窦君[1]2003年在《波动生长过程中细菌CGC形成自组织机制实验研究》文中研究说明本文实验研究细菌由繁殖体到潜生体反复进行的波动生长过程，旨在阐明波动生长形成宏观有序结构的自组织机制。以细菌潜生体为主要研究对象，进行实验分析。采用特殊的波动培养和显微培养技术观察潜生体形成动态；应用原子力显微镜扫描，比较细菌潜生体与繁殖体在细胞壁外层结构和鞭毛数量的差别；用透射电镜观察细胞壁完整性，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外膜蛋白的改变，并通过实验分析多种物质和因素对潜生体形成的影响。结果显示细菌生长形成菌落，消耗营养，排除废物，导致环境远离平衡。同时，细菌自身发生结构和功能改变，以适应改变的环境。细菌的变化包括菌体纤细化，生理上代谢低下，但是运动活泼。废物扩散和潜生体主动运动两者之间速度的差异，是潜生体自组织形成的物质基础和环境条件。另一方面，细菌连续释放生物波调控因子，促使已经形成的潜生体在特定部位断裂成为繁殖体。这正反映出自我调控机制的存在。在此过程中，细菌代谢减慢，促使潜生体形成。此项工作不仅揭示了波动生长有序结构的机制，而且深刻地认识到细菌以高度适应能力伴随人类生存。
刘俊康, 袁泽涛, 王源, 徐启旺[2]1999年在《生物波特点的实验观察》文中指出以细菌是多细胞有机体的观点，实验观察群体细菌波动生长的特点，发现细菌节律性生长的自组织过程中表现出生物波的开放性、单向性、适应性、节律性、稳定性、趋化性及同步性等特点。关于这些特点的认识方式对生物波的研究有较大的理论和实用价值。
尹华立[3]2011年在《始旋链霉菌普那霉素生物合成相关基因的克隆、功能和表达研究》文中研究表明普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素类抗生素,由普那霉素Ⅰ和普那霉素Ⅱ两类化合物组成。主要用于治疗由革兰氏阳性菌包括耐药菌引起的感染。抗生素的生物合成由抗性基因、结构基因及调控基因共同协调表达而完成。链霉菌具有复杂的形态分化与次级代谢,其代谢途径是由生物合成酶、一些特异的信号分子和调控蛋白所组成的网络体系,但到目前为止,仅鉴定出17个和普那霉素生物合成相关的基因,所以探寻与普那霉素生物合成相关的新基因有着巨大的空间。根据此目的,利用大肠杆菌与链霉菌接合转移技术而展开了对基因功能研究的系列工作。首先对课题组前期以与普那霉素生物合成密切相关的新基因afsk-like为探针从始旋链霉菌F618基因组文库中筛选得到含有约8kb的DNA片段上的afsk-like全长基因spy1进行基因中断实验研究。从研究结果推断该基因可能与普那霉素ⅠA生物合成正相关,而与普那霉素ⅡA生物合成负相关。由于抗生素的生物合成基因大多是呈簇存在于染色体上,所以接着对筛选到的经测序的8kb的DNA片段进行分析,获得了其上的另外4个可能与普那霉素生物合成相关基因,分别命名为spr1、spr3、spr4、spr5,同时对其进行了基因中断研究。研究结果表明这4个基因可能与普那霉素、普那霉素ⅠA及普那霉素ⅡA均为正相关。最后本文利用与普那霉素生物合成正相关性的抗性基因ptr及链霉菌强启动子ermEp*,通过对其强表达进行了分子育种研究。经过初筛及普那霉素复筛后得到一株普那霉素高产菌株P6-SP,其普那霉素、普那霉素ⅡA及普那霉素ⅠA的产量分别达到335.49mg/L.286.12 mg/L.49.37 mg/L;分别为出发菌株F618的2.29、2.56、1.41倍；并且经传代5次试验表明具有较好的遗传稳定性。
杨朝晖[4]2007年在《基于分子生态学技术的环境微生物群落结构与功能的研究》文中研究说明微生物是废水处理、城市生活垃圾填埋或堆肥处理等系统中的主要功能生物,充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据;此外,污染环境的土着微生物也是污染自净的重要作用者,深入了解其存在状况可以为这些污染环境的原位或异地恢复提供有力的微生物学根据。但是,目前研究环境微生物群落的主要方法仍是基于培养和分离纯化的传统技术,已经无法满足研究者对环境微生物进行快速、准确的分析与鉴定的要求。利用基于16S rRNA/rDNA序列分析的分了生态学技术,研究者可以在不对微生物进行分离培养的情况下对其进行研究,甚至还可以利用原位核酸杂交和原位PCR技术对特定环境中的微生物进行原位分析鉴定,并对微生物群落的结构和功能进行研究,结果快速、准确。