基于融合自组装双亲短肽的酶分子改造

论文摘要

自组装双亲短肽（Self-assembling amphipathic peptide,SAP）是一类由交替排布的亲疏水性氨基酸组成,在水溶液中可自发聚集形成纳米颗粒的短肽。前期研究表明,在脂肪氧合酶（Lipoxygenase,LOX）的N-端融合SAP可提高其表达量、稳定性和比酶活。为进一步提高其应用效率,本研究以来源于酿酒酵母Zuotin蛋白的SAP（S1,（AEAEAKAK）2）为研究对象,以大肠杆菌（Escherichia coli）为表达平台,解析了影响SAP促进融合酶表达及稳定化的关键因素,在此基础上分别开发了基于SAP的多功能短肽、促进蛋白质表达和增强酶稳定性的标签文库,最后将上述标签文库应用于重要天然产物生物合成途径的调节。主要研究结果如下:（1）SAP促进融合酶/蛋白表达及稳定化的关键因素解析将S1及其衍生肽分别融合至绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）N-端,考察SAP的组成对GFP在E.coli BL21（DE3）胞内表达的影响。结果显示,改变SAP的疏水性（GRAVY=-2.650.4）和净电荷数目（-20+20）使胞内GFP融合蛋白的荧光强度分别较野生型GFP提高-0.987.22和2.612.7倍;改变SAP的亲水氨基酸种类（将S1中的Glu替换为Asp,Lys替换为Arg和His）和长度（1/29S1）使胞内GFP融合蛋白的荧光强度分别较GFP提高6.3410.15和6.4410.2倍。比较各条件下融合酶荧光强度的变化幅度可以表明,SAP的疏水性和净电荷数目是影响融合蛋白表达的关键因素。将S1及其衍生肽分别经连接肽融合至果胶酶（Polygalacturonate lyase,PGL）N-端,考察SAP组成对融合酶稳定性的影响。以PT-linker（PTPPTTPTPPTTPTPTP）为连接肽时,改变SAP的长度使PGL融合酶较野生型PGL的半衰期提高0.812.67倍;改变SAP的亲水氨基酸种类和电荷分布,使得融合酶半衰期提高1.151.8倍。以包含不同刚性（EAAAK）和柔性（GGGGS）单元的连接肽融合S1与PGL,获得的融合酶半衰期较野生型PGL提高0.442.82倍。根据PGL融合酶半衰期变化的幅度,确定SAP的长度和连接肽的柔性及长度为影响融合酶稳定性的关键因素。（2）基于SAP的多功能短肽的设计将S1（AEAEAKAK）2中Lys突变为His,获得短肽S1cv2（AEAEAHAH）2。将S1cv2经PT-linker融合在PGL、LOX及GFP的末端,得到的融合酶/蛋白S1cv2-PGL、S1cv2-LOX及S1cv2-GFP,在E.coli BL21（DE3）中表达量分别较对应的野生型酶/蛋白提高了3.8、0.2和1.52倍,镍柱纯化收率分别为47%、39.15%及56.1%。与对应野生型酶相比,S1cv2-PGL和S1cv2-LOX的半衰期分别提高1.3和3.1倍。相同条件下,对应的His-tag融合酶/蛋白表达量和热稳定性无明显变化,镍柱纯化收率均在9%以下。与S1cv2相比,S1衍生肽S1nv12（ANANARAR）4具有更高的促表达能力。在S1nv12内部分散插入4个His,得到的S1vw（HNANARARHNANARARHNANARARHNARARAR）使GFP融合蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达量较野生型GFP提高4.22倍,镍柱亲和纯化回收率达到64.35%。此外,S1vw使GFP融合蛋白在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的表达量提高1.91倍,但在毕赤酵母（Pichia pastoris）中没有类似效果。（3）基于SAP的蛋白质表达标签文库的设计基于SAP促进融合酶/蛋白表达关键因素的分析结果,以S1nv1（ANANARAR）10为模板,通过随机PCR构建获得以SAP的净电荷数（+1+20）为变量的蛋白质表达标签文库。为便于高表达菌株的检测,将文库中的SAP融合至目标蛋白N-端后,在其C-端融合GFP作为快速筛选的荧光标记。以PGL、LOX、天冬酰胺酶（L-asparaginase,ASN）和谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase,MTG）为报告蛋白,考察蛋白质表达标签文库效率。结果显示,应用上述蛋白质表达标签文库可获得大量表达量提高的SAP融合酶,其中SAP净电荷数目为+2+6的融合酶的表达效率较高。与对应的野生型酶相比,PGL、LOX、ASN及MTG的融合酶的表达量分别提高了8.3、3.5、3.68和2.64倍。（4）基于SAP的蛋白质稳定化标签文库的设计动态光散射和蛋白质表面疏水性等分析表明,通过酶蛋白分子间疏水作用形成寡聚体是SAP融合酶高热稳定性的主要原因,寡聚体的大小和比例可受SAP和连接肽的影响。基于SAP促进融合酶稳定化的关键因素和上述稳定化机制,构建含有不同SAP长度、连接肽长度和连接肽柔性的酶稳定化标签文库。将文库应用于PGL、LOX和ASN的稳定性改造,其正向突变率分别达到35.8%、21.8%和25%,半衰期较对应的野生型酶分别提高5.98、4.96和2.95倍,而表达量和比酶活未见明显改变。添加氯化钠（NaCl）使PGL、LOX和ASN的融合酶半衰期分别提高4.1、2.2和3.2倍,而相同添加条件下对应的野生型酶的半衰期仅分别提高3.2、0.95和1.7倍。上述结果表明,基于SAP的蛋白质稳定化标签能有效提高多种酶的稳定性,且能增强NaCl对酶的稳定化效果。（5）基于融合SAP的代谢途径调控基于上述SAP文库,提出了一种基于SAP融合的关键酶迭代修饰的代谢调控策略:将短肽S1nv10（ANANARAR）2分别融合至代谢关键酶的N-端,通过随机PCR改变SAP疏水性、长度和净电荷数目,以达到调控融合酶表达量、稳定性或催化活性的目的。应用该策略对β-胡萝卜素合成途径中的GGPP合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,CrtE）、八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene dehydrogenase,CrtI）、八氢番茄红素合成酶（Phytoene synthase,CrtB）和番茄红素β环化酶（Lycopene cyclase,CrtY）进行调控,获得β-胡萝卜素产量较出发菌株提高3.91倍的重组菌。通过SAP融合,CrtE、CrtI和CrtY的表达量发生改变,其中CrtY的催化效率和热稳定性分别提高了0.89和1.23倍。将该策略应用于圣草酚和柚皮素的生物合成,使产量较出发菌分别提高1.2和1.86倍。上述结果表明,SAP可以同时从表达量、催化效率和稳定性等多个维度修饰代谢途径中的关键酶。

