首页> 正文

冠突散囊菌中阿魏酸酯酶基因的发现、表达及酶学性质研究

2020-12-08阅读(801)

冠突散囊菌中阿魏酸酯酶基因的发现、表达及酶学性质研究

论文摘要

冠突散囊菌（Aspergillus cristatus）是散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌,是茯砖茶发酵过程中的优势菌种,也是形成茯砖茶独特品质的关键原因。研究表明,冠突散囊菌具有降脂减肥、抗氧化、调节免疫、抗肿瘤、抑菌等多种功效。由于微生物次级代谢产物复杂,且代谢产物的生成受生长环境等诸多因素的影响,冠突散囊菌代谢产物中发挥作用的有效成分目前并不完全清楚。为了更好地研究冠突散囊菌的功效成分,本课题组对冠突散囊菌进行了全基因组测序,系统进行了冠突散囊菌基因组功能的研究。阿魏酸（Ferulic acid）是一种普遍存在的酚酸类物质,具有清除自由基、预防血栓形成、降血脂、抗菌消炎及预防癌症的功效。在植物细胞壁中,阿魏酸与木聚糖、阿拉伯糖等半纤维素成分结合形成阿魏酸糖酯,无法发挥生物学活性。阿魏酸酯酶（Feruloyl esterase）是一种羧酸酯酶,可以水解植物细胞壁中阿魏酸酯键,释放出游离的阿魏酸。在对冠突散囊菌基因组分析过程中,我们发现基因组中存在一段基因序列,与已经报道的来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶有73%的相似性,且含有A型阿魏酸酯酶共有的GHSLG氨基酸序列,推测这很可能是一种新的A型阿魏酸酯酶编码基因,且该酶的功能发挥可能是茯砖茶和冠突散囊菌健康功效产生原因之一。因此,对该基因及酶的性质进行深入研究具有重要的意义。在本研究中,首先,我们利用基因预测软件Augustus和基因比对的方法,确定了该段基因序列由92 bp的内含子和846 bp的外显子组成,同时利用信号肽预测软件检测到该段基因编码的氨基酸序列包含一段由22个氨基酸构成的信号肽,由此推测该基因的完整功能编码序列为780 bp,共编码260个氨基酸。为了验证上述预测及深入研究该酶的特性,我们从冠突散囊菌基因组中扩增出完整的编码序列后,利用大肠杆菌表达系统对这段预测序列进行表达验证。首先我们构建了原核表达载体pET22b-Acfae,导入大肠杆菌后进行诱导表达。经检测,重组蛋白表达在包涵体中,采用透析复性的方法,我们获得了可溶的重组蛋白。采用分光光度法对重组酶进行了酶活检测,但没有检测到阿魏酸酯酶活性,可能原因是在复性过程中重组蛋白没有得到正确折叠。然后我们改用毕赤酵母表达系统对AcFAE进行了表达及验证。根据毕赤酵母的密码子偏好性、G+C百分比、密码子适应指数优化基因序列,然后构建表达载体pGAPZaA-Acfaeo,并电转化入毕赤酵母SMD1168H细胞中,筛选出阳性转化子后进行摇瓶发酵培养和高密度发酵培养,SDS-PAGE和阿魏酸酯酶酶活检测表明,重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且具有阿魏酸酯酶的活性,发酵液最高酶活为0.75 U/mL。利用镍柱分离纯化重组蛋白,并进行了酶学性质研究。结果发现,重组阿魏酸酯酶的最适反应温度为55℃;在40℃及以下有较好的稳定性,但在55℃放置1 h酶活基本消失;重组酶的最适反应pH为6.6,且在pH 5.0～8.0范围内具有良好的稳定性。本研究从冠突散囊菌基因组中发现了一种新的阿魏酸酯酶基因,通过序列的分析及优化实现了在毕赤酵母中的表达,并对其酶学性质进行了初步研究。这是首次关于冠突散囊菌中阿魏酸酯酶基因的报道,为茯砖茶和冠突散囊菌健康机制的研究提供了一种依据,也为该酶的工业化生产奠定了理论基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 绪论
  •   1.1 茯砖茶与冠突散囊菌
  •   1.2 阿魏酸
  •   1.3 阿魏酸酯酶概述
  •     1.3.1 阿魏酸酯酶的来源
  •     1.3.2 阿魏酸酯酶的分类
  •     1.3.3 阿魏酸酯酶的性质
  •     1.3.4 阿魏酸酯酶的活性检测
  •     1.3.5 阿魏酸酯酶的应用
  •     1.3.6 阿魏酸酯酶基因的克隆表达
  •   1.4 论文研究立题背景和内容
  • 第二章 冠突散囊菌中阿魏酸酯酶基因的发现
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 培养基
  •     2.1.2 主要仪器设备
  •     2.1.3 相关试剂
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 冠突散囊菌基因组提取
  •     2.2.2 冠突散囊菌基因组测序
  •     2.2.3 阿魏酸酯酶基因的发现和分析
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 冠突散囊菌基因组的提取
  •     2.3.2 冠突散囊菌基因组测序
  •     2.3.3 阿魏酸酯酶基因的发现和分析
  •   2.4 本章小结
  • 第三章 阿魏酸酯酶基因在大肠杆菌中的表达
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌种和质粒
  •     3.1.2 主要仪器设备
  •     3.1.3 相关试剂
  •     3.1.4 培养基及溶液的配制
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 pET22b-Acfae表达载体构建
  •     3.2.2 AcFAE在大肠杆菌中的表达
  •     3.2.3 AcFae的活性检测
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 pET22b-Acfae表达载体构建
  •     3.3.2 AcFAE的诱导表达
  •     3.3.3 AcFAE的酶活测定
  •   3.4 本章小结
  • 第四章 阿魏酸酯酶基因在毕赤酵母中的表达
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌种和质粒
  •     4.1.2 主要仪器设备
  •     4.1.3 相关试剂
  •     4.1.4 培养基及溶液的配制
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 毕赤酵母表达载体构建
  •     4.2.2 AcFAE在毕赤酵母中的表达
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 Acfae的优化
  •     4.3.2 pGAPZαA-Acfaeo的构建
  •     4.3.3 重组毕赤酵母的构建与验证
  •     4.3.4 重组毕赤酵母的摇瓶发酵培养
  •     4.3.5 重组毕赤酵母的高密度发酵培养
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 重组阿魏酸酯酶的纯化及酶学性质研究
  •   5.1 实验材料
  •     5.1.1 材料
  •     5.1.2 主要仪器设备
  •     5.1.3 相关试剂
  •     5.1.4 溶液配制
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 AcFAE的纯化
  •     5.2.2 AcFAE酶学性质研究
  •   5.3 实验结果
  •     5.3.1 AcFAE的纯化
  •   5.4 本章小结
  • 总结与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间研究成果
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张芳芳