本论文提出和改进了溶菌酶法、超声波破碎法和蛋白酶K—CTAB法等3种方法从环境样品(本论文中以复杂的堆肥为例)直接提取微生物DNA,细胞直接计数表明叁种方法对细胞的破碎效率均达到了94%以上,分光光度法检测表明纯化后的DNA中腐殖酸浓度低于20ng/μl,A_(260/280)值为1.7～1.8,使用16S rDNA引物对27F/1495R和GC341F/907R进行PCR扩增,均得到了特异性很强的扩增产物,利用PCR产物进行的限制性片段长度多态性分析和变性梯度凝胶电泳分析都表明,3种方法提取的DNA中有一致的微生物遗传多样性,因而能够应用于环境微生物分子生态学研究。为了初步了解堆肥中的细菌群落及其动态变化情况,使用餐厨垃圾进行为期18天的小规模堆肥,高温阶段(温度高于50℃)共7天,最高温度达到65℃,使用蛋白酶K—CTAB法从偶数天和高温阶段堆肥样品中提取总DNA,并使用16SrDNA引物对GC341F/907R进行PCR-DGGE分析,结合统计分析、条带测序和系统发育分析对其中的细菌进行分子生态学研究。结果表明随温度升高,堆肥中细菌多样性下降,不同时期的优势菌群不同,高温阶段细菌种群以嗜热的芽孢杆菌属细菌为主。同时,采用自主设计的SBBR反应器处理氨氮浓度含量较高的垃圾填埋场渗滤液并对其细菌的群落结构和脱氮机理进行分析。在保持(32±0.4)℃的环境温度下,经过58d的驯化和33d的稳定,SBBR反应器的脱氮效率最高达到95%。实验结果表明,高频间歇式曝气方式在抑制了硝酸细菌的活性的同时也消除了亚硝酸盐浓度和pH大幅波动对亚硝酸细菌和厌氧氨氧化细菌活性的影响;在曝气阶段,溶解氧浓度被控制在1.2～1.4 mg.L~(-1),亚硝酸细菌成为主体细菌,亚硝酸盐积累;在缺氧阶段,厌氧氨氧化细菌成为主体细菌,曝气阶段积累的亚硝酸盐与氨氮同时被去除。为了研究序批式生物膜反应器中脱氮细菌的群落结构、种群变化及主要生物脱氮途径情况,使用统计分析、16S rDNA克隆测序和系统发育分析对生物膜细菌进行分子生态学研究。结果表明,载体上形成了种群比较丰富、群落结构与功能比较稳定的生物膜,其中包括好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌、大量的硝化细菌和厌氧反硝化细菌;在运行过程中的不同周期和单个周期的不同时刻,细菌群落组成都没有发生明显的变化;驯化的生物膜中的细菌可能主要来自于渗滤液,而用于接种的常规污水处理厂污泥对脱氮生物膜的形成贡献可能并不大。亚硝化-厌氧氨氧化-反硝化途径是反应器主要的脱氮途径,通过该途径去除的NH_4~+-N占总去除量的65%以上;另外2条途径则分别是亚硝化-反硝化途径以及全程硝化-反硝化途径。所有途径都采取同步和分步2种方式完成,同步方式以曝气阶段的氮素亏损形式予以表现。分步方式则依靠各种脱氮微生物在曝气阶段和厌氧阶段不同的活性程度完成。另外,为进一步控制反应器运行成本,在3种不同的低温驯化策略下启动3套规格相同的厌氧序批式生物膜反应器(ASBBR),在对运行过程中氮素变化规律进行分析的同时,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对生物膜上的细菌种群结构进行分析,初步考察了厌氧氨氧化的活性.结果表明,对应a1、a2和a3 3种不同的低温驯化策略,A1、A2和A33个反应器分别经过62、56、70d的驯化后表现出不同的厌氧氨氧化活性。以氮素转化效率作为衡量标准,其活性依次为A3＞A1＞A2。DGGE分析进一步说明在不同的驯化策略下,反应器表现出不同的种群多样性,但种群结构基本保持一致;在接种物相同的策略中,降温幅度对种群多样性的影响与其对厌氧氨氧化活性的影响具有一致性。
