导读:本文包含了外泌汗腺论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:黑素细胞干细胞,外分泌腺,白癜风,复色
外泌汗腺论文文献综述
杨燕霞,雷铁池[1]（2019）在《皮肤外泌汗腺中黑素细胞干细胞及其临床意义》一文中研究指出黑素细胞干细胞(又称为黑素细胞前体细胞)是一种细胞谱系特异性成体干细胞,在正常生理状态下处于未成熟和休眠状态,但经一定条件(如伤口愈合、基因毒性药物处理和紫外线照射等)的刺激,干细胞可被激活,进行分裂增殖,并分化为成熟的黑素细胞。黑素细胞干细胞又能自我更新,为维持表皮细胞的稳态不断地提供丰富的黑素细胞来源。现有的研究证实黑素细胞干细胞主要分布在毛囊隆突区的外毛根鞘和表皮嵴状突起的顶端。这两群成体干细胞活化被认为参与中波紫外线(UVB)照射后白癜风皮损的成功复色。近年来还发现在无毛皮肤(如掌跖部位)的外泌汗腺(小汗腺)也存在有黑素细胞干细胞,这群黑素细胞干细胞活化或转化可能关系到无毛皮肤白癜风的复色或指(趾)端恶性黑素瘤的发生。该文就近年来对汗腺中的黑素细胞干细胞及其临床意义作一综述。(本文来源于《临床皮肤科杂志》期刊2019年03期）
梁含思[2]（2015）在《人外泌汗腺细胞的生物学特性及其iPS细胞向汗腺分化的研究》一文中研究指出大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。全国每年近千万人的烧伤病人,近万人严重烧伤,其中约10%的严重烧伤病人由于缺乏皮源尚无法挽救其性命。严重烧伤获救的病人由于无汗腺功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能,严重影响病人的生活质量。汗腺是人体皮肤组织中重要的功能性附属器,汗腺可分为顶泌汗腺即大汗腺,和外泌汗腺即小汗腺。一般所说的汗腺是外泌汗腺,在调节体温、分泌汗液及排出人体部分代谢废物的过程中发挥重要的作用。外泌汗腺是单管状腺,分为分泌部和导管部,分泌部位于真皮层或皮下组织内,是盘曲成团的小管,而导管部开口于表皮层,连接分泌部和外界环境。汗腺的发育开始于胚胎时期14-16周,至24周基本成熟,出生之后不会有新生的汗腺组织形成。皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研究的核心和热点。轻度烧伤时,汗腺的导管处细胞可以其深部未受损的部分为模版从而重建汗腺被损坏的部分;但全层皮肤大面积深度烧伤时,由于汗腺组织被毁,则不能依赖细胞的分裂、增殖与终末分化来自我更新而重建其复杂结构。至今尚无有效的方法体外扩增人汗腺细胞,对其生物学特性知之甚少。同时,干细胞可以定向分化为并构建具有覆盖保护能力的表皮层组织;也有研究表明干细胞可以定向分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞,但是对于汗腺组织的功能性重建还未见报道,且干细胞分化为汗腺样细胞的具体机制尚待探讨。本研究皆在建立人外泌汗腺细胞体外分离和培养方法,并分析其生物学特性,在此基础上,通过构建人汗腺细胞来源的i PS细胞,根据i PS细胞具有来源细胞的记忆性这一特性,开展汗腺细胞来源的i PS细胞分化为汗腺样细胞的研究,探讨其分化的关键分子机制,为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供理论基础,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,提高大面积烧伤病人救治后的临床疗效,具有研究的创新性和潜在的应用价值。第一部分人外泌汗腺细胞体外分离和培养及其生物学特性的鉴定目的:建立体外分离、提取、培养和纯化人外泌汗腺细胞的方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法:将人皮肤样本除去脂肪和结缔组织,剪成1mm2的小块,用分散酶于4℃消化18小时,第二天取出后用PBS漂洗。用镊子将真皮层与表皮层轻轻分离,真皮层用剪刀剪碎,加入IV型胶原酶于37℃消化1小时,然后在倒置显微镜下使用移液枪将游离的汗腺组织吸出。在6cm的培养皿中先预先铺一层鼠尾胶原,将汗腺贴于预铺了胶原的6cm细胞培养皿中,一个小时后加入汗腺细胞培养基,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。2-3d后,汗腺细胞从汗腺组织中长出。