导读:本文包含了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:沙门氏菌,伤寒,疫苗,基因,绦虫,载体,荧光。
重组减毒鼠伤寒沙门氏菌论文文献综述
孟霞,陈凯,陈斌杰,朱国强[1]（2017）在《表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的减毒鸡伤寒沙门氏菌重组菌的构建及免疫保护作用研究》一文中研究指出引言肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis,S.Enteritidis)是一种重要的人畜共患病原菌,成年家禽感染后一般呈无症状带菌状态,长期排菌,污染肉蛋产品,并引起人类严重的食品安全问题。开发具有强保护力的新型疫苗是防治家禽肠炎沙门氏菌感染较为有效的方法。SEF14菌毛特异性表达干肠炎沙门氏菌以及相近的D-群沙门氏菌中,以SEF14菌毛为抗原,含有asd基因为(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集》期刊2017-08-20）
陈凯[2]（2017）在《表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的减毒鸡伤寒沙门氏菌重组疫苗的构建及免疫保护研究》一文中研究指出沙门氏菌病(Salmonellosis)是由沙门氏菌引起的常见人畜共患病,除了初生动物,一般人畜感染后呈现无症状的带菌状态,长期排菌,造成养禽业严重的经济损失。其中肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica serovar Enteritidis,S.enteritidis)是引起沙门氏菌病和食物中毒的主要原因之一。日常生产中预防和控制肠炎沙门氏菌的主要方法是抗生素治疗,但是由于抗生素的不合理使用,所产生的耐药性问题和药物残留问题越来越受到关注。因此,寻找一个安全有效的途径来防治肠炎沙门氏菌是亟需解决的问题。经过不断地探索发现,采用疫苗免疫结合合理用药的方式是防治肠炎沙门氏菌感染较为有效的方法。因此,开发出具有强保护力的广谱的新型基因工程苗有着重要的意义。本研究通过使用以asd基因为营养缺陷标志基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R染色体-质粒平衡致死系统,表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛抗原,并评价该重组口服疫苗对肠炎沙门氏菌病的免疫保护效果。1.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的克隆与表达SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌及其相近的D-群沙门氏菌血清型中,在体外克隆和表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子sef结构基因,并检测重组菌毛的生物学活性。以表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA为模板,利用分步PCR扩增出编码SEF14菌毛操纵子的基因序列,将其克隆至表达载体pBR322,构建和筛选出含sef完整基因并正确插入pBR322的重组质粒pBR322-sef。再将此重组质粒转化至不含任何菌毛和鞭毛的大肠杆菌SE5000工程菌,并命名为psef。将pBR322空载体质粒转化至SE5000,构建阴性对照菌,命名为p322。结果发现,重组菌psef能与SEF14菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,而不与p322发生任何可见的凝集反应。电镜下可以观察到重组菌psef菌体表面表达了菌毛,Western blot可得到分子量大约为14.3kDa的蛋白条带,表明SEF14菌毛已成功在SE5000表达。本研究为进一步研究肠炎沙门氏菌SEF14菌毛生物学作用及开发出以SEF14菌毛作为免疫原的基因工程苗奠定了基础。2.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要亚单位sefA的克隆、原核表达与多克隆抗体的制备根据Genbank发表的肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要结构亚单位sefA基因序列设计一对引物,以肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA作为模板,PCR扩增sfA基因片段,将PCR产物按预定的阅读框插入原核表达载体pET-28a(+),构建出重组质粒pET-28a(+)-efA,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)进行高效诱导表达,得到大小约为14kDa的可溶性重组蛋白。经过条件摸索,重组菌在IPTG浓度为0.2mM的条件下,25℃诱导5h时蛋白表达量最高。通过Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白,将纯化后的重组蛋白免疫小鼠,获得高特异性的SEFA多抗血清,该多抗血清能识别肠炎沙门氏菌及重组原核表达载体。本研究构建、表达并获得高纯度的融合蛋白rSEFA,并成功获得鼠源SEFA多抗血清,为进一步探究构建能表达SEF14菌毛抗原的重组基因工程疫苗奠定基础。3.