王伟[5]2012年在《桉树对枝瘿姬小蜂抗性及其机制研究》文中认为本研究对我国广东省桉树受枝瘿姬小蜂危害现状进行调查，并对尾叶桉60个无性系受桉树枝瘿姬小蜂危害进行调查，同时收集国内主要桉树树种和大面积种植的桉树品系24个，拟从桉树品系在受枝瘿姬小蜂危害前后营养物质代谢、次生代谢产物以及防御酶等方面含量的变化、以及对不同抗性类型基因或基因组表达差异方面进行研究，对桉树抗枝瘿姬小蜂的机理进行探索，为今后选育更加优良高抗的桉树品种，同时为今后通过基因工程培育优良品种提供科学依据，对桉树资源的开发利用具有重要的意义，最终获得以下结论：（1）桉树枝瘿姬小蜂在广东省危害最严重的地方主要集中在湛江地区和茂名地区，在阳江地区和江门地区危害较轻，粤北地区桉树枝瘿姬小蜂危害呈零星分布。主要危害树种为巨细桉、窿缘桉以及巨桉。在苗圃，桉树枝瘿姬小蜂危害大部分桉树幼苗。危害症状：新梢和顶芽生长明显受到抑制，节间变短，苗木呈丛生状，在林地，主要危害一年生以下幼林，小蜂危害导致新梢不能正常生长，节间变小，基本不能成林，严重时可造成部分植株枯死，林木产量严重下降；（2）通过60个尾叶桉无性系对枝瘿姬小蜂抗性的研究，尾叶桉无性系虫害等级重复力较高，表明尾叶桉无性系对桉树枝瘿姬小蜂的的抗性是受基因控制的，且该基因型能够在试验地区内不同重复的环境下稳定表达，可以通过选择获得高抗的优良品系。结合60个尾叶桉无性系5年生和7年生时生长性状数据，通过逐步独立淘汰法对抗虫和速生的尾叶桉无性系进行筛选，最终获得了6个高抗且优质、速生优良无性系；（3）模拟24个参试桉树品系在自然环境下遭受桉树枝瘿姬小蜂危害过程，根据其受桉树枝瘿姬小蜂危害程度进行抗性鉴定，结果表明：参试的24个品系中，高抗品系10个（尾叶桉品系A107、T121和D48，细叶桉品系Et16，以及窿缘桉、邓恩桉、柠檬桉、大花序桉、M1、GL9）、中抗品系12个（细叶桉品系Et12、Et09和巨桉品系KX8、KX3、KX12，以及雷11、DH1961、LH1、雷9、DH42-6、DH32-26和DH32-29）和高感品系2个（窿缘桉和DH201-2）；（4）对24个桉树品系在桉树枝瘿姬小蜂危害前后营养物质的变化研究结果表明：叁种抗性类型的桉树品系，随着桉树枝瘿姬小蜂危害加剧，桉树不同品系的可溶性蛋白含量都出现了一定程度的上升，高感品系的可溶性蛋白含量的增长显着，而高抗和中抗品系可溶性蛋白含量的增长未达到显着差异；不同桉树品系的可溶性糖含量在受害前差异显着，受害后桉树叶片内的可溶性糖含量则出现一定增长，尤其是高感品系，极显着高于高抗品系和中抗品系，中抗品系可溶性糖含量较之前也有显着增加，高感品系可溶性糖含量略有增加，但均未达到显着差异，说明桉树叶片内营养物质含量变化与其对枝瘿姬小蜂的抗性存在一定的相关性，可溶蛋白含量的变化与其抗性大小呈负相关，可溶性糖含量的变化与其抗性大小呈正相关；（5）对24种不同桉树品系在遭受枝瘿姬小蜂危害前后桉树叶片内防御酶活性的动态变化研究结果表明：在遭受小蜂危害后叶片内SOD、POD和PPO活性都产生了显着变化。受害前，叶片内SOD、POD和PPO活性都表现为高抗品系>中抗品系>高感品系；受害后，叶片内POD活性持续升高，高抗品系叶片内POD活性变化幅度大于高感品系；叶片内SOD活性出现先升高后下降的趋势；PPO活性升高，高抗品系、中抗品系叶片内PPO活性明显高于高感品系，而在遭受危害两个月后，叶片内PPO活性出现下降，但高于危害前活性水平；桉树遭受危害后，防御酶都表现出升高趋势，这说明防御酶对枝瘿姬小蜂的危害产生较快的应激反应，尤其是高抗品系，其叶片内防御酶活性及受害后增加幅度都远高于高感品系；（6）通过对24个桉树品系遭受桉树枝瘿姬小蜂危害前后次生物质含量的变化进行研究，结果表明桉树品系遭受枝瘿姬小蜂危害后，叶片内类黄酮含量明显上升，高感品系类黄酮含量和增长水平明显低于其他抗性类型的品系；而桉树叶片内单宁含量的动态变化规律表现为：高抗品系单宁含量明显高于高感品系，但随着进入小蜂危害期，其叶片内单宁含量出现一定程度下降，但随后叶片内的单宁含量持续上升，其原因可能是早期应激反应引起叶片内单宁消耗，随后植物产生主动抗性反应导致单宁含量的增加；（7）本研究选择了高抗品系尾叶桉A107（样品B）和高感品系DH201-2（样品A）进行转录组测序，测序结果通过De novo组装、差异表达基因筛选等技术手段筛选出971条差异表达基因，1224条特异表达基因；对差异基因序列进行BlastP分析，抗性基因功能分析最终选取了19个关联基因进行实时荧光定量检测，结果表明，19个关联基因中，除了基因G16扩增异常外，其余18个关联基因都获得了较好的特异性扩增，其中，关联基因G1、G5、G9、G10、G18和G19在B样品中的平均表达量显着高于其在样品A中的平均表达量，关联基因G3、G4和G11在A样品中的平均表达量显着高于其在样品B中的表达量；其余关联基因在2个样品种表达量差异不显着。关联基因G1、G3、G4、G5、G9、G10、G11、G18和G19可能与桉树对枝瘿姬小蜂的抗性有关，可用于下一段的基因分离、克隆和转基因研究。
