赵晶[1]2004年在《蛋白质结构与功能研究方法探讨》文中进行了进一步梳理蛋白质结构与功能预测是后基因组时代的一项重要任务，本文围绕该问题做了一些研究工作，主要结果如下： 1．蛋白质结构预测模型的目标函数通常采用基于物理理论的经验势函数或基于统计理论的平均势能函数。本文分析了Cornell大学Baker化学实验室给出的联合残基力场，建立了九个预测模型，它们分别包含不同的能量项，以便分析各能量项对于蛋白质结构预测结果的影响。 2．针对蛋白质结构预测模型中目标函数多变量、多极值的特点，采用模拟退火算法对蛋白质进行结构预测，并对算法进行了改进，数值试验表明该算法具有较好的收敛性，并且对于大规模的连续函数全局优化问题能够得到很好的结果；本文计算了脑啡肽的九个预测模型，说明了各能量项在结构预测中的作用。 3．Lennard-Jones簇问题(简记为L-J)是物理系统中一个非常简单，合理的数学模型。该模型的全局极小可以用来理解复杂的分子构象问题，并且在蛋白质折迭的势能模型中，它都是很重要的一个部分，所以L-J问题的解决有助于蛋白质结构预测的研究。本文根据L-J函数的特点，在模拟退火算法中加入了局部极小化的过程，从而提高了计算的速度和成功率。同时对该算法的收敛性进行了分析，得到了在温度趋于0时，算法产生的序列以概率1收敛到全局极小点的结论。 4．蛋白质功能预测也是后基因组时代要解决的一个重要问题，虽然蛋白质功能预测的研究起步比较晚，但是也取得了一定的成果，本文对于蛋白质功能研究的现状做了一个简要的综述。
张珍勇[2]2007年在《油菜突变体Cr3529中一个与黄化相关的未知基因的克隆及表达载体的构建》文中研究表明本研究应用RT-PCR方法克隆得到Cr3529差异表达基因BnCr4的编码区cDNA序列。扩增并克隆到2个存在序列差异的同源cDNA全序列，分别命名为BnCr4-1和BnCr4-2。测序结果显示，BnCr4-1编码区序列长1311bp，编码437个氨基酸，蛋白质分子大小约49ⅡKD；BnCr4-2编码区序列大小为1389 bp，编码463个氨基酸，蛋白质分子量大小约为52.7kD。BnCr4、BnCr4-1和BnCr4-2的BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87％、80％和85％。对它们的二级结构和叁级结构进行了预测。结果显示3个蛋白的N端约110aa以无规则卷曲和B-转角为主，定位于膜外侧；中段约240aa含有丰富的二级结构，构成球状的高级结构域，位于膜的内侧；C端约100aa以a-螺旋为主，位于膜外侧。这3个蛋白质都含有2个跨膜结构域。BnCr4蛋白的跨膜结构域位于256-284aa和414-437aa，BnCr4-1蛋白的跨膜结构域位于261-278aa和415-432aa，BnCr4-2蛋白的跨膜结构域位于262-279aa和417-435aa。功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点，如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点，可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白。根据原核表达载体pET-32a(+)的酶切位点及获得的BnCr4的cDNA编码区全序列设计引物，将这个基因的通读框重组到原核表达载体pET-32a(+)中。构建重组表达载体pET-32a(+)-BnCr4，将其转入宿主菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导表达，对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析，结果表明得到了与预计分子量相同的融合蛋白。根据植物表达载体pFGC5941的酶切位点，设计引物，上游引物含BamHI位点，下游引物含XbaI位点，以pMD18-BnCr4质粒为模板，扩增出一段长度为582bp片段。构建重组质粒pFGC9541-BnCr401并将其转入根癌农杆菌EHA105中，用转化的EHA105浸染油菜外植体，进行了油菜初步的遗传转化研究。