倒置显微镜观察人外泌汗腺细胞形态;免疫组化方法对比不同部位来源皮肤汗腺数量的多少;透射电镜观察皮肤样本汗腺细胞的细胞器结构;PCR分析汗腺细胞胚胎干细胞标记和角质化细胞标记;免疫荧光染色技术检测体外培养的汗腺细胞的标志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表达。结果:(1)光学倒置显微镜下观察人外泌汗腺,游离出来的汗腺组织可以观察到盘曲成球的分泌部和较直的导管部;贴壁培养后可见汗腺上皮细胞从汗腺组织中生长出来,呈典型的上皮细胞样,排列紧密,类似铺石路状,细胞边界明显,核清晰,具有一定的增殖能力;(2)免疫组化结果显示,成人手掌部、成人头颈部和成人胸腹部的皮肤处存在的汗腺数量较少,而手术切除的婴幼儿多指样本皮肤中存在有大量的汗腺;(3)透射电镜结果显示,皮肤中汗腺导管处由两层细胞构成,且存在有张力原纤维,汗腺腺体分泌部由两类细胞构成,分别是构成管腔的细胞和肌上皮细胞;(4)PCR结果显示,体外培养的汗腺细胞,不表达胚胎干细胞的干性指标Oct-4、Sox-2和Nanog,表达增殖相关基因Klf-4和c-Myc,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞指标K14、K8、K18和K19;(5)免疫荧光染色结果显示,体外分离培养的人汗腺细胞表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞标记K14、K8和K18。结论:成功从手术切除的婴幼儿皮肤样本中分离提取出大量的汗腺组织,满足实验研究的需要;体外分离培养的汗腺细胞具有一定的增殖能力,能传代培养2~3代;对体外培养的汗腺细胞生物学特性进行鉴定,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞标记K14、K8和K18,具有上皮细胞的特性,为进一步研究汗腺细胞奠定基础。第二部分人外泌汗腺细胞来源i PS细胞的构建以及定向分化为汗腺样细胞的研究目的:构建人外泌汗腺细胞来源的i PS细胞,并对其生物学特性进行鉴定;定向诱导人外泌汗腺细胞来源的i PS细胞分化为汗腺样细胞,并对其生物学特性及功能性进行鉴定。方法:取体外培养10天后的汗腺细胞,以1×105个/皿的密度接种于6cm细胞培养皿中,加入4种含有胚胎干细胞的转录因子基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒,24小时后移除含有慢病毒的培养基,PBS冲洗,加入新鲜的汗腺细胞完全培养基;2-3天后,消化细胞接种到铺有滋养层细胞的6cm细胞培养皿中,更换胚胎干细胞培养基,培养约10天后,挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相似的克隆,接种于铺有滋养层细胞的24孔板中。培养约10天后,再次挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相似的克隆,接种于铺有滋养层细胞的6孔板中继续培养。光学显微镜观察细胞形态;RT-PCR,免疫荧光染色检测诱导后的细胞生物学特性;细胞连续培养计数分析汗腺细胞来源i PS细胞的增殖能力;体外培养的人汗腺细胞经过5-7天的培养,更换培养基为KGM2培养基,收集培养过人汗腺细胞的KGM2培养基,用0.22μm的滤器过滤,收集到的培养基为CM;取稳定培养的人汗腺细胞来源i PS细胞,以2×105个/孔的密度接种于6孔板中,24小时后,待i PS细胞贴壁后,添加汗腺细胞诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50ng/ml EGF);然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基;待诱导后的细胞生长至汇合率为70%,对细胞消化传代,按1传4的比例接种细胞至新的培养皿中,诱导分化21天后得到汗腺样细胞;光学显微镜观察其细胞形态;Realtime-PCR分析其基因表达情况;流式细胞仪检测汗腺相关蛋白表达;免疫荧光染色检测汗腺相关蛋白表达;电镜技术观察细胞内部结构;3D组织培养方法检测分化后的汗腺样细胞形成汗腺样结构的能力,并对形成的汗腺样结构进行免疫荧光染色检测。