张禹清[6]2005年在《海洋粘细菌细胞行为及其分子机制研究》文中认为粘细菌曾被普遍认为是典型的土壤细菌类群,主要是由于早先绝大部分粘细菌是从土壤生境中分离的,并且它们的多细胞行为和完整生活史也都是在固体介质表面上完成的。虽然,粘细菌在液体培养基中可以生长,但却一直未能证明水环境中有休眠细胞的发育。因此,尽管在水环镜中也偶有粘细菌分离的报道,但Reichenbach和Dawid认为,粘细菌是陆生的细菌类群,水环境中分离的粘细菌其实是从土壤中冲入水中,并以休眠状态存活的子实体中粘孢子的萌发物。 1998年Iizuka等根据16S rDNA序列与粘细菌中小囊菌属(Nannocystis)有89.3%和83.2%的同源性,认为从海洋中分离的两株嗜盐细菌为海洋粘细菌。1999年Ravenschlag等在构建海底沉积物细菌16S rDNA文库的基础上,通过特异性探针杂交方法证明在其分析的样品中可能存在粘细菌的类群。我们通过特殊的分离方法也在海洋样品中分离并纯化得到了耐盐生长的多株粘细菌。由于海水条件下并不能提供粘细菌分化发育形成子实体的自然环境,也不能保证粘孢子的高密度从而开始一个新的生命周期。这些“海洋”粘细菌在海水环境里是如何存活并定殖的?这成为了一个令人感兴趣并且富有挑战性的课题。 本文在充分研究了分离得到的海洋耐盐粘细菌的分类特征的基础之上,将其同一株嗜盐海洋粘细菌(Haliangium ochraceum SMP-2)进行了微生物学性质的比较分析,包括在海水和淡水的固体及液体培养基中生长和发育相关特征,生长后期的球形细胞的抗逆性质和细胞密度依赖性差异等方面。在国际上首次报道了这一类群粘细菌的在海洋和陆地生境中可能具备的不同的生活方式和分化发育周期,提出了粘细菌在海洋生境存活并定殖的可能模式,为揭示粘细菌的起源进化提供了线索。 耐盐粘球菌HW-1、128-7、125-1和125-10-1均分离自海洋样品,其中HW-1和125-10-1可以耐受全海水生长。依据粘细菌的经典形态学分类方法,对其进行初步分类鉴定。详细研究了这几株耐盐粘细菌的细胞形态学特征,包括营养细胞的形状和大小、粘孢子的形态和大小、子实体的形态、菌落的形态、色素等。在测定G+Cmol%时,对化学水解(高氯酸法和甲酸法)和生物酶水解(磷酸二酯酶Ⅰ和牛肠粘膜碱性磷酸酶)DNA的水解条件和产物进行了分析,改善了分
汪丹[7]2011年在《棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰》文中认为棉铃虫Helicoverpa armigera (Hiibner)是一种世界性的重要经济害虫。自20世纪八十年代以来,高效、低毒的拟除虫菊酯类杀虫剂被广泛用于防治棉铃虫。然而,由于杀虫剂频繁且不合理的使用,棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平逐年提高,并成为引起90年代初我国北方棉区棉铃虫大暴发的重要原因之一。抗性机理研究表明细胞色素P450氧化酶活性增强在棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性中起主要作用。NADPH-细胞色素P450还原酶(EC 1.6.2.4, NADPH-cytochrome P450 reductase,简称CPR)是细胞色素P450氧化还原酶系的重要组成部分,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用。本文采用RACE策略得到了棉铃虫CPR基因(Ha_CPR)的全长cDNA序列,研究了这个基因在棉铃虫体内的时空表达,并分别通过喂食和注射dsRNA两种方法干扰Ha_CPR基因的表达,观察Ha_CPR基因沉默后棉铃虫对杀虫剂的毒力、解毒代谢酶活力和生长发育的影响,以期为深入研究细胞色素P450酶系在棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性形成及棉铃虫的生长发育过程中的作用提供一定的理论基础。1.棉铃虫Ha_CPR基因的克隆与分析采用RT-PCR和RACE策略克隆出棉铃虫CPR基因Ha_CPR的全长cDNA序列(GenBank登录号为：HQ116527)。Ha_CPR基因的全长cDNA序列大小为2232bp,开放阅读框为2061bp,编码687个氨基酸,具有CPR蛋白的典型结构域,如FMN结合域、FMN连接域、FAD和NADPH结合域,保守氨基酸残基如Y149、Y187、Y467、Y489和W686。