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摘要

Abstract

缩略词注释表

第一章绪论

1.1 概述

1.2 重组蛋白表达量提高的主要策略

1.2.1 表达宿主的选择和发酵条件的优化

1.2.2 表达元件的优化

1.2.3 基因序列的优化

1.2.4 蛋白质促表达功能标签

1.3 酶热稳定性改造的主要优化策略

1.3.1 理性设计

1.3.2 非理性设计

1.3.3 蛋白质稳定化功能标签

1.4 自组装双亲短肽

1.4.1 自组装双亲短肽的结构

1.4.2 自组装双亲短肽的应用

1.4.3 自组装双亲短肽在酶工程领域的应用

1.5 本论文主要研究内容

1.5.1 立题依据和研究意义

1.5.2 本论文主要研究内容

第二章自组装双亲短肽促进酶/蛋白表达及稳定化关键因素解析

2.1 前言

2.2 实验材料与方法

2.2.1 菌株和质粒

2.2.2 试剂和仪器

2.2.3 培养基

2.2.4 培养方法

2.2.5 分子生物学相关操作

2.2.6 质粒构建

2.2.7 酶蛋白纯化方法

2.2.8 分析方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 SAP融合酶表达量的关键影响因素确定

2.3.2 SAP融合酶稳定性的关键影响因素的确定

2.4 本章小结

第三章多功能自组装双亲短肽的设计

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株和质粒

3.2.2 试剂及仪器

3.2.3 培养基及培养条件

3.2.4 分子生物学相关操作

3.2.5 感受态细胞制备与质粒转化

3.2.6 质粒构建

3.2.7 酶蛋白纯化方法

3.2.8 分析方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 多功能肽S1cv2 的开发与应用

3.3.2 多功能肽S1vw的开发与应用

3.4 本章小结

第四章基于自组装双亲短肽的蛋白质表达标签文库的构建

4.1 前言

4.2 实验材料与方法

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 试剂和仪器

4.2.3 培养基及培养条件

4.2.4 分子生物学相关操作

4.2.5 质粒构建

4.2.6 蛋白质促表达标签文库的构建

4.2.7 酶蛋白纯化方法

4.2.8 分析方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 SAP促进融合酶/蛋白表达的机制分析

4.3.2 基于SAP的蛋白质表达标签文库的构建

4.3.3 高表达量SAP融合酶的筛选

4.4 本章小结

第五章基于自组装双亲短肽的酶蛋白稳定化标签文库的设计

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株及质粒

5.2.2 试剂和仪器

5.2.3 培养基及培养条件

5.2.4 分子生物学相关操作

5.2.5 融合酶稳定化文库的构建

5.2.6 酶蛋白纯化方法

5.2.7 分析方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 稳定化机制分析

5.3.2 酶稳定化文库的构建

5.3.3 高稳定性融合酶的筛选

5.3.4 添加剂对SAP融合酶稳定性的影响

5.4 本章小结

第六章基于融合自组装双亲短肽的代谢途径调控

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌株和质粒

6.2.2 试剂和仪器

6.2.3 培养基及培养条件

6.2.4 分子生物学相关操作

6.2.5 基于融合SAP的代谢途径调控

6.2.6 质粒构建

6.2.7 酶蛋白纯化方法

6.2.8 分析方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 β-胡萝卜素代谢合成途径的优化

6.3.2 SAP对 β-胡萝卜素代谢调控过程的分析

6.3.3 圣草酚合成途径的优化

6.3.4 柚皮素合成途径的优化

6.4 本章小结

主要结论与展望

主要结论

展望

论文创新点

致谢

参考文献

附录 I：作者在攻读博士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 赵伟欣

导师: 刘立明

关键词: 自组装双亲短肽,多功能肽,蛋白质表达,酶稳定化,代谢调控

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ925

总页数: 94

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