表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究基于研究一构建的具sef操纵子基因并能表达SEF14菌毛的psef重组质粒,使用SalI和NcoI双酶切将其插入含asd基因的表达载体pYA3342中,再转化至减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R△asd突变株中,构建出重组菌SG9R(pYA3342-sef);利用PCR技术扩增出编码表达SEF14菌毛的sefA主要结构亚单位基因,以同样的方法构建出重组菌SG9R(pYA3342-sefA)。采用玻板凝集试验和Western blot验证重组菌菌毛的表达,并进行鸡巨噬细胞系HD11的吞噬试验和存活试验,分析两组重组菌的生长特性、遗传稳定性及口服安全性等生物学特性。细胞试验表明,HD11对SG9R(pYA3342-sef)组吞噬数量少于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组,该组菌在HD11中的存活能力也低于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组,且差异均显着(P<0.05)。将35日龄非免疫清远麻鸡口服接种重组菌,并在二周后进行二免,其中SG9R(pYA3342-sef)、SG9R(pYA3342-sefA)为免疫组,SG9R(pYA3342)为空载体对照组,另设PBS空白对照组。免疫后每组每周随机取3只鸡分离外周血淋巴细胞,通过流式细胞术分析外周血CD3+CD8+T淋巴细胞动态变化。结果表明,SG9R(pYA3342-sef)组CD3+、CD8+ T细胞各时期含量均高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组,且在二免两周达到最高;分别采集各组鸡每周的血清,利用间接ELISA检测其体内特异性IgG抗体的水平,结果显示二免一周和二免两周时SG9R(pYA3342-sef)组血清IgG抗体水平显着高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组(P<0.05);二免两周后收集气管黏膜样品和肠黏膜样品,利用间接ELISA检测特异性sIgA的水平,SG9R(pYA3342-sef)组十二指肠、空肠、盲肠和回肠sIgA抗体水平显着高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组(P<0.05);在二免两周后对每组鸡口服攻毒肠炎沙门氏菌标准株SD-2,观察发现虽然每组鸡均未死亡,但但攻毒后一周每组随机剖检5只鸡,SG9R(pYA3342-sef)组病变显着低于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组。总结试验结果表明,重组疫苗菌株SG9R(pYA3342-sef)对肠炎沙门氏菌具有较好的免疫保护作用。(本文来源于《扬州大学》期刊2017-04-01）
田芳华,程相朝,张春杰,李银聚,李静[3]（2013）在《以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定》一文中研究指出试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2013年11期）
许信刚,王丹,童德文[4]（2011）在《表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验》一文中研究指出为了构建表达猪瘟病毒E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株,亚克隆猪瘟病毒E2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建了重组质粒pYA3341-E2。将该重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E2),并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安全性及动物免疫试验。结果显示,重组菌能表达E2蛋白且表达的蛋白能与猪瘟病毒阳性血清特异性结合。在体外营养选择压力下,重组菌株在体外可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾。小鼠口服试验证实重组菌无毒性,安全可靠。动物免疫试验表明,口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。结果表明,成功构建了能稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究猪瘟口服基因工程疫苗奠定了基础。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2011年09期）
秦学远[5]（2008）在《TGEV S基因减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗株的初步构建》一文中研究指出本研究成功克隆了猪传染性胃肠炎SC-H株S蛋白A、D抗原位点基因S1和热敏肠毒素B亚单位基因LTB,并构建了S1及与LTB融合的重组表达载体pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1。将构建的重组质粒依次转化减毒沙门氏菌X3730和X4550,获得了2株能稳定表达TGEV S蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)疫苗株,为TGEV口服活载体疫苗的开发研究奠定了基础。1.