孙玉合[1]2004年在《烟草种间胞质杂种、对称体细胞杂种的获得及其分子标记鉴定》文中认为本论文的研究内容包括叁个方面：应用种间体细胞杂交技术结合Rhodamine 6G处理，快速创造含有N．repanda细胞质的烟草新胞质雄性不育系；对普通烟草(Nicotiana tabacum)与粉蓝烟草(N．glauca)种间对称体细胞杂种进行形态学、细胞学和分子标记分析，以及烟草种间体细胞杂种的高世代材料主要农艺性状观察分析和抗病性鉴定。主要结论如下： 1．Rhodamine 6G是细胞线粒体中葡萄糖的氧化磷酸化的专性抑制剂。5 μg／mlRhodamine 6G处理普通烟草(N．tabacum)K326的叶片原生质体15 min，可以钝化烟草原生质体停止分裂。 2．K326原生质体经Rhodamine 6G处理后与未经钝化的野生烟草N．repanda原生质体在PEG、高Ca~(2+)、高pH溶液的诱导作用下融合、培养，获得了33株再生植株。均为雄性不育，用普通烟草花粉授粉可正常结实。 3．再生植株形态与亲本普通烟草相仿，株间形态差异较小；过氧化物同功酶和脂酶同功酶带型分析，再生植株与普通烟草亲本一致，未发现野生烟草的特异条带。再生植株具有48条染色体。采用32个随机引物对进行RAPD分析，再生植株与普通烟草呈高度一致性，未发现N．repanda特异的条带。采用N．repanda特异性的线粒体F1-ATP synthase subunit alpha(atpA)基因片段为引物分析，发现再生植株线粒体DNA样品含有该特异长度片段。证实再生植株是种间胞质杂种，它具有普通烟草细胞核并含有野生烟草N．repanda细胞质线粒体基因组成分。 4．用K326及其他普通烟草的栽培品种与胞质杂种回交，杂种后代植株形态表现整齐一致，未出现分离，不育性保持稳定。新胞质雄性不育系的农艺性状较好，抗病性较高，烟叶化学成分适中，野生烟草细胞质的负面效应不明显。 5．通过N．tabacum(2n=48)革新一号和粉蓝烟草N．glauca(2n=24)原生质体融合获得了一个种间对称的体细胞杂种。该对称杂种具有72条染色体，形态上有别于亲本及烟草属内其他种，正常花粉率为32％，自交可结实，后代性状保持稳定。 6．采用RAPD标记技术对烟草种间对称体细胞杂种进行鉴定，结果证实杂种含有双亲的特异片段，但仅6个随机引物产生的带型表现为双亲的组合型。 7．将引物S18产生的RAPD多态性片段进行克隆，测序，获得了两条序列被GenBank收录(登记号分别为AY437884和AY437885)。根据测序结果，重新设计20 bp引物分析对称体细胞杂种基因组DNA，将RAPD标记转换为SCAR标记。8.对8个烟草体细胞杂交高世代材料进行田间农艺性状观察、统计分析和黑胫病抗性鉴定，以探讨他们在育种上的利用价值。结果显示，体细胞杂种经过多次回交改良，性状逐步稳定，抗病性有所提高，化学成分也基本协调。其中叁个品系各项农艺学性状优良。拟参加品种比较试验，并进行化学成分分析和评吸鉴定。
张丽[2]2007年在《花椰菜与黑芥非对称体细胞杂种的获得与鉴定分析》文中研究表明花椰菜(Brassica oleracea vat．botrytis L．)为十字花科(Cruciferae)芸薹属甘蓝种的一个变种，生产中常遭受多种病害的威胁，如黑腐病、黑胫病、根肿病等，严重影响其产量和品质。应用体细胞杂交，可以克服常规种间杂交不亲和性，获得种间杂种，转移来自不同物种的异源抗病基因，丰富育种材料抗病基因的遗传多样性，创制新的抗病种质。本研究拟利用非对称体细胞杂交技术向芸薹属甘蓝类蔬菜种质转移野生抗病性状。选用兼具有抗黑腐病、黑胫病、根肿病的野生黑芥基因型作为供体，具有良好原生质体培养能力的花椰菜基因型“0307”作为受体，通过PEG介导，融合经不同剂量UV照射处理后的黑芥叶肉原生质体及不经任何处理的花椰菜下胚轴原生质体。经过愈伤组织培养及植株再生阶段，共获得了约170棵再生植株。选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学调查、RAPD或SRAP分子标记鉴定，同工酶谱分析，染色体计数，流式细胞术基因组大小检测，证明其中30棵为体细胞杂种，表明再生株中的杂种频率约为75％。对不同鉴定方法结果的比较显示，形态学鉴定直观、简便，有较高的判断率，但对于非对称体细胞杂种而言，SRAP分子标记鉴定更准确可靠。对不同UV剂量处理下的原生质体培养及植株再生能力，再生株的形态学，分子标记特征，染色体数目，基因组大小等指标的鉴定分析结果表明，UV照射强度在0.001 J·cm~(-2)～0.200 J·cm~(-2)下都能获得不对称再生植株，而0.300 J·cm~(-2)下，融合细胞丧失了持续分裂及分化的能力，仅能得到愈伤组织；再生植株的形态多样，呈偏向受体花椰菜类型及中间类型分布；SRAP分子标记特征显示，杂种中来自供体的遗传信息丢失量约为2.27％～93.33％；有约23％的再生植株其染色体数目小于供、受体染色体数之和；流式细胞分析表明20％的植株其核DNA含量小于供、受体DNA含量总和。这些结果证明，UV辐射处理，能较高频率地获得花椰菜与黑芥的非对称体细胞杂种，导致再生株中染色体在不同程度上的消减，但UV的剂量效应不明显。对25棵再生植株人工接种黑腐病菌进行抗性鉴定，19棵再生植株表现良好抗性，6棵表现出3-5级病症。初步显示非对称融合再生株获得了来自黑芥的黑腐病抗性。