结果:(1)光学显微镜下观察构建的人汗腺细胞来源i PS细胞,呈克隆样生长,细胞边界明显,核质比较高,有形成类胚体的能力,与人胚胎干细胞相似;(2)PCR结果表明人汗腺细胞来源i PS细胞表达胚胎干细胞指标Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和Nanong,同时也表达汗腺相关指标K14和CD24;(3)免疫荧光染色结果显示人汗腺细胞来源i PS细胞表达胚胎干细胞标志物Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81;(4)细胞连续培养计数结果表明人汗腺细胞来源i PS细胞具有良好的增殖能力;(5)光学显微镜下观察,由汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化得到的汗腺样细胞,细胞变大,成上皮细胞样生长,核质比变小;而人汗腺细胞,细胞较大,具有明显的上皮细胞形态,呈铺路石状生长,细胞排列整齐。(6)Realtime-PCR结果显示,汗腺细胞来源i PS细胞在诱导的过程中,在m RNA水平上逐渐表达汗腺细胞指标EDA、EDAR、K8和CEA,且在分化的过程中逐渐接近汗腺细胞。(7)流式细胞仪技术检测结果表明,诱导后的细胞表达汗腺相关指标ED A大约63%,ED AR大约65%,K 8大约76%,C EA大约56%。(8)透射电镜结果 表明,诱导后得到的汗腺样细胞具有人汗腺细胞有的微绒毛,而汗腺细胞来源i PS细胞则没有微绒毛;(9)3D组织培养结果显示,汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化的汗腺样细胞能够在胶中形成汗腺管状结构,可见管状结构横截面以及管腔,可观察到诱导后的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程,汗腺样细胞在胶中增殖成团,中间的细胞逐渐凋亡,形成管腔;(10)免疫荧光染色的结果 表明,汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构表达部分汗腺相关基因。结论:利用i PS技术成功构建人汗腺细胞来源i PS细胞,并对其生物学特性进行了检测分析,与人胚胎干细胞相似;定向诱导人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞,光学显微镜、Realtime-PCR、免疫荧光染色、透射电镜及3D组织培养结果显示,人汗腺细胞来源i PS细胞能分化为汗腺样细胞,并且具有形成汗腺样结构的能力。第叁部分干细胞汗腺分化机制的探讨目的:在建立使用条件培养基(Condition media,CM)可诱导人汗腺来源i PS细胞分化为汗腺样细胞的基础上,分析CM中可能起关键作用的分子,为干细胞汗腺分化寻找合适的培养体系,为研究干细胞汗腺分化机制的研究提供理论依据。方法:取2×104的人汗腺来源i PS细胞(SG-i PS)铺于6孔板一孔中,加入诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50ng/ml EGF),分别取诱导7天,14天和21天的样本,利用Realtime-PCR方法检测分析不同分化时间点的汗腺样细胞的基因表达情况;针对BMP4和HGF信号通路,利用Realtime-PCR方法和免疫荧光染色的方法分析在分化过程中BMP4和HGF可能的来源,比较人汗腺细胞(SG)、人汗腺细胞培养中存在的成纤维细胞(SG-Fib)以及SG-Fib脱离SG环境培养2周的成纤维细胞(Fib);Western blot和ELISA检测CM中HGF和BMP4的存在;在SG-i PS分化到汗腺样细胞的过程中,加入HGF和BMP4拮抗剂,分化21天后Realtime-PCR方法检测汗腺相关基因的表达;在SG-i PS分化到汗腺样细胞的过程中额外添加HGF和BMP4,分化21天后Realtime-PCR方法检测汗腺相关基因的表达;结果:(1)Realtime-PCR方法检测结果显示,汗腺相关基因EDA、EDAR和LEF1的表达在分化过程中呈上升趋势,在第14天达到峰值,分化21天后表达水平接近正常汗腺细胞,说明EDA,EDAR和Left1在汗腺分化过程中发挥一定作用;进一步检测其上游基因表达,包括MAPK通路和Wnt通路中相关基因,发现ERK和β-catenin的表达呈现相关性。