猪传染性胃肠炎S1基因片段和热敏肠毒素B亚单位基因的克隆本实验根据已发表的TGEV SC-H株S基因cDNA序列设计并合成一对特异性引物,以pMD19T-S质粒为模板,PCR扩增得到964bp的编码TGEV S蛋白A和D抗原位点的基因片段,并推导出321aa氨基酸序列,构建了克隆载体pMD19T-S1。根据Genbank上的猪源ETEC的LTB序列(M17873),设计并合成一对特异性引物,PCR扩增得到395bp的基因片段,并推导出131aa氨基酸序列,构建了克隆载体pMD19T-LTB。用DNAstar软件将测序结果中LTB的ORF与GenBank中收录的猪源ETEC菌的LTB基因参考序列(M17873)相比较,其核苷酸同源性为100%。2.减毒沙门氏菌表达TGEV S蛋白疫苗株的构建首先将LTB基因通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点转移到pVAX载体上,然后再将S1基因通过BamHⅠ和HindⅢ插入pVAX-LTB中,接着利用EcoRⅠ和HindⅢ将pVAX-LTB-S1质粒中的LTB-S1片段转入pYA3342质粒,最终得到沙门氏菌表达载体pYA3342-LTB-S1。同时,利用BamHⅠ和HindⅢ酶切位点将S1基因通过插入pYA3342质粒中,得到重组质粒pYA3342-S1。将pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1分别依次电转化X3730和X4550沙门氏菌,得到减毒沙门氏菌X4550(pYA3342-S1)和X4550(pYA3342-LTB-S1);用SDS-PAGE分析在终浓度为1mmol/L IPTG的诱导下减毒沙门氏菌表达产物,结果表明S基因及与LTB融合基因在减毒沙门氏菌表达系统中都获得表达,表达的重组蛋白分别约为37kDa和49kDa。3.重组疫苗株的生物学特性初步研究本实验构建的2株重组菌生长特性方面与X4550(pYA3342)相比没有显着变化;同时在LB(DAP~+)液体培养基中连续传10代后,含重组质粒的菌株达到98%以上。1×10~(10)或1×10~(11)CFU重组菌X4550(pYA3342-LTB-S1)和X4550(pYA3342-S1)分别灌胃接种6～8周龄昆明小鼠,用PCR方法检测其肝脏和脾脏中的重组菌,结果接种后第3天都可在肝脏和脾脏中检测出两种重组减毒沙门氏菌,连续检出3周;连续观察30天,小鼠无异常症状。(本文来源于《四川农业大学》期刊2008-06-01）
陈晓宇[6]（2008）在《表达TsoL18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建》一文中研究指出囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus cellulose)寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴(T. solium oncosphere)阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显着降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫机制,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western-blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及ELISA检测免疫小鼠血清中抗Tsol18抗体的产生情况,评价重组疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)的免疫效果。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24%,Western-blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120d只有20.1%降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012cfu30天后,存活率100%,证实重组疫苗口服安全可靠。ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18IgG抗体的OD值达到0.645,表明重组疫苗能激发机体产生免疫应答反应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗X4550(pYA3341-Tsol18),初步评价了重组疫苗的免疫效果,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制开拓了新的思路。(本文来源于《甘肃农业大学》期刊2008-06-01）
丁军涛[7]（2008）在《表达Tsol18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建及其免疫学研究》一文中研究指出囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴(T.solium oncosphere)阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显着降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫应答,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及在小鼠体内的分布情况,ELISA检测免疫小鼠血清和肠液中抗Tsol18抗体的产生情况,流式细胞术分析其脾细胞亚型的分化,ELISA检测免疫猪血清中抗Tsol18抗体的动态变化,探讨重组疫苗可能的免疫应答。