改性粘土控制褐潮的分子生物学机制研究

论文摘要

近年来,有害藻华（Harmful algal blooms,HABs）已经演变成为一种全球性生态灾害。如何治理有害藻华成为全球研究的热点问题。改性粘土技术因为具有成本低、见效快、对环境无负面影响等优良特性而成为一种应用最为普遍的有害藻华应急处置方法。在应用改性粘土现场治理有害藻华的过程中发现,通过絮凝沉降改性粘土可以直接去除水体中约80%的藻华生物,虽然水体中残留的藻华生物密度依然相当可观,但这部分藻华生物却没有在短时间内再次暴发形成二次藻华。为了探究改性粘土对这些残留藻细胞的影响,完善改性粘土控制有害藻华的机制,本博士学位论文以改性粘土处理后水体中残留的典型有害藻华（褐潮）生物抑食金球藻（Aureococcus anophagefferens）为研究对象,主要利用转录组测序（RNA-seq）和反转录荧光定量PCR（Reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）等分子生物学技术并辅以扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）和原子力显微镜（Atomic force microscope,AFM）技术,从分子生物学角度研究了改性粘土控制褐潮的作用机制。主要结果包括:1.改性粘土对残留抑食金球藻细胞表面形态的影响利用扫描电镜技术研究了改性粘土对抑食金球藻表面形态的影响特征,并利用原子力显微镜技术测定了粘土改性前后表面性质（如活性位点、粘附性）的差异,更深入阐释了粘土改性后能高效抑制残留藻细胞生长的原因。研究发现,改性粘土能够在短时间内直接造成抑食金球藻细胞破裂,有效减少抑食金球藻胞外的多糖类物质并导致部分残留藻细胞发生形变,不仅导致细胞“裸露”,使其更脆弱、更易受侵害,而且这种不可逆的损伤还会抑制其分裂增殖。另外,经聚合氯化铝（polyaluminum chloride,PAC）改性后,粘土颗粒表面活性位点数量增加,粘附力增大,与藻细胞之间的碰撞、静电作用等增强,加剧了粘土颗粒与藻细胞之间的物理、化学作用,对残留藻细胞产生更强的破坏作用,有效地抑制了残留藻细胞生长增殖。2.改性粘土对抑食金球藻基因转录表达的影响利用RNA-seq技术研究了改性粘土作用后残留抑食金球藻细胞内各类基因转录表达随时间的变化,综合分析了相应的多种生理过程的响应特征。研究发现改性粘土会对水体中残留藻细胞造成氧化胁迫,导致基因转录表达发生变化,其中参与光反应过程的基因受影响最大,另外,细胞内众多与胁迫适应及解毒、信号传导及信息交流、细胞膜及细胞骨架、遗传信息传递及细胞周期等生理过程和细胞结构相关的基因也出现显著差异表达（p<0.05）,说明在改性粘土作用下残留抑食金球藻细胞的生理过程发生紊乱,生长受到抑制。研究还发现这些基因出现差异表达的时间顺序有差异:膜通道蛋白基因和创伤修复相关基因在改性粘土作用后的3h即上调表达,而基础代谢相关基因（除光合作用外）直到24h后才出现差异表达,这说明细胞膜和细胞骨架受损是最先发生的,改性粘土颗粒与藻细胞之间的碰撞及电中和效应可能是导致这些生理变化的主要原因。3.改性粘土作用下典型功能基因转录表达的动力学响应为了研究改性粘土对残留藻细胞基因表达动力学的影响,选取了40个典型功能基因,利用RTqPCR技术研究了其在改性粘土作用后6d内转录表达的动力学变化。这些功能基因主要参与抗氧化应激、光合作用、磷脂合成、细胞程序性死亡以及细胞周期调控等5个生理过程。研究发现,选取的各类功能基因其差异表达在动力学上总体呈现“V”型,即在时间序列上出现了两次上调表达,中间有一个低表达的转折点,显示出存在两个主要抑制细胞生长的过程:一个是由粘土颗粒碰撞等作用而直接引起的氧化胁迫过程,该过程扰乱了残留藻细胞的正常生理活动,导致受损藻细胞裂解死亡;另一个则很可能是由裂解细胞释放的信号化合物等诱导而发生的细胞程序性死亡过程,该过程加速了残留藻细胞的死亡,从而进一步控制褐潮的延续与暴发。本博士学位论文的创新点主要体现在:首次利用RNA-seq和RT-qPCR等分子生物学技术从转录层面探究了改性粘土抑制残留藻细胞生长的机制,发现改性粘土会诱导残留抑食金球藻出现细胞程序性死亡的分子生物学特征,揭示了改性粘土控制褐潮的间接作用,完善了改性粘土高效治理有害藻华的作用机制。综上所述,本博士学位论文以改性粘土作用后残留抑食金球藻细胞表面形态变化为切入点,从分子生物学层面研究了改性粘土对残留藻细胞的影响,发现了改性粘土颗粒与残留藻细胞之间的碰撞及电中和效应是抑制残留藻细胞生长的主要外在因素,而胞外多糖类物质的减少,氧化胁迫甚至细胞程序性死亡的发生则是致使残留藻细胞生长缓慢增受抑的主要内在因素。该结果揭示了改性粘土对残留藻细胞的影响,完善了改性粘土控制有害藻华的作用机制,为改性粘土高效控制有害藻华提供了重要参考,对进一步研发新型、高效改性粘土具有重要的科学意义。