蔡小东[3]2006年在《柑橘雄性不育胞质杂种创造及相关基础研究》文中研究表明柑橘是世界和我国南方最重要的果树，果实无核是其品质优良的重要标志之一，我国地方特色柑橘品种多数有籽。高等植物的细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)性状一般认为由线粒体基因组控制。胞质体杂交能在短时间内定向转移胞质基因组控制的重要农艺性状，为CMS性状转移提供了一条新途径。温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.)为CMS类型，柑橘对称融合能产生拥有叶肉亲本核基因组和愈伤组织亲本线粒体基因组的二倍体胞质杂种。因此，通过对称融合途径可实现温州蜜柑不育胞质的有效转移，并且获得的杂种在倍性水平上没有增加。本研究旨在通过对称融合方式将国庆1号温州蜜柑(C.unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)的不育胞质定向转移到有籽柑橘品种，获得一批有望无籽的二倍体胞质杂种。另一方面，转GFP标记基因在柑橘细胞融合中的应用为杂种再生优势、体细胞杂种或胞质杂种早期筛选、胞质杂种产生机理等问题的研究提供了可能，本研究以转GFP标记基因柑橘愈伤组织或植株作为融合亲本之一，借助体视或倒置荧光显微镜，通过追踪杂种细胞的再生过程，探讨原生质体融合中的一些基础理论问题，以期为将来没有GFP标记基因条件下的细胞融合，特别是以转移CMS性状为目标的胞质杂种创造等研究提供理论指导。主要研究结果如下：1．转GFP基因国庆1号温州蜜柑愈伤组织原生质体的培养及胚状体诱导。在所采用的原生质体操作方法下，获得的原生质体在UV下都发出明亮的GFP荧光，活性达到87％。原生质体在MA固体包埋培养基中培养至12-14 d时出现第一次分裂，30 d后形成针尖大小的愈伤团，植板率达35±1.08％。培养50-60 d后，再生大量直径为1-2 mm左右的愈伤团。部分小愈伤团分别转移到不同碳源的培养基上诱导胚状体再生，培养6个月后，挑出的小愈伤团只长出新鲜的愈伤组织，未分化成胚状体。2．以国庆1号温州蜜柑愈伤组织为悬浮系亲本，分别与沙田柚(C.grandis(L.) Osbeck)、冰糖橙(C.sinensis(L.)Osbeck)、椪柑(C.reticulata)等中国地方特色柑橘良种及佩奇橘柚(C.reticulata Blanco×C.paradisi Macf.)等有籽品种对称融合，获得国庆1号+沙田柚、国庆1号+冰糖橙、国庆1号+佩奇橘柚3个组合的再生植株。其中后两个组合再生的植株均为二倍体胞质杂种，SSR分析表明其核基因组来自各自的叶肉亲本。国庆1号+沙田柚组合再生的35棵植株中17棵叶肉亲本型植株为二倍体胞质杂种，SSR分析显示其核基因组来自沙田柚；另外18株植株为异源四倍体体细胞杂种，在TAA15位点上检测到其核基因组发生重组。线粒体DNA(mtDNA)的CAPS分析显示3个组合再生植株的mtDNA均来源于它们共同的愈伤组织亲本，即国庆1号。cpSSR分析表明叁个组合再生植株或胚状体的叶绿体DNA(cpDNA)来自任何一个亲本(随机遗传)，且有双亲cpDNA共存于杂种植株或胚状体的现象发生，特别是在胚状体阶段。3．以转GFP基因国庆1号作为悬浮系亲本，与叶肉亲本四季橘(C.microcarpa Bunge)对称融合，探讨在胚状体阶段再生产物GFP表达与否与再生杂种倍性的关系。结果发现原生质体在培养60 d后，在GFP激发下可观察到小培养皿中形成3个有强烈GFP表达的胚状体和大量有GFP表达的愈伤团。基于柑橘细胞融合的特点，我们推测这3个胚状体为异源四倍体，而非二倍体胞质杂种。随后的倍性分析、SSR鉴定及CAPS分析证实了该推测，即所分析的3棵植株(分别来自这3个不同的胚状体)为异源四倍体，而所分析的愈伤组织由悬浮系亲本原生质体再生而来。4．以转GFP基因伏令夏橙(C.sinensis(L.)Osbeck)为叶肉亲本，分别选配与其亲缘关系远近不同的3个愈伤组织亲本国庆1号、默科特橘橙(C.reticulata Blanco×C.sinensis(L.)Osbeck)及澳洲指橘(Microcitrus papuana)进行融合。SSR分析结果显示属间融合再生产物均为四倍体体细胞杂种，种间融合获得的均为二倍体胞质杂种，与杂柑融合再生的植株包含二倍体胞质杂种和四倍体体细胞杂种。叁个组合再生植株或胚状体的胞质基因组分析表明：所有再生产物mtDNA均来自各自的愈伤组织亲本，而cpDNA表现为随机分离，在与默科特橘橙融合再生的植株中也有cpDNA共存的现象。同时在这叁个组合中，也发现杂种具有再生优势，但有不同的具体表现形式。5．伏令夏橙与转GFP基因伏令夏橙的“同源”融合。获得一株有GFP表达的二倍体植株和1个有GFP表达的胚状体。由于柑橘叶肉原生质体一般不能分裂再生，而本研究中所用的伏令夏橙胚性愈伤组织亲本不含GFP标记基因，因此推测该植株的再生机理可能是愈伤组织亲本的线粒体基因组启动叶肉原生质体的分裂和分化，直至最终形成完整的植株；进而表明叶肉亲本型胞质杂种的再生不一定需要异源线粒体DNA的启动，而只要是胚性愈伤组织的线粒体DNA即可。6．柑橘异源四倍体体细胞杂种的创造。获得冰糖橙+四季橘、默科特橘橙+HB柚(C.grandis(L.)Osbeck)两个组合的再生植株，这些植株在苗期表现出较强的生长势，倍性分析和分子鉴定表明它们均为异源四倍体体细胞杂种。本文还就对称融合转移温州蜜柑CMS性状的应用潜力、杂种再生优势和杂种早期筛选、转GFP标记愈伤组织在柑橘细胞融合中的应用、柑橘对称融合中胞质杂种形成的影响因素及柑橘对称融合中胞质基因组的遗传等问题进行了探讨。