BMP4,HGF,FGF10是胞外与MAPK和Wnt通路有相关作用的分子,检测其受体在细胞膜上的表达,发现BMP4受体BMPR1和BMPR2及HGF受体HGFR在分化过程中均有表达,而FGF10受体FGFR2则没有表达;Realtime-PCR方法检测BMP4和HGF在分化过程中的来源结果发现,在细胞中,BMP4主要由汗腺细胞来源的成纤维细胞分泌,汗腺细胞也有不同程度的分泌,而HGF则主要由汗腺来源的成纤维细胞分泌,免疫荧光染色的结果也证明了这一结果;在汗腺来源CM中,Western blot和ELISA结果显示HGF和BMP4均有存在,这说明在CM中存在对汗腺分化具有作用的HGF和BMP4;(2)在分化过程中加入BMP4和HGF拮抗剂后,汗腺相关基因EDA、EDAR、CEA和K8均有不同程度的下降,加入HGF拮抗剂的基因表达下降的比加入BMP4拮抗剂的明显;在分化过程中额外加入BMP4和HGF重组蛋白取代CM中可能存在的未知分子,汗腺相关基因EDA、EDAR、CEA和K8表现出一定的相关性,但还不如汗腺诱导培养基诱导的效果明显。结论:由人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞的过程中,从CM中寻找到两个相关因子,HGF和BMP4在人汗腺来源i PS细胞分化为汗腺样细胞中起关键作用,得出两条可能的汗腺分化的作用途径:HGF和BMP4通路。HGF与细胞膜上的受体c-Met结合,促进细胞基质中β-catenin表达上升,β-catenin进入细胞核内与Lef1作用,激活EDA/EDAR信号通路,从而启动汗腺分化;BMP4与细胞膜上的受体BMPR1和BMPR2结合,激活MAPK通路中的其中一条ERK通路,随后ERK与细胞核中的Lef1作用激活EDA/EDAR信号通路,从而启动汗腺分化。综上所述,本课题成功分离提取了人外泌汗腺,建立了体外培养人外泌汗腺细胞的方法,并用体外培养的人外泌汗腺细胞成功构建的人汗腺细胞来源i PS细胞,对其生物学特性进行了鉴定,并在此基础上定向诱导人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞,对得到的汗腺样细胞进行了生物学特性及功能性鉴定,在诱导分化的过程中寻找到了两个可能的关键分子HGF和BMP4,建立了合适的干细胞汗腺分化培养体系,不仅为研究干细胞汗腺分化机制的研究提供有价值的理论依据,也为汗腺的功能性重建开拓新的途径,具有潜在的应用价值。(本文来源于《苏州大学》期刊2015-04-01）
舒申友,陈露,李雪雪,李海红[3]（2014）在《人体外泌汗腺细胞的叁维培养及形态学观察》一文中研究指出目的探讨人体外泌汗腺组织体外叁维培养方法,并对构建的叁维组织进行形态学分析。方法取整形手术患者自愿捐赠的正常腹部全层皮肤,经Ⅱ型胶原酶消化分离人体外泌汗腺组织,以含5 ng/mL重组人EGF、25 mg/mL牛垂体提取物、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的无血清角质细胞培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待原代细胞达80%融合后,调整细胞浓度至1×105个/mL;取0.3 mL细胞悬液与0.3 mL Matrigel基底膜基质混匀培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。培养14 d后,取标本行冰冻切片,HE染色观察细胞形态结构,免疫组织化学染色检测细胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)和CK19抗原表达。结果倒置相差显微镜观察示,经Ⅱ型胶原酶消化后大量汗腺组织游离;贴壁后3~5 d长出汗腺细胞,细胞持续分裂达2~3周,形成围绕汗腺组织块的环状单层;3~4周后细胞衰老。汗腺细胞接种于Matrigel基底膜基质中2~3 d,细胞开始分裂,随后形成小细胞团、管状结构以及类球状结构;约2周时混合培养物开始液化,培养终止。HE染色示部分细胞形成中空管状结构,管壁由1~2层细胞构成,类似于在体汗腺的分泌部和导管部;免疫组织化学染色见培养的汗腺细胞CK7和CK19表达均呈阳性。结论人汗腺细胞接种于Matrigel基底膜基质叁维培养,形成的组织结构模拟了在体汗腺的组织形态结构。(本文来源于《中国修复重建外科杂志》期刊2014年02期）
雷霞,刘渤,伍津津,鲁元刚,杨亚东[4]（2010）在《siRNA c-Met腺病毒转染对人外泌汗腺上皮细胞增殖的影响》一文中研究指出目的:研究siRNA c-Met腺病毒转染对培养的人外泌汗腺上皮细胞(human eccrine sweat gland epithelial cells,hESGc)增殖的影响。方法:按我科已经建立的方法培养和鉴定hESGc,取第1代细胞备用。构建表达红色荧光蛋白的siRNA c-Met腺病毒,荧光显微镜观察和Westernlot检测证实病毒的有效性。MTT法检测siRNA c-Met腺病毒对hESGc增殖的影响。结果:荧光显微镜下可见转染了siRNA c-Met腺病毒的hESGc有红色荧光表达,转染后48h,收集细胞进行westernblot检测,结果发现,siRNA c-Met腺病毒转染能抑制hESGc细胞中c-Met蛋白的表达,抑制率达70%以上,MTT法检测发现转染siRNA c-Met腺病毒能抑制hESGc增殖,抑制率分别为16.8%(2天)和34.5%(4天)。结论:siRNA c-Met腺病毒转染能抑制hESGc的增殖。(本文来源于《中国美容医学》期刊2010年09期）