论文目录

摘要

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第1章绪论

1.1 有害藻华概述

1.1.1 有害藻华的基本概念

1.1.2 褐潮及其危害

1.2 有害藻华的应急处置方法

1.2.1 应急处置有害藻华的原理与方法

1.2.2 改性粘土控制有害藻华的理论、方法与应用

1.2.3 改性粘土控制有害藻华的作用机制

1.3 分子生物学及扫描电镜技术在微藻研究中的应用

1.3.1 RNA-seq在微藻转录组研究中的应用

1.3.2 RT-qPCR技术在微藻基因差异表达研究中的应用

1.3.3 扫描电镜技术在微藻表面形态研究中的应用

1.4 原子力显微镜技术在粘土材料表面形态/性质研究中的应用

1.5 本论文的研究目标及内容

1.5.1 研究目标

1.5.2 研究内容

1.5.3 拟解决的主要科学问题

第2章改性粘土对残留抑食金球藻细胞表面形态的影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要试剂与仪器

2.2.2 抑食金球藻培养

2.2.3 改性粘土制备

2.2.4 粘土与改性粘土表面性质测定

2.2.5 抑食金球藻表面形态观察

2.3 结果

2.3.1 粘土作用下抑食金球藻细胞表面形态变化

2.3.2 粘土改性前后表面性质变化

2.4 讨论

2.4.1 粘土改性前后对褐潮藻破坏作用的变化

2.4.2 改性粘土对抑食金球藻细胞表面形态的影响

2.5 小结

第3章改性粘土对抑食金球藻基因转录表达的影响

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 主要试剂与仪器

3.2.2 抑食金球藻培养与去除实验

3.2.3 环境参数测定

3.2.4 RNA提取与检测

3.2.5 RNA-seq测序

3.2.6 测数据分析

3.3 结果

3.3.1 改性粘土对抑食金球藻生长及环境因子的影响

3.3.2 改性粘土作用下抑食金球藻基因的总体转录表达水平及变化

3.3.3 抑食金球藻受改性粘土影响显著的生理过程及细胞结构调控基因

3.4 讨论

3.4.1 改性粘土对抑食金球藻重要生理过程的影响

3.4.2 改性粘土控制褐潮的分子生物学机制

3.5 小结

第4章改性粘土作用下典型功能基因转录表达的动力学响应

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 主要试剂与仪器

4.2.2 抑食金球藻培养与去除实验

4.2.3 环境参数测定

4.2.4 caspase-8 酶活测定

4.2.5 RNA提取与检测

4.2.6 功能基因筛选

4.2.7 RT-qPCR 实验

4.2.8 统计学分析

4.3 结果

4.3.1 改性粘土对抑食金球藻生长及环境因子的影响

4.3.2 改性粘土对抑食金球藻caspase8 酶活性的影响

4.3.3 改性粘土对抑食金球藻部分功能基因表达的影响

4.4 讨论

4.4.1 改性粘土对抑食金球藻的氧化胁迫作用

4.4.2 改性粘土对抑食金球藻细胞程序性死亡的调控作用

4.4.3 改性粘土控制有害藻华的动力学作用机制

4.5 小结

第5章总结与展望

5.1 结论

5.2 主要创新点

5.3 不足与展望

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 朱迦囡

导师: 俞志明,宋秀贤

关键词: 有害藻华,褐潮,改性粘土,分子生物学,控制机制

来源: 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 海洋学,环境科学与资源利用

单位: 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)

基金: 国家重点研发计划(2017YFC1404306),青岛海洋科学与技术国家实验室-“鳌山人才”培养计划(2017ASTCP-OS16),国家自然科学基金-山东省联合基金项目(U1606404),青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技项目(2016ASKJ02-3),国家自然科学基金面上项目(41576119)

分类号: X55

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