盛小光[4]2009年在《花椰菜和大白菜新种质创制》文中研究说明花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)为十字花科(Cruciferae)芸薹属甘蓝种的一个变种,生产中常遭受多种病、虫害的威胁,如黑腐病、黑胫病、根肿病和蚜虫等,严重影响其产量和品质。在花椰菜常规种中,上述病、虫害的抗性资源匮乏或者单一,而在十字花科野生植物中存在丰富的异源高抗基因资源。应用体细胞杂交技术,可以克服常规种间杂交不亲和性,获得种间杂种,转移来自不同物种的异源抗性基因,丰富育种材料抗性基因的遗传多样性,创制新的抗病、虫种质。本研究第一部分是利用体细胞杂交技术向芸薹属甘蓝类蔬菜转移野生抗病、虫等优良性状。紫罗兰(M. incana)为十字花科紫罗兰属的一个野生种,具有很高的ω-亚麻酸含量以及优良的蚜虫抗性等。本实验建立了花椰菜和紫罗兰原生质体的PEG融合及培养技术,首次成功获得了紫罗兰与花椰菜的属间体细胞杂种再生植株,并对再生株的形态学,分子标记特征,染色体数目,细胞DNA含量等指标进行了系统的分析,为异源优异种质的利用建立了体细胞杂交技术基础。黑芥(B. nigra)为芸薹属叁个基本种之一,多为野生状态存在。黑芥中存在对黑腐病、黑胫病、根肿病等病害高抗、多抗性的基因型。本实验室通过体细胞杂交技术,获得了众多花椰菜与黑芥体细胞杂种。本研究对利用非对称体细胞杂交技术获得并成功移入温室的79个花椰菜和黑芥的杂种进行全生育期的生物学特性调查,内容包括植株形态学观察、细胞DNA含量测定、染色体计数、基因组组成、育性调查等。通过胚挽救技术获得了部分杂种的回交后代植株并对其部分生物学特性也进行了调查,同时对杂种一代及其回交后代进行了黑腐病抗性鉴定。本研究第二部分是利用远缘有性杂交手段向白菜中转移野生种黑芥的抗病性状。大白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)是我国重要的蔬菜作物之一。在种植过程中,常遭受黑腐病、黑胫病和根肿病等病菌的侵染,致使产量下降。通过远缘有性杂交手段把黑芥的抗病性转移到白菜中,对白菜的育种将具有重要意义。本实验以品质优良的感病大白菜为母本,黑芥为父本进行杂交,并对获得的F1代植株进行了形态学,细胞学和分子标记叁种手段分析鉴定。通过胚珠和子房培养等胚挽救技术成功获得了回交后代,初步的黑腐病菌人工接种鉴定结果表明,部分回交二代杂种植株中仍具备良好的黑腐病抗性。主要实验结果如下：1.成功建立了紫罗兰和花椰菜属间体细胞杂交体系,获得了118株再生植株,并对它们进行了形态学调查、RAPD和SRAP分子标记鉴定,同工酶谱分析,染色体计数和流式细胞术核DNA含量检测,表明二株为真杂种,且均为混倍体,染色体数变化范围为26到48条。对不同鉴定方法的比较显示,形态学鉴定直观、简便,有较高的判断率,但SRAP分子标记鉴定更准确可靠。获得的紫罗兰和花椰菜属间体细胞杂种植株在移栽入地后,生长缓慢,没有达到成株期。2.对成功移栽入温室的79株花椰菜和黑芥的体细胞杂种进行了全生育期性状调查分析,内容包括细胞DNA含量测定、染色体计数、植株形态学观察和育性调查等。杂种形态变异广泛,多数呈中间类型,少数呈偏亲性状；杂种细胞DNA含量不一致,呈现大于、等于和小于双亲细胞DNA含量之和的叁种类型；DNA含量大于双亲之和的杂种中,有较高比例的材料叶型出现畸形和(或)植株生长势弱,育性差。显示出杂种植株的生长势和育性与细胞的DNA含量具有一定的相关性。通过染色体计数,发现所检测杂种多为混倍体,即同一植株的细胞有多种染色体数目构成。在79个杂种中,筛选出13个目标材料,生长势较强,有较好或一定程度的育性,表明采用体细胞杂交技术手段来改良甘蓝类蔬菜的遗传多样性具有可行性。3.根据结实与否选取了可育和不育杂种各二株,对其生物学特性进行了对比分析。不育杂种的花粉母细胞(PMCs)减数分裂行为异常的比例远高于可育杂种,出现了大量的染色体桥,染色体滞后,染色体不均等分裂等异常行为；对PMCs终变期观察表明：不育杂种中出现了大量单价体；可育杂种中,二价体数目明显提高,单价体数目较少。基因组原位杂交(GISH)结果显示：可育杂种的体细胞染色体数为供、受体染色体数之和,为对称杂种；不育杂种细胞中含有受体花椰菜的全部基因组以及附加的3-12条供体完整染色体,为低度非对称杂种。且附加的黑芥染色体在减Ⅰ期均出现染色体滞后,染色体不均等分裂等异常行为。对可育和不育杂种的基因组SRAP分子标记分析表明：杂种DNA均有重组发生,且可育杂种的平均新带比例略大于不育杂种。4.对10个株系的15株BC1杂种进行了生物学特性调查,内容包括细胞DNA含量测定、染色体计数、植株形态学观察和花粉活力调查等。杂种形态多呈中间类型,有叁棵植株形态明显趋向于受体花椰菜。核DNA含量和染色体数目均不一致,显示出混倍特性,但相比于体细胞杂种一代,其变化范围明显变窄,且有接近于受体花椰菜的趋势。以花椰菜为父本,共有4个BC1植株获得自交和回交种子,一颗植株通过胚挽救技术获得回交二代胚苗。5.采用从北京,湖南等全国六个省份收集并经过鉴定确定的8个黑腐病菌种以及从英国引进的分别属于RaceⅠ和RaceⅣ的二个生理小种,共10个黑腐菌种对融合亲本花椰菜和黑芥进行苗期抗病性鉴定。