艾丽,付小兵,张翠萍[5]（2009）在《体外培养人外泌汗腺细胞的免疫表型鉴定》一文中研究指出目的探讨在体外分离及培养的人外泌汗腺细胞免疫表型的表达情况。方法采用酶消化法(0.2%胶原酶Ⅱ)分离获取汗腺细胞,选用DMEM-LG培养基,添加10%特级胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)、重组人表皮生长因子(10ng/ml)、叁碘甲状腺原氨酸(2ng/ml)、半琥珀氢化可的松(0.4μg/ml)、胰岛素转铁蛋白-亚硒酸钠(1m/100ml)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)。汗腺细胞达(本文来源于《第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编》期刊2009-09-25）
龙丽芸[6]（2009）在《人外泌汗腺上皮细胞原代培养的改良》一文中研究指出目的对人外泌汗腺上皮细胞原代培养的传统技术进行改良,简化实验操作,减轻劳动强度,以期用更短的时间获得更多量稳定生长的外泌汗腺上皮细胞,为体外研究汗腺和构建功能性组织工程皮肤提供理论依据和技术支持。方法在传统的汗腺组织块培养法基础上,于分离的人外泌汗腺组织块表面加盖玻片以固定组织块,以促进汗腺组织块贴壁,减少换液等操作所致的组织块损失,并简化实验步骤。结果改良的实验方法能显着提高汗腺组织块的贴壁率,且对汗腺上皮细胞的增殖能力无明显影响,因而在相同时间内获得的汗腺上皮细胞数量比传统方法更多。结论与传统的组织块培养法相比,本方法的实验步骤简单,耗时更少,在相同单位时间内获得的细胞数量更多。培养的人外泌汗腺上皮细胞保持了上皮细胞的结构特点,且具有良好活力,说明了人工构建外泌汗腺的可行性。(本文来源于《南昌大学》期刊2009-06-01）
周立奉[7]（2009）在《体外重建外泌汗腺的初步研究》一文中研究指出目的:1、体外培养的汗腺腺上皮细胞分别接种在Matrigel下表面、上表面、以及Matrigel中,探讨以Matrigel为主要基质构建汗腺样结构的方法。2、对已构建的汗腺样结构进行鉴定,探讨其在形态学、组织学上与正常汗腺的相似性。3、通过对钙离子激动剂和阻滞剂对体外重建的汗腺样结构钙通道的影响作用的研究,探讨其在功能上与正常汗腺的相似性。方法:1、将酶消化法分离培养的原代汗腺腺上皮细胞分别接种在Matrigel下表面、上表面以及Matrigel中,倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况。2、用倒置相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、计算机叁维重建、电镜、HE染色及免疫组织化学法观察汗腺样结构的形态学及组织学特性。3、钙荧光探针Fluo-3对汗腺样结构染色,分别在汗腺样结构中适时加入钙离子激动剂(氯化乙酰胆碱)和阻滞剂(阿托品),激光共聚焦显微镜观察其细胞内游离钙离子浓度变化情况。结果:1、汗腺腺上皮细胞接种在Matrigel下表面,立体培养11d形成腔面结构,但细胞增殖不明显;当接种在Matrigel上表面时,立体培养8h,细胞胞浆伸长呈丝状,与邻近细胞相连呈腔面或半腔面形;而接种在Matrigel中,叁维立体培养2~3d,细胞分裂增生,增生细胞彼此紧密排列成立体管腔结构,中间可见明显腔隙,随新生细胞增多,管腔结构逐渐演变为不规则球形结构。2、激光扫描共聚焦显微镜观察示细胞团呈球形结构,中央有管腔结构,细胞排列富有极性。计算机软件叁维重建后从不同角度观察,细胞团呈不规则球形结构。透射电镜下可见含有大量高电子致密度颗粒的细胞,以及相对含有较少高电子致密度颗粒、但含有较多线粒体的细胞;细胞彼此排列形成管腔结构,其连接处可见指状突起以及类似分泌小管的腔隙。球形结构HE染色示其剖面为单层细胞相互连接形成环状结构,中间见明显的腔隙,细胞呈锥形,胞质嗜酸性,淡染,胞核蓝染,稍大,偏向基底部。免疫组织化学染色示CK18、CEA表达阳性。3、细胞外液钙浓度高时,加入氯化乙酰胆碱后,钙通道开放,细胞外钙内流,细胞内钙浓度明显增加;细胞外液钙浓度高时,先加入阿托品,5分钟后加入氯化乙酰胆碱,细胞内钙浓度无明显变化。结论:体外培养的汗腺腺上皮细胞接种在Matrigel中,能形成汗腺样结构;所形成的汗腺样结构,在形态学、组织学及功能上都与在体汗腺相似,这为体外重建汗腺以及进一步研究汗腺的功能提供了重要实验依据。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2009-05-01）