    导师: 朱希强

    关键词: 冠突散囊菌,阿魏酸酯酶,克隆表达,酶学性质

    来源: 山东大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 山东大学

    分类号: Q936;Q933

    总页数: 92

    文件大小: 4762K

    下载量: 136

    相关论文文献

    • [1].微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸研究概述[J]. 食品研究与开发 2019(01)
    • [2].来源于曲菌的阿魏酸酯酶的多样性及其应用[J]. 中国酿造 2015(05)
    • [3].阿魏酸酯酶的微生物合成及其应用进展[J]. 湖北科技学院学报(医学版) 2019(03)
    • [4].嗜热细菌Clostridium thermocellum阿魏酸酯酶基因的克隆、异源表达及酶学特性分析[J]. 微生物学通报 2017(06)
    • [5].黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表达及快速酶活检测体系的建立[J]. 应用与环境生物学报 2009(02)
    • [6].阿魏酸酯酶A的基因克隆与表达及其水解产物的纯化[J]. 生物工程学报 2014(03)
    • [7].产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其产酶条件优化[J]. 食品科技 2019(10)
    • [8].产阿魏酸酯酶的枝状枝孢霉筛选、发酵特性及在黄酒中应用研究[J]. 食品与生物技术学报 2018(08)
    • [9].宇佐美曲霉阿魏酸酯酶A基因的克隆表达及酶学性质研究[J]. 食品与生物技术学报 2013(07)
    • [10].约氏乳酸杆菌中一种新的阿魏酸酯酶基因的克隆表达与性质研究[J]. 食品与生物技术学报 2018(11)
    • [11].阿魏酸酯酶酶化发酵饲料饲喂三元猪的影响[J]. 食品与生物技术学报 2018(05)
    • [12].1株海洋来源产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其对木质纤维材料的降解能力[J]. 江苏农业科学 2017(20)
    • [13].热纤梭菌嗜热阿魏酸酯酶在拟南芥中的异源表达[J]. 农业生物技术学报 2019(10)
    • [14].深绿木霉嗜酸性阿魏酸酯酶酶学性质及生物质转化分析[J]. 食品科学 2019(10)
    • [15].阿魏酸酯酶对麦汁过滤性能的影响[J]. 食品与发酵工业 2017(11)
    • [16].基于foldon介导的寡聚化以提高阿魏酸酯酶催化效率[J]. 生物工程学报 2019(05)
    • [17].阿魏酸酯酶对晒青毛茶发酵过程的影响[J]. 食品与发酵工业 2019(14)
    • [18].嗜热子囊菌JCM12803来源的阿魏酸酯酶FAE-2515酶学性质研究[J]. 中国农业科技导报 2018(09)
    • [19].阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达[J]. 食品工业科技 2014(20)
    • [20].青贮饲料中阿魏酸酯酶乳酸菌的筛选及鉴定[J]. 草学 2018(S1)
    • [21].阿魏酸酯酶酶化发酵饲料制备及其对肉鸡养分利用率的影响[J]. 华侨大学学报(自然科学版) 2014(06)
    • [22].产阿魏酸酯酶乳酸菌的乳杆菌筛选以及基因克隆[J]. 食品工业科技 2013(20)
    • [23].阿魏酸酯酶产生菌的培养条件优化[J]. 华侨大学学报(自然科学版) 2010(04)
    • [24].低浓度的酸碱及双酶解预处理对麦糟发酵乙醇的影响[J]. 高校化学工程学报 2013(04)
    • [25].阿魏酸酯酶和木聚糖酶协同降解麦糟[J]. 化工进展 2012(05)
    • [26].微生物阿魏酸酯酶的研究进展[J]. 中国酿造 2008(10)
    • [27].黑曲霉固态发酵产阿魏酸酯酶及酶解麸皮制备阿魏酸[J]. 林业工程学报 2016(05)
    • [28].结构预测及分子对接方法研究几种水解产物对新阿魏酸酯酶的抑制作用[J]. 高等学校化学学报 2012(08)
    • [29].阿魏酸酯酶与纤维素酶协同水解麦麸释放阿魏酸的研究[J]. 食品与生物技术学报 2015(04)
    • [30].产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其酚酸释放研究[J]. 现代食品科技 2015(07)

    标签：;  ;  ;  ;  

    冠突散囊菌中阿魏酸酯酶基因的发现、表达及酶学性质研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6