王建平[3]2006年在《蛋白质分形结构及功能研究》文中研究表明蛋白质是生命体的基本组成物质,蛋白质的结构决定其生物功能。为了充分认识蛋白质的生物功能,就必须对蛋白质的结构作进一步的研究。目前,肽链折迭成蛋白质结构层次的机制尚未认识清楚;而在蛋白质结构预测中,蛋白质二级结构预测是一个很值得研究的问题,它是氨基酸一级序列和叁级结构之间的桥梁,二级结构预测为叁级结构模型的构建建立了起始点。在过去的二十几年中,尽管科学家们已经提出了几十种预测蛋白质二级结构的方法,进展仍然十分缓慢。如果只利用单一序列的信息,迄今为止,预测成功率只有76%左右,这预测的精度远远不能满足正确推断蛋白质分子叁维空间结构及功能的要求。本文的研究分叁部分:一是考虑分形维数与蛋白质结构层次的关系,在最大流原理的基础之上,对肽链折迭成蛋白质空间结构的机制进行了数理推导,为研究蛋白质的生物功能和揭示生命的起源提供参考。不同的分形维数体现不同的拓扑结构,而分形维数又受环境影响因子a的影响,因此提出了环境影响因子a可以作为区分蛋白质结构的一个标准。二是蛋白质结构之间存在自相似性,将自相似性很强的自组织映射(SOM)网络用于蛋白质二级结构预测,其结果将二级结构预测精度提高了叁个百分点,这将对蛋白质结构预测起到推动作用。叁是蛋白质的空间结构决定了其生物学功能,而蛋白质的空间结构又受分形维数和环境影响因子a的制约,因此在预测蛋白质的生物功能时,从分形维数和环境影响因素两个方面,以生物进化的观点对其进行了阐述,这将对蛋白质分子病发机制的理解和药物分子设计起指导意义,以使蛋白质的生物功能朝着人类需求的方向发展。
张华[4]2009年在《蛋白质残基深度、柔性和功能的预测与分析》文中进行了进一步梳理了解蛋白质的空间结构、功能、动力学以及解析它们之间的关系对生物学研究来讲非常的重要。蛋白质序列数据库的数据积累速度非常快,而实验测定的已知结构蛋白质的数目相对比较少。蛋白质数量和已测定结构之间的差距正在加大。为不依赖于实验技术而可以获得高通量的结构分析,依据序列决定结构的原理,从序列出发预测结构可以弥补这个差距,然而目前叁级结构的预测仍然是个极具挑战性的问题。有不少研究者采取中间步策略,就是先预测结构的低维数据(如残基深度、溶剂可及性、二级结构、接触图等),然后用这些预测得到精度较高的低维数据去预测叁级结构,以期达到更高精度的叁级结构预测。虽说一级序列决定叁级结构,但在不同的环境下蛋白质结构是可变的。事实上,蛋白质分子中的原子始终处于不停的热涨落,使蛋白质在不同区域具有不同程度的柔性,以适应实现其多样的功能。研究蛋白质的柔性或动力学有实验手段如X衍射结晶学和多维核磁共振技术,也出现了大量的计算方法,如分子动力学模拟、正则模分析、弹性网络模型、加权接触数以及基于机器学习的预测方法,它们都存在各自的优缺点。发展新方法可以使得人们从不同的视角去分析和理解蛋白质的柔性和动力学,在功能分析上提供更全面的信息。本文的工作主要由叁部分构成:1.以预测结构的一维描述量-残基深度为目标,提出了一种新的预测优化方法。运用支持向量回归方法(SVR),将PSI-BLAST生成的位置特异性打分矩阵、蛋白质大小、预测的二级结构信息以及残基的位置信息作为输入特征,并通过精细设计,运用特征选择方法和细致的SVR参数优化,获得了与当前存在的另一个算法相比更高的预测精度。其中,预测的相关系数与平均绝对误差分别为0.67与0.56(?)。另外,本研究还首次对当前存在的定义不同的残基深度指标进行了预测,并作了详细的分析比较,可供其它蛋白质结构预测者参考与选择。2.为更好的理解蛋白质的功能,分析研究蛋白质的柔性显得越来越重要。本文在不同层次上详细地分析了由B因子度量的蛋白质柔性与溶剂可及性之间的关系,其中这些层次包括氨基酸、二级结构类型、叁肽的暴露模式以及局部序列窗口。