获得的棉铃虫CPR基因Ha_CPR与甘蓝夜蛾的CPR基因的相似性最高,为96%,与其它昆虫CPR的相似性为70%-89%。2.棉铃虫Ha_CPR基因的时空表达采用实时荧光定量PCR方法,比较了Ha_CPR基因在棉铃虫不同发育阶段及不同组织部位的表达情况。结果表明Ha_CPR基因在棉铃虫整个发育阶段及不同组织部位均有表达,卵期至幼虫期表达量逐渐升高,在3-4龄期达到最高,随后下降,蛹期降至最低,羽化后表达量再次升高。各时期的表达量分别为5龄期表达量的0.59(卵期)、1.46(1～2龄期)、1.54(3～4龄期)、0.26/0.19(雌蛹/雄蛹)和1.21/1.29(雌虫/雄虫)倍；Ha_CPR基因在棉铃虫5龄幼虫不同组织的表达分析结果表明,中肠部位表达量最高,脂肪体次之,头部最低,其表达量依次是整体表达量的3.61、1.29和1.08倍。3.棉铃虫Ha_CPR基因沉默后对杀虫剂毒力及代谢酶活力的影响通过喂食或注射的方式将Ha_CPR基因的dsRNA导入棉铃虫3龄或5龄幼虫体内,研究该基因沉默后对杀虫剂毒力及棉铃虫代谢酶活力的影响。敏感品系SCD、拟除虫菊酯抗性品系XJ和AY-R的3龄幼虫在喂食dsRNA(0.8μg/μl×2.5μ1)后,Ha_CPR基因的mRNA相对表达量与对照相比分别下降了49%(57%)、26%和23%。生物测定结果表明氰戊菊酯、溴氰菊酯和久效磷对叁个品系处理组的毒力均有不同程度的下降,处理组与对照组间LC50比值为0.34～0.80,但在XJ和AY-R品系中,氰戊菊酯对处理组LC50的95%置信区间与对照组重迭。叁种药剂单浓度下的死亡率T-test分析结果表明：(1)SCD品系,氰戊菊酯浓度为0.01mg/ml和0.02mg/ml时,处理组与对照组间的死亡率存在极显着差异；溴氰菊酯浓度为0.0025mg/ml时存在极显着差异。(2)XJ品系,氰戊菊酯浓度为0.08mg/m1时,处理组与对照组间的死亡率存在显着差异。(3)AY-R品系,氰戊菊酯浓度为25.6 mg/m1时,处理组与对照组间的死亡率存在显着差异。研究结果表明Ha_CPR基因的沉默能够在一定程度上增强棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性,而对久效磷类杀虫剂则无影响。AY-R品系1日龄5龄幼虫在注射dsRNA(14μg,10μl)进行基因沉默后,Ha_CPR基因在中肠和脂肪体中的mRNA相对表达量与注射缓冲液(10μ1)的对照组相比分别下降了12%和25%。酶活力测定结果表明处理组与对照组间的多功能氧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶以及羧酸酯酶活力均无显着差异。4.Ha CPR基因沉默后对棉铃虫生长发育的影响通过喂食方式将Ha_CPR dsRNA导入SCD品系棉铃虫3龄幼虫体内,研究了Ha_CPR基因沉默后对棉铃虫生长发育的影响。SCD品系3龄幼虫在喂食dsRNA(0.8μg/μl×2.5μl)进行基因沉默后,Ha_CPR基因的mRNA相对表达量与对照组相比下降了49%。在基因沉默后幼虫的整个发育过程中,处理组与对照组的3龄和4龄幼虫历期无显着差异,但在5龄幼虫期和预蛹期存在极显着差异,即处理组历期明显长于对照组；处理组幼虫体重在基因沉默后的第1、3和7天显着高于对照组；化蛹过程中,处理组与对照组间的蛹重和化蛹率均无显着差异；羽化过程中,处理组比对照组推迟一天羽化,但两组间的羽化率和残翅率均无显着差异；在整个发育历期中,处理组与对照组试虫的死亡率均呈上升趋势,但无显着差异。研究结果表明Ha_CPR基因对棉铃虫生长发育有一定程度延缓发育的作用,但在整个发育过程中并不起到主要作用。
