黑龙江省农垦总局总医院150088
摘要：目的：通过对现有的免疫组织化学双重标记方法(双标)的改进，探索一种稳定且易于辨认的显色方法，便于在普通光学显微镜下观察肺腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况。方法：改进的免疫组织化学双标染色分别使用二抗链接的碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶作为底物显色酶，底物分别选用固红(AP-Red)和二氨基联苯胺(DAB)，在显微镜下次序控制双标显色，观察肺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的分布情况。结果：免疫组织化学双重标记中第一标记AP-Red的红色与第二标记DAB的棕黄色反差大，背景低，易于分辨。两种颜色标记的同一部位呈现砖红色，易于表示双标部位。统计显示在肺腺癌组织标本中，以M2型肿瘤相关巨噬细胞为主，约占80%。结论：改进后的显色系统建立了简便、可靠的免疫组织化学双重标记新方法。标记结果可以清晰稳定显示肿瘤相关巨噬细胞在肺腺癌组织中分布情况，便于进一步研究其在肺癌发生、发展中的作用。
关键词：肺腺癌肿瘤；巨噬细胞；化学双标染色
Optimizationofimmunohistochemicaldouble-labelingmethodfortumor-associatedmacrophagesoflungadenocarcinoma
OBJECTIVE:Toexploreastableandeasilyidentifiablemethodofcolordevelopmentbyimprovingtheexistingimmunohistochemicaldoublelabelingmethod(doublestandard),whichisconvenientforobservingtumor-associatedmacrophagesinlungadenocarcinomatissuesunderordinarylightmicroscope.Thedistributionofcells.METHODS:Theimprovedimmunohistochemicaldouble-labelingwasperformedusingthesecondaryantibody-linkedalkalinephosphataseandhorseradishperoxidaseassubstratechromogenicenzymes.Thesubstrateswerefixedred(AP-Red)anddiaminobenzidine,respectively.(DAB),sequentialcontrolofdouble-labelcolordevelopmentundermicroscope,observationofthedistributionoftumor-associatedmacrophagesinlungcancertissues.RESULTS:Thered-yellowcontrastbetweentheredcolorofthefirstmarkerAP-RedandthesecondmarkerDABintheimmunohistochemicaldoublelabelwaslarge,thebackgroundwaslow,anditwaseasytodistinguish.Thesamepartofthetwocolormarksisbrickred,whichiseasytoindicatethedoublemark.Statisticsshowthatinlungadenocarcinomatissuesamples,M2tumor-associatedmacrophagesarepredominant,accountingforabout80%.Conclusion:Theimprovedchromogenicsystemestablishesasimpleandreliablenewmethodfordoublelabelingofimmunohistochemistry.Theresultsoflabelingcanclearlyandstablyshowthedistributionoftumor-associatedmacrophagesinlungadenocarcinoma,andfurtherstudyitsroleintheoccurrenceanddevelopmentoflungcancer.
Keywords:lungadenocarcinoma;macrophage;chemicaldouble-labeling
肺癌目前为全球发病率最高且死亡人数最多的恶性肿瘤，目前其发病率和死亡率均占我国恶性肿瘤的第一位——肺腺癌患者5年生存率只有15.9%[1]。目前免疫双重标记(双标)实验中较多采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶双酶显色系统[2]。建立一种获取高质量结果的免疫组化双重标记方法具有重要的应用价值。本研究将对既往免疫组化双标实验方法中双酶显色系统的反应底物进行改进，并进一步利用改进的双标实验方法研究肺腺癌中不同亚型肿瘤相关巨噬细胞的分布情况。
1.资料与方法
1.1一般资料
肺腺癌标本选取2017年1月-2018年1月在我院进行外科手术的肺腺癌患者20例。入选标准：①常规病理HE组织切片需得到至少2名有经验的病理学医师的一致诊断；②诊断必须符合2017UICCTNM分类(第8版)的组织学诊断标准[3]。
1.2方法
需要的化学试剂：CD68(巨噬细胞表面标志物)、HLA-DR(M1型肿瘤相关巨噬细胞表面标志物)、CD163(M2型肿瘤相关巨噬细胞表面标志物)、生物素标记的羊抗鼠/兔IgG、碱磷酶底物APRed试剂盒。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶、链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶及其他化学试剂。
免疫组化双标染色步骤：石蜡切片脱蜡水化，组织内源性过氧化物酶灭活，抗原高温高压酸修复(pH=6.0)，正常山羊血清封闭液阻断非特异性结合。第一标抗体孵育：滴加终浓度为2.5μg/mLCD68抗体工作液，4℃孵育16h；阴性对照PBS代替抗体，其余相同。生物素标记羊抗鼠/兔IgG(简称二抗，下同)孵育，链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶链接二抗，AP-Red呈色反应。碱性磷酸酶液洗脱液洗脱抗体和碱性磷酸酶，第二次非特异性阻断。第二标抗体孵育：滴加第二标抗体(终浓度为2.5μg/mLCD163抗体或HLA-DR抗体)4℃孵育16h。生物素标记的二抗孵育，辣根过氧化物酶链接二抗，DAB呈色反应。苏木精复染细胞核，甘油封片剂封片，显微镜下及时观察采图。
2.结果
免疫组织化学双重标记中第一标记AP-Red的红色与第二标记DAB的棕黄色反差大，背景低，易于分辨。两种颜色标记的同一部位呈现砖红色，易于表示双标部位。统计显示在肺腺癌组织标本中，以M2型肿瘤相关巨噬细胞为主，约占80%。
3.讨论
本实验对既往免疫组织化学显色系统进行了改进。分别使用二抗链接的碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，底物选用FastRed和DAB分别显示红色与棕黄色。两种颜色反差大、背景低、易于分辨。该方法试剂易得，操作简便。如果正确操作，则染色结果质量高、稳定可靠。由于本方法不需要特殊的试剂与设备，将可为临床工作和基础研究提供一定的便利。
综上所述，本研究改进的免疫组织优化双标方法虽然存在一定的不足，但因其适用面广，冰冻和石蜡切片均可采用，适当加以改变还可以进一步提高灵敏度或发展成三标甚至多标方法，可广泛地应用于临床病理诊断和基础实验研究。
参考文献：
[1]外周血血小板/淋巴细胞比值在肺腺癌诊断中的价值[J].汪向海,潘贤慧,邢敏.皖南医学院学报.2018(06).
[2]基于MALDI-TOF-MS技术建立肺腺癌诊断预测模型及其初步验证[J].荆心研,卢兆莲,张婷,胡成进.国际检验医学杂志.2018(09).
[3]肺腺癌的治疗现状[J].王斌,张雨洁.世界最新医学信息文摘.2018(45).