NF4 反硝化功能的影响
  •     4.3.5 初始硝态氮浓度对固定化DelftiatsuruhatensisNF4 反硝化功能的影响
  •   4.4 讨论
  •   4.5 本章小结
  • 第5章 Delftia tsuruhatensis NF4 硝酸盐还原酶nap基因克隆及原核表达
  •   5.1 实验材料
  •     5.1.1 实验菌株和质粒
  •     5.1.2 实验仪器
  •     5.1.3 实验试剂
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 Delftia tsuruhatensis NF4的nap基因的PCR扩增
  •     5.2.2 大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（+）-nap工程菌构建
  •     5.2.3 Delftia tsuruhatensis NF4 硝酸盐还原酶基因的原核重组表达
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 Delftia tsuruhatensis NF4的nap基因扩增结果
  •     5.3.2 pET28a（+）-nap重组质粒验证结果
  •     5.3.3 Delftia tsuruhatensis NF4的nap基因测序结果及蛋白质一级结构预测
  •     5.3.4 重组硝酸盐还原酶NAP的诱导表达
  •     5.3.5 Western Blot的结果
  •     5.3.6 工程菌的硝酸盐还原酶酶活测定
  •   5.4 讨论
  •     5.4.1 细菌硝酸盐还原酶的作用
  •     5.4.2 关于细菌周质硝酸盐还原酶（NAP）研究情况
  •     5.4.3 关于nap基因研究概述
  •   5.5 本章小结
  • 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间取得学术成果
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 邵林

    导师: 李璟,阴文奇

    关键词: 人工快渗系统,好氧反硝化,代尔夫特菌,硝酸盐还原酶,克隆,固定化

    来源: 成都理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

    单位: 成都理工大学

    分类号: Q78;X703;X172

    DOI: 10.26986/d.cnki.gcdlc.2019.000882

    总页数: 107

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