雷霞,伍津津,鲁元刚,朱堂友,杨亚东[8]（2008）在《肝细胞生长因子对人外泌汗腺上皮细胞促增殖作用的研究》一文中研究指出目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对培养的人外泌汗腺上皮细胞(human eccrinesweat gland epithelial cells,hESGc)的促增殖作用,以及细胞内磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-ERK1/2)蛋白的表达。方法在无血清角质形成细胞培养基(keratinocyte serum free medium,KSFM)中培养hESGc,取第1代细胞进行实验。免疫组织化学染色检测C-met表达。MTT法检测HGF对hESGc的促增殖作用,实验分为3组:空白组、对照组和实验组。空白组仅含200μL KSFM;对照组于96孔板以2×103个/孔接种hESGc,并加入200μLKSFM;实验组于96孔板以2×103个/孔接种hESGc并加入200μLKSFM后,再分别加入不同浓度(2、20、40、80ng/mL)HGF。实验组于加入各浓度HGF前以及加入后2、4d,观察细胞增殖情况。实验组于加入40ng/mL HGF后即刻,5、30、90和120min,采用Westernblot方法检测细胞内p-ERK1/2表达规律。结果hESGc抗-C-met免疫组织化学染色胞浆可见阳性染色,细胞核染色为蓝色。MTT法检测示40、80ng/mL HGF对hESGc具有显着促增殖作用(P<0.05)。在含40ng/mL HGF的KSFM中培养2d,吸光度(A)值为0.2393±0.0709,增殖率为74.2%,对照组A值为0.1374±0.0290;培养4d,40ng/mL HGF实验组A值为0.2878±0.0743,增殖率为74.8%,对照组A值为0.1646±0.0350,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。在含80ng/mL HGF的KSFM中培养2d,A值为0.2123±0.0592,增殖率为54.5%;培养4d,80ng/mL HGF实验组A值为0.2310±0.0567,增殖率为40.3%;与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。p-ERK1/2在40ng/mL HGF刺激5min后表达达高峰,相对积分吸光度值(relative integral absorbance,RIA)为0.5932±0.1922,较刺激后即刻增加8.1倍(P<0.01);刺激30、90及120min后RIA与刺激后即刻比较,差异无统计学意义(P>0.05)结论HGF可促进hESGc增殖,并能引起ERK1/2蛋白磷酸化。(本文来源于《中国修复重建外科杂志》期刊2008年05期）
雷霞,伍津津,鲁元刚,朱堂友[9]（2006）在《HGF对人外泌汗腺腺上皮细胞增殖和移行的影响》一文中研究指出目的 HGF对人外泌汗腺腺上皮细胞增殖和移行的影响:方法按我科已建立的方法培养人外泌汗腺腺上支细胞,在加入含相应浓度(0、2、20、40、80ng／ml)HGF的KSFM之前,之后2d、4d用MTT法观察细胞增殖。细胞增生率(AHGF组-A对照组)／A对照组×100％表示。用细胞刮在每孔中刮出10×5mm大小的无细胞区,在加入相应浓度(0、2、20、40、80ng／m1)HGF的KSFM之后20h,计数越过划痕端进入划痕区(本文来源于《中华医学会第十二次全国皮肤性病学术会议论文集》期刊2006-06-30）