筛选出了一个受体(花椰菜)的病情指数为70.4,为“高感(HS)”级别,同时供体(黑芥)的病情指数为8.8,达到“高抗(HR)”级别的黑腐菌种CH5。用筛选的黑腐菌种CH5对体细胞杂种一代及其回交后代植株进行抗病性鉴定,结果显示部分回交二代杂种植株仍具有良好的黑腐病抗性,病情指数为15.7,达到“抗病(R)”级别。6.对获得的10株白菜×黑芥的F1代植株,经形态学,细胞学和SRAP等方法鉴定出6株为真杂种。其中有一株杂种(H1)体细胞含有26条染色体,GISH结果显示其基因组组成为ABB型,育性相对较高,获得了175粒回交一代种子；其它5株杂种50%以上的体细胞含有18条染色体,GISH结果显示其基因组组成为AB型,花粉完全败育,通过胚挽救技术也未获得回交后代。由此推测,染色体数目的增多和同源染色体的配对有利于提高杂种的育性。7.白菜-黑芥杂种与白菜的BC1代植株形态学上趋向于母本大白菜,表现出明显的杂种优势。细胞学观察发现不同BC1代杂种细胞染色体数目略有不同,但多为28条,GISH结果显示其基因组组成为AAB型,花粉活力明显提高,得到大量的回交二代种子；BC2代杂种细胞染色体数目不同,从22-28条不等。对回交一代和回交二代杂种植株的黑腐病抗性鉴定结果显示：部分回交二代植株仍然保留良好的黑腐病抗性。
向凤宁[5]2003年在《小麦远缘体细胞杂交及体细胞杂种的遗传研究》文中提出小麦与远缘族植物的体细胞杂交难以再生植株成为限制其发展的瓶颈,在本实验之前未见成功的报道。对小麦体细胞杂种中双亲胞质组成及核基因与胞质基因的相互作用的研究较少,仅有小麦与近缘属簇毛麦和远缘属玉米的体细胞杂种的报道。小麦体细胞杂种后代的遗传稳定性仅有初步的研究,还未进行系统的追踪分析。 本论文开展了小麦与远缘族植物的不对称体细胞杂交研究,建立了不对称体细胞杂交再生植株的实验体系;研究了UV剂量对杂种生长、分化及染色体消减和片段化的影响;比较了杂种的再生与小麦基因型的关系;较系统地了解了杂种的核、质基因组的组成;进一步揭示了两类型小麦亲本的基因组与供体基因组互补再生植株的效应;系统分析了小麦体细胞杂种在传代中的性状和遗传组成,探讨了杂种中异源核物质的遗传稳定性及渐渗到小麦基因组的可能方式以及在小麦育种中的意义。 主要研究过程及实验结果如下: 1.普通小麦与远缘族植物的体细胞杂交: 选用无芒雀麦、燕麦两种植物作供体,叁种基因型的小麦作受体,通过UV照射供体的不对称融合方法,获得了体细胞杂种白化苗: 1) 小麦99P与无芒雀麦融合,再生3个单细胞克隆(No.1～No.3),经染色体、同工酶和RAPD分析表明,它们均为杂种细胞系。No.1克隆形成的愈伤组织分化出大量白化苗,其叶片同工酶和RAPD分析均出现双亲特征谱带及新带,白化苗的染色体数目为42～54,大于亲本小麦,并具有无芒雀麦的小染色体和染色体断片,确认它们为不对称体细胞杂种。 2) 小麦济南177悬浮细胞系、济南177愈伤组织和核生3号愈伤组织与燕麦融合,共形成191块愈伤组织。8个克隆分化出大量的白化苗,经染色体、同工酶和RAPD分析表明,它们均为杂种细胞系及杂种白化苗。首次通过GISH发现,UV-射线剂量的增高确实引起了供体染色体消减程度的提高,并且还造成多位点的燕麦染色体小片段插入及易位.,表现出明显的UV-射线的剂量效应。 3) 本实验中,99P胚性愈伤组织(+)无芒雀麦和济南177悬浮系(+)燕麦再次重现了白化苗互补再生的结果,而分化能力很高的核生3号和济南177分别与燕麦融合仅
喻艳[6]2013年在《马铃薯与茄子原生质体融合创制新资源研究》文中提出体细胞杂交技术不仅能够克服有性生殖障碍,而且可以有效地同时转移核基因与胞质基因,促使优良性状在种内、种问、属间得到整合,从而获得有性杂交无法得到的优良种质资源,丰富现有栽培种资源的遗传背景。青枯病是茄科植物的重要的细菌性病害,其危害在马铃薯上仅次于晚疫病。目前我国马铃薯栽培品种缺少青枯病抗源,而存在于相关种中的优良抗性资源由于有性杂交不亲和又难以利用。因此,本研究旨在利用对称及非对称融合技术,将抗青枯病茄子优良抗性基因染色体片段整合到马铃薯栽培种中,创制抗青枯病马铃薯新资源。同时期望利用非对称融合技术转移马铃薯染色体片段到茄子中,建立马铃薯染色体片段导入系,为马铃薯遗传基础研究搭建新平台。取得的主要研究结果如下：1.亲本原生质体培养体系建立研究在对亲本倍性确认的基础上,采用本实验室建立的马铃薯原生质体培养方法,选用7个马铃薯基因型进行原生质体培养研究。结果表明,不同基因型间培养反应差异较大。前期液体浅层培养反应较好的只有3个基因型,包括8#、AC142、AC239.后续培养中,分化培养只有AC142能再生植株。此外,马铃薯二倍体野生种S.chacoence(C9701)虽然前期培养生长缓慢,但在继续培养中可以分化植株。茄子E508来源于抗青枯病基因型“本地红茄"的种子,组织培养下无性繁殖用于原生质体培养体系建立。使用不同的预处理方法,培养基和激素组合,研究显示,培养4周的试管苗,采用CM培养液黑暗预处理24h,适宜于茄子原生质体分离；CM.-I为适于茄子原生质体前期培养的培养基；后续培养的适宜激素组合为1.0mg,L NAA+0.1mg/L2,4.D+0.25mg/L ZT+0.25mg/LBA。2.马铃薯-茄子对称融合及其体细胞杂种鉴定研究以二倍体马铃薯AC142和茄子E508为融合亲本,进行原生质体对称融合,共获得了n7个再生植株。使用15对马铃薯SSR标记引物和6对茄子SSR标记引物,鉴定确认了34个株系为体细胞杂种。