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24 %,Western blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120 d只有20.1 %降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗4550(pYA3341-Tsol18)在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012 cfu 30天后,存活率100 %,证实重组疫苗口服安全可靠,小鼠口服免疫后第21天在脾脏仍能测到大量的重组疫苗株,表明重组疫苗在体内能够长久存活,有利于刺激机体产生持久的免疫应答;ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18 IgG抗体的OD值达到0.645,二免后六周小鼠肠液中有抗Tsol18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种免疫应答方式;免疫小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目明显增多,CD4+/CD8+ T细胞比值也显着增高(P<0.01),提示口服疫苗4550(pYA3341-Tsol18)可能同时诱导Th1和Th2免疫应答反应。猪免疫后20 d抗Tsol18 IgG抗体水平开始上升,在二免后30天抗体OD值达到1.025,表明重组疫苗能诱导猪产生抗猪囊尾蚴病的免疫应答效应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗4550(pYA3341-Tsol18),初步进行了重组疫苗的免疫学研究,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制和应用开拓了新的思路。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2008-05-25）
刘东升[8]（2007）在《幽门螺杆菌BabA2/UreI融合基因减毒伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建与鉴定》一文中研究指出背景与目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的高感染率及其严重的危害性,使Hp疫苗成为当今研究的热点之一。随着疫苗研究的深入,应用混合抗原成分制备Hp疫苗将是未来Hp疫苗研究的趋势。细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是目前基因疫苗研究的热点之一。沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种较为常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显着降低,但仍保留良好的侵袭力,可直接将表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导特异性的免疫应答反应。但由于其质粒中含有抗生素抗性基因,尽管其在体外试验有效,在人体内却无法应用,Nakayama等构建的平衡致死系统解决了这一问题。本课题拟构建幽门螺杆菌BabA2/UreI融合基因双价DNA疫苗,首先通过基因工程技术构建含asd基因的重组原核表达质粒,并利用沙门氏菌asd平衡致死系统,最终获得表达重组人BabA2/UreI融合基因蛋白的重组沙门菌减毒疫苗株x8501(pYA3342/BabA2/UreI),并检测目的蛋白的表达和抗原性,为制备预防Hp感染的DNA疫苗奠定基础。方法:①BabA2/UreI融合基因的克隆:以pcDNA3.1(-)/BabA2/UreI融合基因重组真核表达质粒为模板PCR扩增BabA2/UreI融合基因,PCR产物连接到pCF-T载体上,用TSS法转化到大肠杆菌DH5α,用氨苄青霉素和蓝白筛选法挑选T-A克隆,并测序。扩增含有BabA2/UreI融合基因的大肠杆菌DH5α,提取质粒,用SmaI和SalI酶切质粒,获得高浓度的融合基因。②构建原核表达载体:SmaI和SalI双酶切asd的组成型表达的原核表达载体pYA3342,将编码BabA2/UreI的融合基因插入pYA3342,构建pYA3342/BabA2/UreI重组质粒;TSS法转化入大肠杆菌x6212,筛选重组子;测序和酶切鉴定。③转化减毒伤寒沙门氏菌x8501株构建活载体疫苗株:采用缺失天门冬氨酸-β-半醛脱氢酶(△asd)的伤寒沙门氏菌x8501作为载体菌,将pYA3342/BabA2/UreI重组质粒电转化入减毒伤寒沙门氏菌x8501,构建表达BabA2/UreI融合基因平衡致死的减毒伤寒沙门重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI),提取质粒,酶切和PCR扩增鉴定。④目的基因mRNA测定:RT-PCR检测x8501(pYA3342/BabA2/UreI)mRNA的表达。⑤重组蛋白抗原性检测:分别提取培养上清和细菌蛋白,SDS-PAGE分离重组蛋白,以兔抗Hp的多克隆抗体为一抗,用Western Blot法检测重组蛋白的抗原性。⑥重组疫苗稳定性检测:重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)在体外连续培养5天后,提取质粒,检测稳定性。