胡凤[8]2009年在《毛脉酸模内生真菌化学成分的分析及其分子鉴定》文中认为毛脉酸模(Rumex gmelini Turcz.)为蓼科酸模属植物。民间以根入药,对淋病、上呼吸道感染性疾病、癣病和疮毒有确切疗效,具有抗肿瘤、抗真菌、镇咳平喘、降压、抗病毒和抗氧化等作用。本文对毛脉酸模进行了以下研究:本实验对毛脉酸模内生真菌的化学成分进行分析,考察了毛脉酸模不同组织中内生真菌化学成分的相关性、42株内生真菌之间化学成分的相关性、计算了内生真菌中优势菌群化学成分的相似度。薄层层析的结果显示,各组织中化学成分相关性高的内生真菌菌株属于同一种属,且根、叶中内生真菌化学成分的相关性比茎中内生真菌化学成分的相关性高;HPLC分析的结果显示,部分内生真菌菌株与毛脉酸模之间存在一定的化学成分相关性,内生真菌与其所分离的组织部位之间存在一定的化学成分相关性,相同菌属的内生真菌之间存在一定的化学成分相关性;通过相似度分析,曲霉属、链格孢属、丝核属内生真菌中相似度较高的菌株大都是从毛脉酸模的同一组织分离。通过TLC及HPLC检测,筛选出8株与毛脉酸模有相同或相似成分的内生真菌,其中菌3、菌7含有大黄酸,菌18含有大黄酚,菌12含有大黄酸和大黄素,菌4、菌11、菌52和菌32含有酸模素苷。通过对所筛选出的8株菌进行rDNA扩增、测序及遗传进化的分析,并结合前期基础的形态鉴定,可知菌3为泡波曲霉属真菌Emericella nidulans、菌7为曲霉属真菌Aspergillus variecolor、菌4为镰刀孢属(Fusarium)真菌、菌12为刺盘孢属真菌Colletotrichum destructivum或Colletotrichumhigginsianum的一种、菌32为链隔孢属真菌Alternaria brassicae、菌18为泡波曲霉属真菌Emericella falconensis、菌11为链隔孢属真菌Alternaria alternata、菌52为链隔孢属(Alternaria)真菌。本实验分析了毛脉酸模及其内生真菌化学成分的相关性,筛选出8株与宿主有相同或相似化学成分的内生真菌,为今后毛脉酸模内生真菌资源的开发和应用奠定基础,而且为天然药物的开发提供了新的思路。
冯强[9]2003年在《重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究》文中指出大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin, LT）是一种能导致人畜腹泻的毒性因子，为产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia, ETEC）产生的六聚体蛋白。除了很强的毒性以外，LT 具有很强的免疫原性并且能够辅佐其他抗原通过粘膜免疫途径使机体产生特异抗体，因而 LT，尤其是其无毒或低毒突变体，还是良好的粘膜免疫佐剂，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要医学价值和经济价值。另外，由于 LT 是由一个具有毒性的 A 亚单位（LTA）和形成环状的五个能够与神经节苷脂 GM1 结合而粘附于真核细胞膜上的 B 亚单位（LTB）组成，结构与功能都很复杂，不同位点的氨基酸突变会对其高级结构和功能产生各不相同的影响，因而研究 LT 的突变体，不但可以筛选出可以应用于临床的侯选粘膜免疫佐剂，而且还可拓宽我们对蛋白质结构与功能的认识。 研究目的：获得适应中试规模生产、具较高表达效率的 LT 及 LT 的 B 亚单位（LTB）表达系统。通过对 LT 的表达、纯化及保存的方法进行探索，寻找到 LT优化的表达、纯化及保存方案。初步筛选出毒性较小、粘膜免疫佐剂活性较高的LT 突变体，同时就氨基酸突变对 LT 结构与功能的影响作一些理论探讨。 研究方法：通过用改良的基因组提取方法从野生型产毒性大肠杆菌中提取到lt 基因。利用基因工程技术将其重组于表达载体中并转化宿主菌，在摇瓶中筛选优化的表达系统。改变 Immobilized D(+)-galactose 亲和柱平衡缓冲液及目的蛋白洗脱液的成分及 pH 值，优化纯化方案。通过对不同保存条件下的 LT 用 HPLC 作分子筛层析判断 LT 结构稳定性筛选出最佳保存方案。利用基因工程的定点突变技术，构建 LT 突变体。用在分子筛层析洗脱液中加入 1%SDS，观察在洗脱过程中 A280nm的区别判断 LT 与突变体之间结构稳定性的差异、从胰酶消化后 LTA 裂解出 LTA1的多少判断 LT 及突变体对胰酶的敏感性、用在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞毒性检测中导致 CHO 细胞变形的剂量和程度及在 Patent-mouse 活体毒性检测中导致肠内液体的多寡判断 LT 及突变体的毒性。