流式细胞仪分析了17个体细胞杂种的倍性水平,结果显示,17个被测杂种株系中,3个系峰值与四倍体马铃薯种相似；8个系含有两个二倍体马铃薯基因组和1个二倍体茄子基因组(六倍体)；另有6个非整倍体。对一个与马铃薯四倍体峰值相似的系PE29-1和一个按峰值推测含有四倍体马铃薯基因组和二倍体茄子基因组的杂种PE3-4,进行染色体计数,结果证明PE3-4染色体数为72,PE29-1染色体数为48,与流式细胞仪测定结果相符。3.对称融合体细胞杂种染色体组成分别选取7个体细胞杂种(4个六倍体,1个四倍体和2个非整倍体),采用基因组原位杂交(GISH)分析了其染色体组成。结果显示,4个六倍体杂种均含有48条马铃薯染色体和24条茄子染色体。非整倍体的体细胞杂种PE60-10含54条马铃薯染色体,16条茄子染色体和7条重排染色体。对标记检测为杂种、倍性分析为四倍体的PE29-1进行GISH分析,结果未检测到茄子的杂交信号。上述结果表明,在马铃薯-茄子的融合中,即使是对称融合,也很难获得具有二倍体马铃薯和二倍体茄子染色体的杂种,二倍体马铃薯在体细胞杂种中更容易加倍为为四倍体,这种加倍是两个马铃薯细胞和一个茄子细胞融合产生、还是在培养过程中马铃薯染色体的加倍目前还不清楚。在非整倍体杂种中更容易发生染色体重排。4.对称杂种的胞质组成研究采用在双亲间具有多态性的线粒体引物P4(pumD)分析了34个体细胞杂种的线粒体组成。结果显示,除了PE29-4和PE57-4两个株系只含有马铃薯亲本带以外,其它32个杂种株系线粒体均为双亲带型,且在所有含有双亲带型的杂种均出现了新带型,表明双亲线粒体基因组在融合后进行了整合。选用两个亲本间具有多态性的叶绿体引物NTCP9和NTCP12,对体细胞杂种叶绿体基因组组成进行了分析。结果显示34个体细胞杂种叶绿体扩增带型均与马铃薯亲本一致。上述结果说明,在体细胞杂种中,线粒体更容易发生重组,而叶绿体则只能保留一个亲本的基因组,且可能偏向远缘融合中提供核背景较多的亲本一方。5.对称杂种的青枯病抗性评价本研究对11个生根正常的体细胞杂种初步进行了青枯病抗性评价。使用青枯菌1号生理小种对杂种株系试管茵进行伤根接种,9个株系表现为抗青枯病,其中PE4-1的抗性显着高于抗病茄子亲本,其余8个系与之相当。选择试管苗接种后呈现抗性且钵栽生长正常的3个株系进行室外接种,3个株系抗性水平与茄子亲本相当,表明马铃薯-茄子原生质体融合成功地将茄子的青枯病抗性转移到马铃薯中。6.马铃薯-茄子非对称融合及其融合子鉴定研究采用紫外线照射原生质体破坏供体亲本的染色体结构,以利于融合中的染色体片段插入。以茄子E508为供体、马铃薯四倍体栽培种8拌为受体的非对称融合中,共获得73个再生株系。使用流式细胞仪对47个株系进行倍性分析,结果表明,36个株系为四倍体,6个为混倍体,2个为非整倍体,1个为八倍体,还有2个株系在测定过程分别出现主峰数量减少和峰值改变的现象,说明在继代过程中植株的染色体可能发生丢失。对16个非对称融合再生株系形态特征进行了观察评价,它们均能结薯,但在薯形、叶片形态、长势等性状上具有不同程度的变异。这些变异是否因为茄子的染色体片段插入而引起,还有待进一步研究。对马铃薯栽培种DH讷16为供体、茄子E508为受体的非对称融合中,共获得335个愈伤组织,到论文撰写时获得12个再生植株。由于大部分再生株系生根困难,生长缓慢,本研究只能对再生较早、能够生根的3个株系进行了鉴定分析。选用STI024、STI046和STM10883对在亲本间具有有多态性的引物进行分析,3个再生株系均含有马铃薯和茄子特异带,表明它们为体细胞杂种。胞质分析表明,杂种株系的线粒体为双亲融合型,叶绿体为偏马铃薯亲本类型。
徐小勇[7]2006年在《柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究》文中认为原生质体融合技术能有效克服柑橘有性杂交不亲和、雌和／或雄性败育以及珠心胚干扰等问题，实现核DNA和胞质DNA重组，为柑橘遗传改良提供了一条新的途径。本研究旨在针对我国一些优良柑橘品种种子多的问题，拟采用“胞质体-原生质体”融合和非对称融合，将温州蜜柑控制雄性不育的胞质因子转入有籽品种中，以获得新的柑橘无核种质。此外，本研究对本实验室以前通过原生质体融合获得的4个组合的体细胞杂种植株进行了核质遗传分析。主要研究结果如下： 1．开展了柑橘胞质体分离的研究，建立了高效的柑橘胞质体分离体系。首先以柑橘胞质雄性不育材料-温州蜜柑国庆1号(Citrus unshiu)的胚性悬浮系为试材分离原生质体，再通过不连续的甘露醇-蔗糖梯度和超速离心方法分离胞质体；比较了不同的离心速度、离心时间、离心温度、梯度组分的体积和浓度对胞质体分离的影响，结果表明，转速为38000r／min，温度为25℃，离心20min，15％蔗糖浓度(悬浮原生质体的下层溶液)是分离胞质体最适宜的条件，可获得纯度为90％的胞质体；胞质体的平均直径为23.2μm；使用FDA染色，发现胞质体的活力在75-85％之间；采用低熔点琼脂糖包埋培养，48h后胞质体破裂死亡。 2．开展了柑橘“胞质体-原生质体”融合，获得了国庆1号(C. unshiu，cv. GuoqingNo. 1)+诺瓦橘柚(C. reticulata×C. paradisi)、国庆1号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 1)+默科特橘橙(C. reticulata×C. sinensis)2个组合的再生愈伤组织和胚状体。