发现的结论有:1)氨基酸的柔性-暴露相关指标与反映折迭稳定性的平均贡献的稳定性指标有很强的相关性;2)两个相邻残基处在内部的表面中心残基相比于两个相邻残基处在表面的内部中心残基具有更低的平均B′-因子;3)利用线性回归模型可得,使用局部溶剂可及性信息能够显着地提升它和B′-因子之间的关系。另外也对比了溶剂可及性和柔性之间的关系与基于距离/体积的残基深度和柔性之间的关系。当仅仅考虑单个残基,基于体积的深度与柔性具有最强的相关性。但是当包含入局部信息时,局部溶剂可及性的相关性显着地增长,最终超过了深度与B′-因子之间的相关性。进一步,发现利用基于序列B′-因子预测,从序列出发预测而得的RSA值可以用来识别无序和有序区域。结果表明,从局部溶剂可及性出发预测的B因子即可以用来识别柔性和刚性区域,也可以用来发现无序区域。相比于其它存在的预测柔性的方法,基于局部真实RSA和局部预测RSA开发出来的预测模型在B′-因子预测或无序/有序残基识别上都具有相似或更好的结果,这些结果在叁个较大的标准数据集和叁个案例得到了充分的验证。而且,提出的线性回归模型能够在分析结构-柔性关系和序列-柔性关系上提供非常有意义的解释,并且两者都能应用到结构/序列-柔性-功能关系探索。3.任何叁级结构的低维描述量总是不能够抓住蛋白质的完整结构信息的,因此,提出新的指标将有助于蛋白质结构的研究和分析。基于文献[138]中提出的一种称为残基的Gamma半径,利用Delaunay剖分和动态规划算法给出了Gamma半径的有效计算算法。此度量将有助于研究蛋白质的功能“口袋”,可用来描述配体的结合位点。
王东根[5]2003年在《关于我国人类肝脏蛋白质组研究策略探讨》文中指出随着人类基因组计划的逐步完成，人类蛋白质组研究已经成为21世纪生命科学领域的主要任务和焦点之一。国际人类蛋白质组组织于2001年成立，提出“人类蛋白质组计划”，2002年，该组织正式宣布启动由中国领导的“国际人类肝脏蛋白质组计划”。为了发挥我国在该计划中的主导作用，全面保障计划的启动与实施，同时推动我国人类蛋白质组研究发展，国家科技部拟制定“中国人类肝脏蛋白质组研究计划”，以推动我国人类蛋白质组研究发展。本项研究以文献调研和专家咨询为主，较为系统地概述了蛋白质组研究现状和发展趋势，总结了我国人类肝脏相关蛋白质组研究工作的现状和存在问题，提出了我国人类肝脏蛋白质组研究任务体系和技术体系。运用软科学研究手段，通过专家个人评分和专家综合评议等方法，定性与定量相结合，分析了我国人类肝脏蛋白质组计划优先发展领域和关键技术，并提出了发展策略。 上述研究，为科学制定“中国人类肝脏蛋白质组计划”提出了依据和参考，同时也为同类研究工作提供了借鉴。
王影[6]2008年在《Asp60对肌红蛋白结构和功能的影响》文中指出为了进一步了解肌红蛋白Mb表面第60位天冬氨酸对肌红蛋白结构和功能以及与Cu~(2+)相互作用的影响,本论文以含有编码马心肌红蛋白双突变位点(第44位和60位天冬氨酸突变为赖氨酸)基因的表达质粒pGYM为模板,设计特异性突变引物,通过PCR定点突变的方法将第44位的碱性氨基酸赖氨酸(K)密码子突变成酸性氨基酸天冬氨酸(D)密码子,获得肌红蛋白突变体D60K的基因。将带有突变体的目的基因克隆连接到表达质粒pGYM上,经热激转化大肠杆菌BL21,大肠杆菌培养使突变蛋白D60K大量表达,收集菌体,酶法裂解细菌,并依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化突变蛋白,其纯度可达96%。用圆二色谱和紫外-可见吸收光谱法分别研究野生型肌红蛋白Mb(WT)及突变体(D60K)的耐热、耐酸及耐盐酸胍诱导的变性过程,结果表明:用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp60,降低了肌红蛋白的耐热能力,导致其热变性中点温度Tm由68.1℃降低到66.4℃;提高了肌红蛋白的耐酸变性和耐盐酸胍变性能力,导致其变性中点(pH)_(1/2)从4.32降到4.19、盐酸胍变性中点浓度Cm从1.95mM提高2.10mM。