结果:①利用PCR技术从pcDNA3.1(-)/BabA2/UreI中扩增出了BabA2/UreI融合基因,琼脂糖凝胶电泳证实大小与预计一致,并成功构建了BabA2/UreI的重组质粒pCF-T/BabA2/UreI。测序结果证实BabA2/UreI融合基因正确插入到pCF-T载体中。②成功构建了pYA3342/BabA2/UreI重组质粒,测序分析显示所得序列完整,插入的基因片段全长2860bp,与基因文库中的BabA2和UreI基因的同源性分别达100%和97%。③成功构建了表达BabA2/UreI的减毒伤寒沙门菌重组菌株x8501(pYA3342/BabA2/UreI);酶切和PCR扩增鉴定证实重组质粒成功转入x8501。④RT-PCR结果显示融合基因能有效转录。⑤免疫印迹显示减毒伤寒沙门重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)可以表达融合蛋白BabA2/UreI,并能够被兔抗Hp的多克隆抗体识别,分子量大约是106KDa,并可以呈现分泌性表达。⑥重组质粒能稳定存在于宿主菌,并无丢失。结论:①成功构建pYA3342/BabA2/UreI重组质粒;②成功构建了减毒伤寒沙门氏重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI),融合基因能有效转录,融合蛋白能够被兔抗Hp的多克隆抗体识别,重组质粒能稳定存在于宿主菌;③本研究为开发可能应用于人类的抗Hp疫苗提供重要的靶抗原和载运系统选择依据,并为进一步进行蛋白质功能鉴定和动物试验研究奠定了基础。(本文来源于《南昌大学》期刊2007-05-01）
谢勇,刘东升,周南进,曹俊,吕农华[9]（2007）在《幽门螺杆菌BabA2/UreI融合基因减毒伤寒沙门氏菌重组疫苗的构建与鉴定》一文中研究指出目的研制表达幽门螺杆菌(Hp)粘附素 BabA2与尿素酶 UreI 融合基因减毒伤寒杆菌重组疫苗, 为制备预防 H．pylori 感染的疫苗奠定基础。方法 (1)BabA2/UreI 融合基因的克隆：以我们前期研究构建的 pcDNA3．0(-)/BabA2/UreI 融合基因重组真核表达质粒为模板 PCR 扩增 BabA2/UreI 融合基因,(本文来源于《中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（上册）》期刊2007-05-01）
方希修,王冬梅,唐现文,刘建文[10]（2007）在《携带EGFPC3质粒的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的表达》一文中研究指出目的构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达。方法将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细胞仪检测脾脏细胞荧光表达,利用荧光显微镜检测小鼠组织荧光表达。结果在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色;流式细胞仪结果证实,体外情况下,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入小鼠腹腔灌洗巨噬细胞,并在其中表达。在体内稳定试验中,经昆明种小鼠连续传代10次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。用免疫剂量的重组细菌接种昆明种小鼠后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。免疫一定时间后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。结论表达EGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2007年02期）
重组减毒鼠伤寒沙门氏菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
沙门氏菌病(Salmonellosis)是由沙门氏菌引起的常见人畜共患病,除了初生动物,一般人畜感染后呈现无症状的带菌状态,长期排菌,造成养禽业严重的经济损失。其中肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica serovar Enteritidis,S.enteritidis)是引起沙门氏菌病和食物中毒的主要原因之一。日常生产中预防和控制肠炎沙门氏菌的主要方法是抗生素治疗,但是由于抗生素的不合理使用,所产生的耐药性问题和药物残留问题越来越受到关注。因此,寻找一个安全有效的途径来防治肠炎沙门氏菌是亟需解决的问题。经过不断地探索发现,采用疫苗免疫结合合理用药的方式是防治肠炎沙门氏菌感染较为有效的方法。因此,开发出具有强保护力的广谱的新型基因工程苗有着重要的意义。本研究通过使用以asd基因为营养缺陷标志基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R染色体-质粒平衡致死系统,表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛抗原,并评价该重组口服疫苗对肠炎沙门氏菌病的免疫保护效果。1.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的克隆与表达SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌及其相近的D-群沙门氏菌血清型中,在体外克隆和表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子sef结构基因,并检测重组菌毛的生物学活性。