前一组合得到的愈伤组织在诱导胚状体的2％甘油培养基上未见进一步生长和分化；从后一组合，挑出的44个单个小愈伤培养在2％甘油培养基上，有3个分化出胚状体。对后一组合再生的叁个细胞系进行倍性和核质基因组分析，结果表明，再生的细胞系均为二倍体，核DNA来自默科特橘橙，而线粒体DNA来源于国庆1号。 3．研究了紫外线(UV)照射柑橘原生质体作为喂养层培养目标原生质体的效果，发现UV照射的原生质体作饲养层具有促进愈伤原生质体生长的作用，而对叶肉原生质体的生长无促进作用；研究了UV对柑橘原生质体DNA片段化的影响。结果表明，UV处理后的原生质体比未处理的原生质体发生较高的DNA片段化。 4．开展了UV处理供体的非对称融合研究，获得了国庆5号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 5)+默科特橘橙(C. reticulata×C. sinensis)、国庆1号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 1)+诺瓦橘柚(C. reticulata×C. paradise)、国庆1号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 1)+锦橙(C. sinensis)共3个组合的再生愈伤组织和芽。其中前2个组合获得了愈伤组织，后一个组合再生了芽，采用FCM、RAPD、AFLP和CAPS对再生的四个芽系进行鉴定，结果表明，再生的芽系为二倍体、叁倍体或四倍体的体
蔡云飞[8]2006年在《植物远缘体细胞杂种的核/质基因组组成及其代谢转录组研究》文中研究说明植物体细胞杂交技术具有不可比拟的优越性，它可以克服有性杂交不亲和障碍，将不同亲缘关系(包括近缘和远缘)植物的基因组进行融合，以拓宽对野生基因资源的利用；可同时转移细胞核和细胞质基因，使双亲胞质基因和核基因在杂种细胞中共存或重组，从而产生多种多样的，有性杂交无法实现的作物新类型：可转移多基因编码的性状(如作物的产量、品质、抗逆)等，近年来在近缘体细胞杂交方面取得了诸多进展，得到了多种可育杂种后代，并应用于生产实践中，然而远缘体细胞杂交却因为难以再生这一瓶颈的限制而少有研究。远缘体细胞杂交中的核质基因组组成及相互关系、体细胞杂种细胞系代谢及基因表达的整合更是鲜有报道。本论文通过对单子叶植物高羊茅与小麦以及双子叶植物柴胡与麻花艽的不对称体细胞杂种的核质基因组研究，并以原生质体培养以及自融合为对照，了解远缘体细胞杂交的核／质组成及互作方式以及原生质体在培养过程中发生的体细胞无性系变异与体细胞杂种性状的关系。另外通过对中药材柴胡与麻花艽体细胞杂种细胞系代谢产物以及基因表达情况的分析，初步研究体细胞杂交过程中双亲的基因表达及代谢途径的拮抗与整合作用。为远缘体细胞杂交在牧草育种和中药材生物技术及代谢组研究中的应用提供理论基础。1．单／双子叶植物远缘体细胞杂交的比较研究1)．高羊茅与小麦远缘不对称体细胞杂种的核／质基因组本实验以高羊茅为受体，与经380uW／cm~2的UV照射30s、1min、1.5min、2min、3min的小麦原生质体经PEG介导进行融合，同时以高羊茅的原生质体培养作为对照。分别经过40天的暗培养，获得大量的体细胞杂种细胞系及亲本细胞系。小麦亲本原生质体培养细胞系的情况在本实验室的前期研究中已有报道(Xiang et al.,2003,2004,Cheng et al.,2004)，以下仅描述杂种及高羊茅原生质体培养及分析的结果。形态学分析表明，不同细胞系具有不同的表型，多数来源于UV照射30s及1min的细胞系生长旺盛，愈伤组织表型偏向于高羊茅，约25％的细胞系可高效再生出表型偏向于高羊茅的绿色植株：而来源于UV照射1.5min或更高剂量的组合则仅形成生长缓慢、不具有再生能力的细胞系或不能分裂，对照高羊茅原生质体产生的细胞系生长旺盛，表型与其来源的亲本培养物相近。对于部分生长旺盛的细胞系进行同工酶分析表明，杂种的生化标记以高羊茅的谱带为主，同时具有小麦特征带及新带，而原生质体培养细胞系则基本与亲本高羊茅谱带一致，仅少数细胞系具有新带或缺少部分高羊茅的特征带。RAPD分析表明，杂种细胞系具有双亲的特征带和新带，对照细胞系则具有与高羊茅几乎完全相同的谱带。染色体分析显示，杂种细胞系的染色体形态偏近于高羊茅，但可再生细胞系的染色体数目为26-45条，而不具再生能力细胞系含有45-84条染色体：对照细胞系染色体分布范围为22-52条，所有的细胞系都具有1-3个小染色体或染色体片段以及1-2条双／多着丝粒染色体。GISH分析显示，杂种细胞系中没有完整的小麦染色体，可见到2-4个小麦染色体片段以易位的形式存在于高羊茅染色体上。应用RFLP，SSR研究杂种细胞系胞质基因组。杂种细胞系胞质基因组整体上偏向受体，但同时具有供体特征带及新带。表明双亲的胞质基因组也进行了复杂的重组过程，但重组仅涉及胞质基因组的部分位点，而另一部分位点则表现为与高羊茅一致。对照细胞系胞质基因组的分析显示，其组成与亲本相似，仅在少数细胞系的少数位点上发生变异。杂种细胞系及对照甲基化变异的MSAP分析显示，杂种总体的甲基化程度与受体高羊茅相近，但是有大量位点发生甲基化变异，不同细胞系变异的位点不同；而亲本原生质体细胞系的甲基化及变异则表现出高度的同一性。2)．狭叶柴胡与高寒藏药的体细胞杂交及杂种的核／质基因组本实验以狭叶柴胡原生质体为受体，与经UV照射30s、1min、1.5min、2min的麻花艽原生质体经PEG介导进行融合，同时以狭叶柴胡的原生质体培养以及自融合作为对照。