在研究突变位点对肌红蛋白与Cu~(2+)相互作用的影响时,综合运用了紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱以及圆二色光谱。紫外-可见吸收光谱研究表明:Cu~(2+)使Mb(D60K)的紫外吸收增强,峰位蓝移,疏水基团之间的作用力减弱;荧光光谱研究表明:Cu~(2+)与Mb(D60K)相互作用时形成1:1的复合物且其猝灭机制属于静态猝灭,并由Van't Hoff方程计算的ΔH、ΔS判断出二者之间的作用力主要表现为静电力,另外依据F(o|¨)rster非辐射能量转移理论计算出给体-受体间的结合距离为2.48 nm;同步荧光光谱研究表明,Cu~(2+)使Mb(D60K)色氨酸残基的疏水性下降;CD光谱研究表明:加入Cu~(2+)后,蛋白α-螺旋含量降低。以愈创木酚为底物分别测定了不同条件下Mb(WT)和Mb(D60K)的过氧化物酶活性,结果表明:Mb(D60K)的Km为2.19mM而Mb(WT)的Km为1.26mM。Mb(WT)和Mb(D60K)作为过氧化物酶的最适反应温度均为60℃左右,在相同温度下,Mb(D60K)的过氧化物酶活性低于Mb(WT),且其作为过氧化物酶的热稳定性低于Mb(WT)。此外,两者作为过氧化物酶的最适反应pH均在5.5左右。
郭宇[7]2012年在《克里米亚—刚果出血热病毒核蛋白的结构与功能研究》文中指出克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF)，是一类在亚洲、中东、欧洲南部、非洲等地区的丘陵及平原地区广泛流行的蜱传疾病，曾经在全球的30余个国家多次爆发并引起致死案例。该病在我国又称新疆出血热(XHF)，主要分布于我国西北地区，是我国重要的虫媒疾病之一。该病的致病病原体为克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)，分类学上属于负链RNA病毒布尼亚病毒科(Bunyaviridae)内罗病毒属(Nairovirus)。其主要的传播媒介与贮藏宿主为蜱，在经携带该病毒的蜱虫叮咬之后，可出现高热、出血、肾损伤、心血管衰竭等症状，平均致死率约为30%。由于CCHF具有迅速传播、高致死率、暂无有效治疗性药物的特点，并且CCHFV被认为是可被恐怖分子改造为生物武器的一类病原体，因此该病毒被列入最高生物安全等级-第四级(BSL-4)的防护级别而受到严格管控。目前，对于CCHFV的基础研究，尤其对病毒基因组的组装模型、转录复制机制的了解较为有限。核蛋白(Nucleoprotein, NP)负责与病毒基因组RNA结合，形成核蛋白-核酸复合体(Ribonucleoprotein,RNP)，保护基因组不受宿主细胞的降解，核蛋白还能与转录复制相关蛋白结合，起始转录过程。病毒基因组RNA与核蛋白的正确组装对于CCHFV的装配与成熟具有关键的作用。因此，针对CCHFV核蛋白的叁维结构解析工作，无疑将为阐述该病毒的基因组装机制、转录复制模型提供直观、精确的结构生物学证据。本论文通过以蛋白质晶体学为主要技术手段的结构生物学研究方法，解析了克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白的叁维结构，发现其与其它负链RNA病毒核蛋白相比具有独特的自身特征。CCHFV NP整体结构全部由á螺旋组成，在整体叁维结构上明显分为头部与杆部两个独立的结构域，从蛋白质表面电势来看，CCHFVNP蛋白具有若干正电荷区域，意外的是，在体外条件下，CCHFVNP表现出与核酸较弱的亲合能力。在结构生物学的研究基础之上，本论文还对克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白的功能特征进行了深入探讨，主要研究了CCHFV NP的体外聚合状态、与RNA的结合能力、与mRNA帽子类似物的结合能力、与宿主防御机制相关蛋白的相互作用、DNA特异性的核酸内切酶活性等方面。结果表明CCHFV NP具有与其它负链RNA病毒核蛋白不尽相同的功能特征。本论文的工作，有助于深入了解克里米亚-刚果出血热病毒的基因组装机制，为该病毒的转录复制机器的研究提供了直接的结构生物学证据，同时也为针对克里米亚-刚果出血热病毒诊断治疗手段的设计与开发提供了全新的靶点。