以表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA为模板,利用分步PCR扩增出编码SEF14菌毛操纵子的基因序列,将其克隆至表达载体pBR322,构建和筛选出含sef完整基因并正确插入pBR322的重组质粒pBR322-sef。再将此重组质粒转化至不含任何菌毛和鞭毛的大肠杆菌SE5000工程菌,并命名为psef。将pBR322空载体质粒转化至SE5000,构建阴性对照菌,命名为p322。结果发现,重组菌psef能与SEF14菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,而不与p322发生任何可见的凝集反应。电镜下可以观察到重组菌psef菌体表面表达了菌毛,Western blot可得到分子量大约为14.3kDa的蛋白条带,表明SEF14菌毛已成功在SE5000表达。本研究为进一步研究肠炎沙门氏菌SEF14菌毛生物学作用及开发出以SEF14菌毛作为免疫原的基因工程苗奠定了基础。2.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要亚单位sefA的克隆、原核表达与多克隆抗体的制备根据Genbank发表的肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要结构亚单位sefA基因序列设计一对引物,以肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA作为模板,PCR扩增sfA基因片段,将PCR产物按预定的阅读框插入原核表达载体pET-28a(+),构建出重组质粒pET-28a(+)-efA,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)进行高效诱导表达,得到大小约为14kDa的可溶性重组蛋白。经过条件摸索,重组菌在IPTG浓度为0.2mM的条件下,25℃诱导5h时蛋白表达量最高。通过Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白,将纯化后的重组蛋白免疫小鼠,获得高特异性的SEFA多抗血清,该多抗血清能识别肠炎沙门氏菌及重组原核表达载体。本研究构建、表达并获得高纯度的融合蛋白rSEFA,并成功获得鼠源SEFA多抗血清,为进一步探究构建能表达SEF14菌毛抗原的重组基因工程疫苗奠定基础。3.表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究基于研究一构建的具sef操纵子基因并能表达SEF14菌毛的psef重组质粒,使用SalI和NcoI双酶切将其插入含asd基因的表达载体pYA3342中,再转化至减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R△asd突变株中,构建出重组菌SG9R(pYA3342-sef);利用PCR技术扩增出编码表达SEF14菌毛的sefA主要结构亚单位基因,以同样的方法构建出重组菌SG9R(pYA3342-sefA)。采用玻板凝集试验和Western blot验证重组菌菌毛的表达,并进行鸡巨噬细胞系HD11的吞噬试验和存活试验,分析两组重组菌的生长特性、遗传稳定性及口服安全性等生物学特性。细胞试验表明,HD11对SG9R(pYA3342-sef)组吞噬数量少于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组,该组菌在HD11中的存活能力也低于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组,且差异均显着(P<0.05)。将35日龄非免疫清远麻鸡口服接种重组菌,并在二周后进行二免,其中SG9R(pYA3342-sef)、SG9R(pYA3342-sefA)为免疫组,SG9R(pYA3342)为空载体对照组,另设PBS空白对照组。免疫后每组每周随机取3只鸡分离外周血淋巴细胞,通过流式细胞术分析外周血CD3+CD8+T淋巴细胞动态变化。结果表明,SG9R(pYA3342-sef)组CD3+、CD8+ T细胞各时期含量均高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组,且在二免两周达到最高;分别采集各组鸡每周的血清,利用间接ELISA检测其体内特异性IgG抗体的水平,结果显示二免一周和二免两周时SG9R(pYA3342-sef)组血清IgG抗体水平显着高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组(P<0.05);二免两周后收集气管黏膜样品和肠黏膜样品,利用间接ELISA检测特异性sIgA的水平,SG9R(pYA3342-sef)组十二指肠、空肠、盲肠和回肠sIgA抗体水平显着高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组(P<0.05);在二免两周后对每组鸡口服攻毒肠炎沙门氏菌标准株SD-2,观察发现虽然每组鸡均未死亡,但但攻毒后一周每组随机剖检5只鸡,SG9R(pYA3342-sef)组病变显着低于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组。总结试验结果表明,重组疫苗菌株SG9R(pYA3342-sef)对肠炎沙门氏菌具有较好的免疫保护作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
重组减毒鼠伤寒沙门氏菌论文参考文献
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