分别经过70天的暗培养，获得大量的体细胞杂种细胞系及亲本狭叶柴胡原生质体培养以及自融合细胞系。亲本麻花艽的原生质体不能分裂。形态学分析显示，杂种细胞系以及自培养细胞系表型均偏近于狭叶柴胡，且部分杂种细胞系以及自融合细胞系可以分化出绿色的不定芽及不定根。同工酶分析显示，杂种细胞系含有以受体为主的同工酶谱带，同时具有供体特征带以及新带。RAPD及5sDNA分析从分子水平证实了杂种细胞系供／受体基因组的共存与重组。染色体分析显示，杂种细胞系与受体相同，具有9-14条狭叶柴胡的染色体，而狭叶柴胡原生质体培养细胞系与自融合细胞系分别具有12条以及20-24条染色体，显示出狭叶柴胡细胞系在体细胞杂交以及自培养过程中的遗传稳定性。胞质基因组的RFLP分析显示，杂种细胞系的线粒体基因组谱带以狭叶柴胡特征带为主，同时具有少量供体特征带及新带，而叶绿体的组成则与狭叶柴胡完全相同。表明了线粒体在部分位点发生重组，而叶绿体则表现为不等分离。通过以上两个实验，我们对远缘体细胞杂交有如下认识：在单子叶植物及双子叶植物远缘杂交过程中，受／供体均存在再生互补现象。高羊茅／小麦和狭叶柴胡／麻花艽通过受体(+)供体的双亲细胞的遗传物质互补效应而再生植株。此外，受体的自融合中也有多个再生细胞系可以分化出绿色植株，表明这种再生互补效应不仅发生在不同物种之间，而且可以由同一物种的生长状态不同的细胞系之间或同一细胞系中具有不同遗传组成的细胞之间实现再生互补。本研究表明，遗传平衡也是杂种细胞系具有再生能力的重要条件之一，但本实验中部分具有相对平衡遗传物质的亲本原生质体却不能再生植株。由此推断，遗传平衡与双亲遗传物质的互补共同控制着杂种细胞系的再生能力。在以上两组合之中，体细胞杂种细胞系供体胞质基因的多态性在低UV辐照剂量范围中差别不大，新带比例变化亦不明显，表明UV照射在剂量30s-1min范围内对供体胞质基因的整合及重组没有明显的剂量效应，因此单子叶植物与双子叶植物中对于UV的响应具有相似的性质。2．狭叶柴胡与麻花艽体细胞杂种细胞系的代谢、转录组研究麻花艽的主要药效成分是龙胆苦甙、獐牙菜苦甙和齐墩果酸。目标代谢产物分析显示，所有的杂种细胞系中均不含有龙胆苦甙，一些体细胞杂种中含有獐牙菜苦甙，含量少于0.03130mg／g干重，低于麻花艽中的含量。而双亲均具有的成份齐墩果酸的含量呈现复杂的变化，部分杂种细胞系中只有痕量的齐墩果酸，部分杂种细胞系含量低于柴胡，但也有含量高于供体麻花艽的细胞系(可达1.729mg／g干重)。杂种细胞系No．3Q，No．3Q1’的醇溶性物质代谢图谱分析显示，两个杂种细胞系具有较多与亲本狭叶柴胡相同的代谢产物，含量分别占56.23％和38.84％；而所具有的供体特有成分含量为24.39％和36.30％；新物质的含量分别为17.91％和24.86％。另一方面，体细胞杂种细胞系中的糖类代谢物分别为32.25％和14.32％，远高于双亲中糖类物质的含量(柴胡为3.62％，麻花艽为2.39％)，从而表现出体细胞杂种细胞系中基础代谢的加强，这可能是由于双亲中复杂次生代谢途径的相互拮抗减弱而引起的。DDRT转化的转录组研究显示，与受体狭叶柴胡相比3Q和3Q1’中新表达的片段分别占13.59％和11.57％，沉默的片段分别占10.40％和10.35％。选取部分差异片段进行测序比对。结果为：约45.5％的片段的比对结果为无明显相似的片段。有比对信息的片段中，约41.7％片段为hypothetical protein。体细胞杂种细胞系中的差异片段主要是一些与基础代谢以及基本的生化过程相关的片段，反映出体细胞杂种细胞系中基础代谢的加强。单个基因-beta-amyrin在体细胞杂种细胞系及双亲中的表达分析发现：亲本狭叶柴胡及麻花艽中分别表达1个和2个beta-amyrin基因，而3Q及3Q1’中则表达来源于供体麻花艽的beta-amyrin基因。
惠志明[9]2005年在《原生质体非对称融合向花椰菜转移Ogura萝卜胞质雄性不育性的研究》文中研究表明原生质体非对称融合技术在作物遗传改良上具有重要的应用价值,通过该技术一方面可以将细胞质雄性不育性转移到栽培品种,缩短回交转育的年限,提高杂种优势的利用效率;另一方面也可以将野生种质资源中的抗性基因转入栽培品种,提高栽培种的抗逆性。 筛选细胞分裂旺盛、不定芽发生频率较高的基因型作为受体亲本,是原生质体非对称融合成功的关键。本研究通过下胚轴不定芽诱导与原生质体培养的方法,从四种甘蓝(Brassica oleracea L.)基因型中筛选出了合适的基因型。以筛选出的花椰菜“傲雪菜花一号”为受体,与Ogu CMS甘蓝型油菜(供体)进行非对称融合,研究结果如下: 1 以傲雪菜花一号、天王雪白菜花(花椰菜)、京研四季(结球甘蓝)和まり绿(青花菜)为受体亲本的筛选材料,采用下胚轴不定芽诱导与原生质体培养的方法,从中筛选出不定芽发生频率较高基因型:京研四季、天王雪白菜花、傲雪菜花一号。较原生质体培养,下胚轴不定芽诱导的方法同样可以筛选出合适的基因型用以作为原生质体非对称融合的受体亲本。 2 采用PEG介导的非对称体细胞融合获得了花椰菜与Ogura萝卜胞质甘蓝型油菜种间体细胞杂种32株。 3 转育了与Ogu CMS相关的基因orf138。 4 与Ogura胞质不育性密切相关的线粒体DNA orf138的STS标记,可以作为花椰菜体细胞杂种Ogura胞质雄性不育性的分子鉴定。 5 在供、受体亲本生长的不同时期取材,进行不同种类同工酶的筛选,选出了两种在供受体亲本间表现差异明显的同工酶:过氧化物酶(POX)和磷酸葡萄糖变位酶(PGM)。 6 人工合成46条在甘蓝型油菜和甘蓝中已表现出多态性的10碱基RAPD随机引物,从中筛选出了两条供受体双亲中表现出差异的引物:H(TCG TGT TGC T)和3(CTC AGC CCA G)。 7 运用形态学、细胞生物学和分子生物学的方法鉴定获得的68株再生植株,其中32株为杂种植株。同时证明在非对称融合杂种植株鉴定中,必须采用多种鉴定方法才能得到可靠的结果。 8 随着紫外线辐射剂量的增加,融合细胞的分裂进程无明显变化,但是形成的愈伤组织的数量有明显减少的趋势。