许小青[8]2016年在《化学小分子诱导的蛋白质活性中心周围微环境的变化》文中研究说明蛋白质是生命的物质基础,一切生命活动离不开蛋白质。蛋白质在生命体内的活性和功能取决于其结构和空间构象。由于蛋白质的空间结构主要依靠氢键、范德华力、静电力等非共价作用的共同平衡而维持,但这些作用力较弱且易受温度、酸碱度、压力、离子强度、外源性分子作用等因素影响而发生改变,导致蛋白质构象和功能发生改变,甚至导致某些疾病的产生。与蛋白质结合的某些化学小分子,包括药物分子对蛋白质维持结构和功能的稳定性具有极其重要的作用。因此,研究化学小分子与蛋白质相互作用机理和规律,有助于深入了解蛋白质构象与功能的关系,解释外源性分子在生物体内的结合、运输过程,也有助于在分子水平上解释某些疾病的致病机制,为某些复杂疾病的基础研究和防治等提供重要的理论指导。本论文研究了化学小分子与蛋白质的相互作用机理,及作用后蛋白质活性中心周围微环境的变化。以葡萄糖氧化酶、人血清白蛋白和肌红蛋白为蛋白质分子模型,利用电化学方法、多种光谱法如：紫外可见吸收光谱法、荧光光谱法(包括荧光淬灭法、同步荧光光谱法、荧光共振能量转移法、时间分辨荧光光谱法)、红外光谱法、圆二色谱法,以及分子模拟计算等,研究了溶液中有机小分子(以硫酸胍为例)、抗肿瘤药物小分子(以5-氟尿嘧啶为例)、光敏剂(以酞菁锌衍生物为例)和不同pH条件分别对以上蛋白质进行诱导后蛋白质发生的结构变化机理,及诱导后蛋白质活性中心周围微环境的变化。本论文的主要内容及结果如下：1.研究了有机小分子(以Gdm+为代表)诱导蛋白质(以葡萄糖氧化酶(GOx)为模型)结构及其活性中心周围微环境变化的机制。利用电化学方法,研究了不同浓度Gdm+诱导后对GOx的电催化活性与其构象的关系。结合紫外-可见吸收光谱法、红外光谱法、圆二色谱法及分子模拟计算等方法深入研究了Gdm+诱导的GOx结构与其催化性能的关系。结果表明,Gdm+与GOx作用时能进入其疏水腔使GOx发生去折迭过程,GOx的a-螺旋结构含量减少,户折迭结构含量增加；分子模拟研究发现Gdm+与GOx的氧化还原活性中心FAD作用,使FAD分子本身的电子性质、与周围氨基酸残基的氢键等发生了明显改变,这是导致GOx的二级、叁级结构变化的决定性因素,也进一步使GOx对葡萄糖的催化氧化活性明显降低。2.研究了抗肿瘤药物小分子(以5-氟尿嘧啶(FU)为代表)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机理及FU-HSA结合位点微环境的变化。研究结果表明,FU分子能够进入HSA分子中Trp 214残基附近的ⅡA域,并与Trp 214和Lys 199残基形成氢键,从而导致Trp 214残基发生了静态荧光淬灭。分子对接和热力学参数分析的结果表明,HSA与FU的结合主要由范德华力和氢键驱动形成了FU-HSA复合物,从而导致蛋白质微环境比天然结构更加疏水。此外,HSA与低浓度(<150 μmol/L)时的FU作用使α-螺旋结构含量增加,而与高浓度(>150 μmol/L)的FU作用时则使α-螺旋结构含量减少,这可能是由于蛋白质在此作用过程中发生了一定程度的扭转导致。3.研究了光敏剂(以酞菁锌衍生物(ZnPcs:ZnPc1、ZnPc2、ZnPc3)为代表)人血清白蛋白(HSA)的相互作用及ⅡA域微环境变化的机制。研究结果表明,叁种ZnPcs衍生物都进入了HSA分子中Trp 214残基附近的ⅡA域内,且分别与HSA形成了ZnPcs衍生物-HSA复合物,使Trp214周围环境更亲水；作用过程中Trp214残基发生了静态荧光淬灭,并伴随一定程度的动态淬灭过程；HSA与叁种ZnPcs衍生物的结合主要通过静电引力和疏水作用力形成了ZnPcs衍生物-HSA复合物,此外,与ZnPcl和ZnPc2相比,由于ZnPc3静电势较高,ZnPc3衍生物与HSA作用后使HSA的静电荷分布变化最大,且ZnPc3使Trp214周围残基氢键的变化也最大,说明ZnPcs叁种衍生物中,ZnPc3与HSA的作用最强。