利用CRISPR/Cas9技术建立小鼠Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除新型胚胎干细胞系

论文摘要

胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具.胚胎干细胞的基因敲除模型在基因功能研究中起着重要作用.我们利用实验室现有的G3-AH和tWG3II-2两种胚胎干细胞系,通过脂质体转染嘌呤霉素（puromycin）标记的PX459-sgRNA载体,使用CRISPR-Cas9技术分别构建Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除的胚胎干细胞系,通过基因型鉴定、PCR产物测序、qPCR和Western Blot等实验得到Bdh2、Dnmt3a和Dusp9纯合缺失的胚胎干细胞系.之后,qPCR、免疫荧光染色分别检测了Bdh2、Dnmt3a和Dusp9缺失的胚胎干细胞中多能基因、DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因表达变化.另外,通过嵌合体制备方法检测Dusp9基因敲除对胎儿卵黄囊（yolk sac）和胎盘（placenta）等发育的影响.实验结果表明,KO细胞系中分别敲除的基因（Bdh2、Dnmt3a和Dusp9）在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低（p<0.05）,且不同程度地影响了DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因的表达.Dusp9KO嵌合体结果显示,Dusp9KO均能贡献到胎儿及卵黄囊,但是,能否贡献到胎盘尚待进一步深入探究.本研究成功获得纯合敲除Bdh2、Dnmt3a和Dusp9基因的胚胎干细胞系,为研究Bdh2、Dnmt3a和Dusp9三种基因在胚胎干细胞中的作用提供了重要依据.

论文目录

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要试剂

1.1.1 胚胎干细胞和载体

1.1.2 主要试剂

1.2 PX459-sgRNA重组质粒的构建

1.2.1 设计靶向sgRNA

1.2.2 引物退火磷酸化

1.2.3 连接

1.2.4 转化

1.2.5 菌落鉴定

1.3 细胞转染

1.4 KO细胞系的鉴定

1.4.1 电泳检测

1.4.2 Western blot法检测：

1.4.3 实时荧光定量PCR检测

1.4.4 数据统计和分析

1.5 小鼠胚胎的获得及嵌合体小鼠的制备

1.6 技术路线

2 结果

2.1 建立Bdh2KO ESCs及相关基因表达分析

2.2 建立Dnmt3aKO ASCs及相关基因表达分析

2.3 建立Dusp9KO ASCs、相关基因表达分析及嵌合体制备

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 付宇婷,曹硕,陈杨林,吴宝江,多曙光,李喜和,包斯琴

关键词: 胚胎干细胞

来源: 内蒙古大学学报(自然科学版) 2019年05期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学生命科学学院蒙古高原动物遗传资源研究中心,内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司,中国科学院动物研究所实验动物中心

基金: 国家自然科学基金项目(31560335)

分类号: Q78

DOI: 10.13484/j.nmgdxxbzk.20190504

页码: 501-512

总页数: 12

文件大小: 3184K

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