雷霞[10]（2006）在《人外泌汗腺腺上皮细胞的生物学特性及体外重建汗腺的实验研究》一文中研究指出汗腺是皮肤重要的附属器之一,分为外泌汗腺和顶泌汗腺,其中外泌汗腺起着体温调节、分泌、代谢等重要作用。它由小汗腺胚芽分化而成,胚胎24周时开始分泌汗液,乙酰胆碱引起细胞内游离钙增加是人外泌汗腺腺上皮细胞分泌汗液的基础。深入研究外泌汗腺的结构和功能意义重大。第一,外泌汗腺分为分泌部和导管部,分泌部为无分支管状腺,由单层腺上皮细胞和其外周的肌上皮细胞构成,结构相对简单,但功能完整,体外培养外泌汗腺腺上皮细胞为深入研究其结构功能提供了可能,也为其它外泌腺体分泌和重吸收机制的深入研究提供了重要模式;第二,外泌汗腺分泌部和导管部均是小管结构组成,人体中还有许多器官含有小管结构,如血管、肝小管、肾小管、乳腺小管、胰腺小管等,小管起着分泌、吸收、重吸收、体液运输等重要作用,研究表明,在小管发生过程中有一些共同的作用机制,因此,体外诱导外泌汗腺小管形成和叁维重建汗腺不仅有利于研究汗腺的细胞生物学和发育生物学的相关问题,对研究其它器官的小管发生和体外重建也有借鉴和指导作用;第叁,汗腺重建模型的建立将为外泌腺体药理机制的基础研究等提供工具;第四,皮肤缺损导致汗腺缺失或其它疾病导致汗腺结构功能异常将严重影响患者的生活质量。组织工程皮肤发展至今,已基本解决了创面覆盖的问题,但未达到真正的组织结构和功能的完全重建,缺少毛囊、汗腺、皮脂腺等附属器,从而不能完成排汗、分泌等重要功能。体外重建汗腺将为研究带汗腺的组织工程皮肤奠定基础。上世纪90年代始,国内外有研究者进行了外泌汗腺细胞培养方面的研究,均采用的是组织块法,体外成功培养了外泌汗腺细胞,培养的细胞保持了上皮细胞的特点和主动转运离子和水的能力以及一些药理学特性,如在拟胆碱能药(如氯化氨甲酰胆碱)的刺激下培养的分泌部细胞能形成短回路电流,该作用能被钠离子阻滞剂(阿米洛利)所抑制,这为从体外进一步研究汗腺细胞的生理功能奠定了基础。但其缺点在于获得的细胞量少,所需培养时间长,成纤维细胞污染严重,且从完整的汗腺中长出的细胞包括导管部细胞和分泌部细胞,从形态上不能鉴别。另外,体外诱导汗腺小管形成、叁维重建汗腺尚未见报道。因此,建立高效汗腺细胞分离培养方法,并探讨其体外重(本文来源于《第叁军医大学》期刊2006-05-01）
外泌汗腺论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。全国每年近千万人的烧伤病人,近万人严重烧伤,其中约10%的严重烧伤病人由于缺乏皮源尚无法挽救其性命。严重烧伤获救的病人由于无汗腺功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能,严重影响病人的生活质量。汗腺是人体皮肤组织中重要的功能性附属器,汗腺可分为顶泌汗腺即大汗腺,和外泌汗腺即小汗腺。一般所说的汗腺是外泌汗腺,在调节体温、分泌汗液及排出人体部分代谢废物的过程中发挥重要的作用。外泌汗腺是单管状腺,分为分泌部和导管部,分泌部位于真皮层或皮下组织内,是盘曲成团的小管,而导管部开口于表皮层,连接分泌部和外界环境。汗腺的发育开始于胚胎时期14-16周,至24周基本成熟,出生之后不会有新生的汗腺组织形成。皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研究的核心和热点。轻度烧伤时,汗腺的导管处细胞可以其深部未受损的部分为模版从而重建汗腺被损坏的部分;但全层皮肤大面积深度烧伤时,由于汗腺组织被毁,则不能依赖细胞的分裂、增殖与终末分化来自我更新而重建其复杂结构。至今尚无有效的方法体外扩增人汗腺细胞,对其生物学特性知之甚少。同时,干细胞可以定向分化为并构建具有覆盖保护能力的表皮层组织;也有研究表明干细胞可以定向分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞,但是对于汗腺组织的功能性重建还未见报道,且干细胞分化为汗腺样细胞的具体机制尚待探讨。本研究皆在建立人外泌汗腺细胞体外分离和培养方法,并分析其生物学特性,在此基础上,通过构建人汗腺细胞来源的i PS细胞,根据i PS细胞具有来源细胞的记忆性这一特性,开展汗腺细胞来源的i PS细胞分化为汗腺样细胞的研究,探讨其分化的关键分子机制,为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供理论基础,使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能,提高大面积烧伤病人救治后的临床疗效,具有研究的创新性和潜在的应用价值。第一部分人外泌汗腺细胞体外分离和培养及其生物学特性的鉴定目的:建立体外分离、提取、培养和纯化人外泌汗腺细胞的方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法:将人皮肤样本除去脂肪和结缔组织,剪成1mm2的小块,用分散酶于4℃消化18小时,第二天取出后用PBS漂洗。