4.研究了不同pH环境诱导下肌红蛋白(Mb)结构及血红素周围微环境变化的机理,建立了一种检测溶液中含血红素蛋白结构及其血红素周围微环境变化的简单方法。基于循环伏安法测量Mb在不同pH缓冲溶液中的电子转移信号能够灵敏地反映出Mb分子的活性中心血红素基团周围结构的微妙变化。在酸性和碱性溶液中,由于血红素中Fe-His 93配位键断裂,血红素基团从Mb的疏水腔中分离而暴露于溶剂中,使Mb在溶液中的电子转移信号增强。结合紫外可见光谱法、拉曼光谱法、CD光谱法和分子模拟计算研究了不同pH条件下Mb结构和活性中心血红素基团周围微环境的变化,结论与电化学方法研究结论一致,说明电化学方法可用于检测氧化还原蛋白Mb在溶液中的结构变化,与其他方法相比,电化学方法具有反应灵敏、操作简便、成本低廉等优点,并且该方法可以反映溶液中蛋白质结构变化的动力学过程。
马素[9]2013年在《海洋细菌Cellulophaga sp.QY3ι-卡拉胶酶的研究》文中进行了进一步梳理卡拉胶酶是一类能够专一性降解卡拉胶分子中β-1,4糖苷键的糖水解酶，根据其降解底物的不同主要分为κ-、ι-和λ-卡拉胶酶。根据序列和结构的特征，ι-卡拉胶酶被归属为糖水解酶82家族（GH82），目前已经发现了九种ι-卡拉胶酶，但只有四种进行了部分的性质研究。关于该家族酶的结构与功能研究目前还处于起步阶段，只有和催化相关的部分氨基酸残基有所报道。因此新ι-卡拉胶酶的发现和深入研究不仅可以丰富GH82家族ι-卡拉胶酶资源，而且对GH82家族酶的结构与功能阐释有重要意义。来自Cellulophaga sp. QY3的ι-卡拉胶酶CgiA的研究工作是在本实验室前期工作的基础上继续进行的。首先研究了CgiA降解不同类型底物的降解方式。CgiA降解非胶态底物时表现为随机内切酶的特点，而降解胶态底物时采用持续性降解的方式，在GH82家族的ι-卡拉胶酶中属于首次报道。其次，利用同源模建的方法获得了CgiA的叁维结构。结合荧光辅助碳水化合物电泳分析表明，CgiA降解ι-卡拉胶的终产物为新ι-卡拉四糖和新ι-卡拉二糖，最小降解底物为新ι-卡拉六糖。该酶的催化腔大小为八（-4~+4）六糖在催化腔中占据-4~+2位点。利用序列标识图（sequence logo）的方式展示出GH82家族催化腔中与底物相距6以内的氨基酸残基。从GH82家族催化腔的保守分析可以明显看出催化腔-1和+1位点处的残基保守性高于其他位点。根据氨基酸残基的保守性及残基在结构中的空间位置，我们选择了六个位点(G228，Y229，R254，R314，K335和K480)进行突变实验。通过GH82家族多个底物结合位点的突变及性质比较，验证了功能残基的保守性与其重要性是正相关的。根据突变前后酶活力变化，米氏常数变化及高级结构分析，证明了催化腔-1，+1位点处G228, Y229，R254和R314是该酶与底物结合相关的残基。其中G228, Y229和R254在GH82家族中完全保守，因此推测它们为该家族最重要的与底物结合相关的残基。GH82家族最重要的两个底物结合残基（Y229和R254）是与底物的硫酸根直接作用的，推测这是该家族酶专一性降解ι-卡拉胶的关键。这是首次对GH82家族ι-卡拉胶酶的底物结合残基的研究，进一步阐释了该家族的底物专一性机制。接下来，利用简并PCR和Sitefinding PCR成功从Cellulophaga sp. QY3中克隆得到了一种新的ι-卡拉胶酶CgiB的编码序列。该基因含有一段长度为1383bp的ORF编码框，编码得到461aa的蛋白序列。CgiB归属于GH82家族，除了一个未进行表达和研究的序列，与其相似度最高的蛋白序列是来自Zobellia galactanovora DsiJT的CgiA2，相似度仅为32%。对重组酶CgiB的性质研究表明：该酶的最适反应条件为45℃、pH6.5磷酸盐缓冲液；在低于40℃条件下存放1h该酶还能保留70%的活性；在pH6.0-9.6的缓冲体系中存放较稳定；Na+和K+对酶活力有促进作用，CuCl2, SDS和EDTA都非常显着的抑制了酶活性，而一些二价金属离子，如Mg2+, Fe2+及Mn2+对酶活力有明显的促进。利用凝胶色谱分析酶解产物随时间的变化可知该酶是一种典型的内切酶，降解主产物四糖在终产物中约占80%。利用二级质谱技术鉴定出酶解主产物为新ι-卡拉四糖，表明该酶通过断裂卡拉胶分子中的β-1,4糖苷键实现对ι-卡拉胶的降解。CgiB具有与已报道的ι-卡拉胶酶不同的性质特点，不仅丰富了ι-卡拉胶酶的资源，而且对卡拉寡糖的制备和纯化具有重要意义。