LT 突变体的粘膜免疫佐剂效应由下述方法进行评价：将 LT 突变体作为幽门螺杆菌（Hp）尿素酶 B 亚单位（UreB）的佐剂，口服免疫 BALB/c 小鼠，用 ELISA 法检测血清及粘膜部位抗原特异的抗体水平、用 ELISPOT 法观察肠派伊尔结（PP 结）抗体分泌细胞、用 RT－PCR 法检测细胞因子的差别表达并与其他佐剂及疫苗进行比较。 研究结果： 1、用改良基因组提取法从野生型产毒大肠杆菌中提取到含 lt 基因的质粒。 2、 在生长于改良 M9－CAA 培养基的含 pET11c-LT 重组质粒的 E.coli I<WP=6>重庆大学博士学位论文BL21(DE3)中以约 46mg/L 培养基的较高效率分泌表达出重组 LT。 3、 LT 在纯化后马上冻干并保存于 4℃可以长久保持其完整的六聚体结构。该法可避免 LT 以液态形式在缓冲液中 4℃或－70℃保存一定时间后发生解聚现象。 4、 构建了 LTK63（第 63 位氨基酸由 S K），LTR72（第 72 位氨基酸由 A R）和 LTKR（第 63、72 位氨基酸分别由 S、A 突变为 K、R）。 5、LTA2 结构域内的第 229、230、232、233 位的 4 个氨基酸由 E、V、I、Y分别突变为与霍乱毒素该 4 个氨基酸相同的 D、I、T、H，命名为 LTDITH，同时构建了 LTK63，LTR72 和 LTKR 的相应的 LTA2 结构域突变体 LTKDITH、LTRDITH和 LTKRDITH。另外还将 LTDITH 的第 232 位氨基酸突变为 Lys，命名为 LTDIKH。 6、 对重组 LT 及其突变体进行了中试规模发酵并纯化后统计发现 A2 结构域特定突变后的 LT，其表达效率大大提高，可达 160mg/L 培养基。 7、 用 HPLC 对野生 LT 及各种突变体进行结构稳定性检测后， A2 结构域特定突变后的 LT 其稳定性大大增加。相对于 LT，LTK63 结构稳定性增加；LTR72结构稳定性降低；LTKR 结构稳定性增加。 8、 LTA2 结构域特定突变后的 LT 的胰酶敏感性降低。LTK63、LTKR 比 rLT及 LTR72 的胰酶敏感性降低。 9、 用 CHO 细胞毒性检测实验和 Patent-mouse 毒性检测实验表明，LTDITH的毒性显着低于 rLT。 10、 pET22b(+)-LTB/E.coli BL21(DE3)表达系统使 LTB 在 pelB 信号肽的引导下既可分泌表达至胞周质，也可使 LTB 以包含体形式存在。分泌表达的 LTB 能用半乳糖亲和柱一步纯化出来，包含体形式存在的 LTB 能通过溶解、缓冲液置换后，再用半乳糖亲和柱纯化，两种方法纯化的 LTB 具有相同的氨基酸组成并且具有正常的免疫原性和 GM1 结合活性。 11、 LT 突变体及 LTB 在与 Hp 尿素酶 B 亚单位（UreB）通过口服途径免疫小鼠后具有明显的佐剂效应，血清 IgG、粘膜部位的 sIgA、PP 结抗体分泌细胞及细胞因子如 IL-4、IFN-γ 的表达都明显增加。 结论：改良的基因组提取方法是提取大质粒的简便方法。用 HPLC 结合分子筛层析可以判断 LT 的结构稳定性。LTK63 对 LT 六聚体的结构还有明显的影响。LTDITH 及基于 LTDITH 的突变体能显着改变 LT 的结构与功能，即增加
庞慧[10]2007年在《大肠杆菌O157：H7菌株EDL933的UTA岛在弗氏枸橼酸杆菌中的分析》文中研究说明将肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株EDL933的基因组序列与大肠杆菌K-12菌株MG1655的的基因组序列比较,发现在EDL933中具有47个长度大于5kb的与细菌毒力、代谢等有关的O岛,O43岛就是其中之一,长度为87kb,其含有尿素酶基因簇、亚碲酸钾抗性基因簇及粘附因子,本室在研究过程中将其命名为UTA岛。本实验研究EDL933中的UTA岛在弗氏枸橼酸杆菌中的分布情况,利用PCR和DNA杂交实验检测UTA岛的尿素酶基因簇( ureDABCEFG)、亚碲酸钾抗性基因簇(terWZABCDEF)、粘附因子及此岛两侧的连接序列(clpA及下游连接序列)共18个基因;同时根据基因簇的不同型别,选取代表性菌株进行该岛序列测定;采用美国CDC的PulseNet实验方法,利用细菌染色体XbaI酶切脉冲场凝胶电泳(Pulse Field Gel Electrophoresis,PFGE)后,进行实验菌株聚类分析(UPGMA方法),以了解枸橼酸杆菌的分子流行病学特征,分析UTA岛的不同型别与PFGE带型之间是否具有相关性;此外还进行实验菌株尿素酶及亚碲酸钾抗性的表型实验。