司家钢[10]2001年在《利用原生质体非对称融合转移胡萝卜瓣化型细胞质不育性的研究》文中进行了进一步梳理胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育性常规回交转育一般至少需要5-6年的时间，原生质体非对称融合方式转移这种雄性不育性可使时间大大缩短，从而加快育种的进程。本试验在Tanno Suenaga等的研究基础上，对胡萝卜原生质体非对称融合的基础体系进行了较广泛的研究；进行了61次胡萝卜种内原生质体非对称融合，从19次融合中获得愈伤和胚状体，从6个组合获得了植株再生；对再生植株进行了形态学、细胞学和分子生物学鉴定。主要研究结果如下： 1.基因型是影响胡萝卜固体培养和细胞悬浮培养中愈伤组织状态的重要因子，并由此影响到分离原生质体的产量和质量，进而影响原生质体的愈伤再生和植株再生，因此，在进行胡萝卜原生质体非对称融合前首先对基因型进行筛选是必要的。 2.通过麦芽提取物和谷氨酰胺两种物质的添加，可以起到抑制非胚性愈伤生长的作用，使培养物主要以胚性愈伤为主；通过液体培养基2，4-D浓度的改变，可调节胚性愈伤处于合适的发育时期，便于原生质体的分离。 3.通过胡萝卜原生质体培养愈伤和胚状体发生过程的观察，认为胡萝卜原生质体培养胚状体的直接来源是愈伤组织，而不是原生质体细胞本身。 4.UV和X-射线的作用机制相似，原生质体对UV射线更为敏感。UV辐射可以很好地起到抑制原生质体再生和愈伤组织生长的作用，可以用作胡萝卜的供体处理；UV和X-射线辐射处理供体原生质体都存在处理效果不稳定的情况，因此在融合杂种筛选中应着重注意淘汰供体基因型；IOA抑制胡萝卜原生质体细胞分裂的适宜剂量是15mM浓度处理10min，其处理效果稳定。 5.Ca~(2+)离子浓度过高，使原生质体在交流电场下不能串珠状连接，从而影响电融合，胡萝卜原生质体电融合Ca~(2+)离子的适宜浓度为0.5mM；优化的胡萝卜原生质体电融合参数是：交流电场（AC）70V/cm，作用时间60s；直流电场（DC）1500V／。m，5次脉冲，间隔卜，直流脉冲印加时间50 K 6．STS。标记与胡萝卜瓣化型胞质雄性不育性密切相关，可以用作胡萝卜体细胞杂种瓣化型胞质雄性不育性的分子鉴定，并可用于胡萝卜一代杂种的纯度鉴定。 7．愈伤组织的植株再生是制约胡萝一卜对称融合转移胡萝卜雄性不育性最终能否成功的一个重要环节，内源激素的调控与植株再生相关。此外，原生质体预处理的后效应也是值得考虑的因素。影响胡萝卜融合体愈伤植株再生的因子是今后研究的重要内容。 8．温度是影响胡萝卜再生植株移栽成活的主要因素。胡萝卜组培苗较耐低温，10度左右的平均温度下仍能移栽成活，但是对于高温忍耐性较差，平均温度为30度以上的高温情况下，难于移栽成活。 9．通过形态学、细胞学和分子生物学鉴定，确认组合7－0－8－4＋66－3的再生植株为胞质杂种，成功通过非对称融合方式将供体7．0．8．4的瓣化型胞质雄性不育性转移到受体66－3中，认为原生质体非对称融合可以成为转育胡萝卜瓣化型胞质雄性不育性的补充手段。 论文对影响胡萝卜原生质体非对称融合的若干因子、组培茵的先期抽墓、利用非对称融合转移胡萝卜瓣化型雄性不育性的可行性、本研究存在的问题及改进方案以及非对称原生质体融合在胡萝卜资源创新中的应用价值等进行了讨论。
参考文献：
[1]. 烟草种间胞质杂种、对称体细胞杂种的获得及其分子标记鉴定[D]. 孙玉合. 浙江大学. 2004
[2]. 花椰菜与黑芥非对称体细胞杂种的获得与鉴定分析[D]. 张丽. 首都师范大学. 2007
[3]. 柑橘雄性不育胞质杂种创造及相关基础研究[D]. 蔡小东. 华中农业大学. 2006
[4]. 花椰菜和大白菜新种质创制[D]. 盛小光. 南京农业大学. 2009
[5]. 小麦远缘体细胞杂交及体细胞杂种的遗传研究[D]. 向凤宁. 山东大学. 2003
[6]. 马铃薯与茄子原生质体融合创制新资源研究[D]. 喻艳. 华中农业大学. 2013
[7]. 柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究[D]. 徐小勇. 华中农业大学. 2006
[8]. 植物远缘体细胞杂种的核/质基因组组成及其代谢转录组研究[D]. 蔡云飞. 山东大学. 2006
[9]. 原生质体非对称融合向花椰菜转移Ogura萝卜胞质雄性不育性的研究[D]. 惠志明. 河北农业大学. 2005
[10]. 利用原生质体非对称融合转移胡萝卜瓣化型细胞质不育性的研究[D]. 司家钢. 中国农业科学院. 2001
标签：农作物论文; 细胞系论文; 基因组论文; 愈伤组织论文; 原生质体论文; 染色体结构变异论文; 分子标记论文; 融合基因论文; 马铃薯论文;