王怡[10]2013年在《数据挖掘技术在蛋白质结构与功能预测中的应用》文中提出随着人类基因组计划的完成,以及现代生物科技的飞速发展,海量的生物序列数据不断地涌现。如何将这些数据转变为知识成为了生物信息学的研究热点。虽然可以通过传统的实验方法确定蛋白质的结构和功能,但是要耗费大量的人力和物力,并且蛋白质序列信息的积累速度远快于蛋白质结构数据的增长速度。因此,直接从蛋白质序列信息出发,发展有效的方法预测蛋白质的结构和功能具有十分重要的理论和实际意义。本文在大量蛋白质数据的基础上,将概率神经网络、序列比对方法、混沌蜂群算法以及多分类器融合等数据挖掘的方法应用于生物信息的处理。我们对蛋白质结构和功能预测中的几个分支问题进行了研究,提出了一些新的方法,其主要内容如下：1.建立了基于混沌蜂群算法的蛋白质叁维结构预测方法。在AB非格模型的基础上,将混沌优化的思想引入基本人工蜂群算法,当某个解陷入局部最优时,利用混沌变量的随机性和遍历性使其跳出局部最优解。混沌蜂群算法不仅结合了人工蜂群算法全局搜索和局部搜索的能力,而且利用混沌搜索避免早熟收敛、陷入局部最优解等问题,从而实现全局优化。在目前广泛使用的斐波纳契序列上进行实验,结果表明该算法比其他算法具有更好的性能和精度。2.提出了基于数据划分和集成的方法预测信号肽。由于信号肽序列长度不等且氨基酸组成具有多样性的特点,以往方法通常采用滑动窗口进行处理,从而导致了信息丢失以及数据不平衡等问题。为改善少数类预测效果,对训练数据进行了预处理,将多数类样本数据划分,生成的各组样本分别与少数类样本合并组成若干个数据子集,在两种蛋白质编码方案下采用概率神经网络建立多个分类器,最后采用加权投票将多分类器集成的方法预测信号肽。在目前广泛使用的Neilsen数据集上进行实验,表明该方法具有一定的有效性。3.提出一种局部序列匹配相似度预测信号肽的方法。考虑到信号肽是蛋白质序列局部片段所体现的生物特性,我们将局部序列比对的方法有效地运用到信号肽预测问题中。首先采用了氨基酸相对疏水特性来编码蛋白质,然后搜索蛋白质序列间的局部匹配子序列,并根据计分矩阵BLOSUM62来度量两个序列问的相似性,最后采用k最近邻算法来预测信号肽。在目前广泛使用的SwissProt数据集上进行实验,表明该方法具有较好的预测准确率。
参考文献：
[1]. 蛋白质结构与功能研究方法探讨[D]. 赵晶. 大连理工大学. 2004
[2]. 油菜突变体Cr3529中一个与黄化相关的未知基因的克隆及表达载体的构建[D]. 张珍勇. 四川大学. 2007
[3]. 蛋白质分形结构及功能研究[D]. 王建平. 天津大学. 2006
[4]. 蛋白质残基深度、柔性和功能的预测与分析[D]. 张华. 南开大学. 2009
[5]. 关于我国人类肝脏蛋白质组研究策略探讨[D]. 王东根. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[6]. Asp60对肌红蛋白结构和功能的影响[D]. 王影. 大连理工大学. 2008
[7]. 克里米亚—刚果出血热病毒核蛋白的结构与功能研究[D]. 郭宇. 南开大学. 2012
[8]. 化学小分子诱导的蛋白质活性中心周围微环境的变化[D]. 许小青. 南京师范大学. 2016
[9]. 海洋细菌Cellulophaga sp.QY3ι-卡拉胶酶的研究[D]. 马素. 中国海洋大学. 2013
[10]. 数据挖掘技术在蛋白质结构与功能预测中的应用[D]. 王怡. 福建师范大学. 2013