本研究发现:在此弗氏枸橼酸杆菌中发现存在ure基因簇及ter基因簇,较完整的结构分别为ureD-ureA-ureB-ureC-ureE-ureF-ureG, terW–terZ–terA– terB-terC-terD-terE-terF;EDL933中iha位于仅临terF的下方,而通过EDL933的iha与本实验的测序菌株枸72进行序列比对后,得知枸72的iha与ure、ter相聚较远,可能不一同够成毒力岛,因而这里不一并列出。在不同株的枸橼酸杆菌中,UTA岛各有特点,共检测到该岛的八种存在形式。其中六株菌(枸66, 67, 71,72,78和95)具有较完整的UTA岛结构;其余菌株中含不完整的UTA岛形式。在此弗氏枸橼酸杆菌的菌株中,无论是完整的该岛还是仅含ure基因簇或ter基因簇的菌株,其左位点均相同,其右位点基本上也均相同(除枸5,可能是由于基因序列变异较大引起的)。其具体分布如下:枸5: ureA -ureB -ureC-ureE-ureF;枸4、48001、48003的表现形式:ureA-ureB- ureC-ureE- ureF,terE;ureG(-),ter(-),但其它ure(+)的菌株:ureD-ureA- u -reB-ureC-ureE-ureF;枸70、82、94:ureD - ureA-ureB-ureC- ureE-ureF -ureG;枸74: ureD–ureA–ureB–ureC-ureE-ureF,terB;枸2:ureD- u- reA-ureB-ureC-ureE-ureF , terW-terA -terB-terC-terD-terE-terF;枸3:ureD-ureA-ureB-ureC-ureE-ureF , terW-terZ -terA-terB-terC-terD -terE -terF;枸66、67、71、72、78、95:ureD-ureA -ureB -ureC-ureE-ureF-ureG,terW- terZ-terA - terB-terC-terD-terE-terF。使用Bionumerics数据库软件对PFGE图像进行分析,带型与UTA岛的不同型别之间存在相关性,相同PFGE带型的菌株具有相同的UTA岛结构形式,PFGE的带型越相似,其对应菌株的UTA岛结构就越相似。尿素酶的表达与ureD有密切关系,可能个别氨基酸的变异在尿素酶的表达方面起至关重要的作用;另外ureG对于尿素酶的表达影响不大。亚碲酸钾抗性水平与ter簇有密切关系,并且terABCD一般成簇存在,是决定亚碲酸钾抗性的关键性成分;其次terW对于亚碲酸钾抗性水平的提高有一定的促进作用;再者,有些不含ter基因的菌株也具有较高的抗性,可能与ter簇以外的因素有一定的关系,例:teh、tmp等。
参考文献：
[1]. 波动生长过程中细菌CGC形成自组织机制实验研究[D]. 窦君. 第叁军医大学. 2003
[2]. 生物波特点的实验观察[J]. 刘俊康, 袁泽涛, 王源, 徐启旺. 中国微生态学杂志. 1999
[3]. 始旋链霉菌普那霉素生物合成相关基因的克隆、功能和表达研究[D]. 尹华立. 浙江大学. 2011
[4]. 基于分子生态学技术的环境微生物群落结构与功能的研究[D]. 杨朝晖. 湖南大学. 2007
[5]. 桉树对枝瘿姬小蜂抗性及其机制研究[D]. 王伟. 中国林业科学研究院. 2012
[6]. 海洋粘细菌细胞行为及其分子机制研究[D]. 张禹清. 山东大学. 2005
[7]. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰[D]. 汪丹. 南京农业大学. 2011
[8]. 毛脉酸模内生真菌化学成分的分析及其分子鉴定[D]. 胡凤. 黑龙江中医药大学. 2009
[9]. 重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究[D]. 冯强. 重庆大学. 2003
[10]. 大肠杆菌O157：H7菌株EDL933的UTA岛在弗氏枸橼酸杆菌中的分析[D]. 庞慧. 大连医科大学. 2007
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