用镊子将真皮层与表皮层轻轻分离,真皮层用剪刀剪碎,加入IV型胶原酶于37℃消化1小时,然后在倒置显微镜下使用移液枪将游离的汗腺组织吸出。在6cm的培养皿中先预先铺一层鼠尾胶原,将汗腺贴于预铺了胶原的6cm细胞培养皿中,一个小时后加入汗腺细胞培养基,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。2-3d后,汗腺细胞从汗腺组织中长出。倒置显微镜观察人外泌汗腺细胞形态;免疫组化方法对比不同部位来源皮肤汗腺数量的多少;透射电镜观察皮肤样本汗腺细胞的细胞器结构;PCR分析汗腺细胞胚胎干细胞标记和角质化细胞标记;免疫荧光染色技术检测体外培养的汗腺细胞的标志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表达。结果:(1)光学倒置显微镜下观察人外泌汗腺,游离出来的汗腺组织可以观察到盘曲成球的分泌部和较直的导管部;贴壁培养后可见汗腺上皮细胞从汗腺组织中生长出来,呈典型的上皮细胞样,排列紧密,类似铺石路状,细胞边界明显,核清晰,具有一定的增殖能力;(2)免疫组化结果显示,成人手掌部、成人头颈部和成人胸腹部的皮肤处存在的汗腺数量较少,而手术切除的婴幼儿多指样本皮肤中存在有大量的汗腺;(3)透射电镜结果显示,皮肤中汗腺导管处由两层细胞构成,且存在有张力原纤维,汗腺腺体分泌部由两类细胞构成,分别是构成管腔的细胞和肌上皮细胞;(4)PCR结果显示,体外培养的汗腺细胞,不表达胚胎干细胞的干性指标Oct-4、Sox-2和Nanog,表达增殖相关基因Klf-4和c-Myc,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞指标K14、K8、K18和K19;(5)免疫荧光染色结果显示,体外分离培养的人汗腺细胞表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞标记K14、K8和K18。结论:成功从手术切除的婴幼儿皮肤样本中分离提取出大量的汗腺组织,满足实验研究的需要;体外分离培养的汗腺细胞具有一定的增殖能力,能传代培养2~3代;对体外培养的汗腺细胞生物学特性进行鉴定,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞标记K14、K8和K18,具有上皮细胞的特性,为进一步研究汗腺细胞奠定基础。第二部分人外泌汗腺细胞来源i PS细胞的构建以及定向分化为汗腺样细胞的研究目的:构建人外泌汗腺细胞来源的i PS细胞,并对其生物学特性进行鉴定;定向诱导人外泌汗腺细胞来源的i PS细胞分化为汗腺样细胞,并对其生物学特性及功能性进行鉴定。方法:取体外培养10天后的汗腺细胞,以1×105个/皿的密度接种于6cm细胞培养皿中,加入4种含有胚胎干细胞的转录因子基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒,24小时后移除含有慢病毒的培养基,PBS冲洗,加入新鲜的汗腺细胞完全培养基;2-3天后,消化细胞接种到铺有滋养层细胞的6cm细胞培养皿中,更换胚胎干细胞培养基,培养约10天后,挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相似的克隆,接种于铺有滋养层细胞的24孔板中。培养约10天后,再次挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相似的克隆,接种于铺有滋养层细胞的6孔板中继续培养。光学显微镜观察细胞形态;RT-PCR,免疫荧光染色检测诱导后的细胞生物学特性;细胞连续培养计数分析汗腺细胞来源i PS细胞的增殖能力;体外培养的人汗腺细胞经过5-7天的培养,更换培养基为KGM2培养基,收集培养过人汗腺细胞的KGM2培养基,用0.22μm的滤器过滤,收集到的培养基为CM;取稳定培养的人汗腺细胞来源i PS细胞,以2×105个/孔的密度接种于6孔板中,24小时后,待i PS细胞贴壁后,添加汗腺细胞诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50ng/ml EGF);然后每天更换培养汗腺细胞诱导培养基;待诱导后的细胞生长至汇合率为70%,对细胞消化传代,按1传4的比例接种细胞至新的培养皿中,诱导分化21天后得到汗腺样细胞;光学显微镜观察其细胞形态;Realtime-PCR分析其基因表达情况;流式细胞仪检测汗腺相关蛋白表达;免疫荧光染色检测汗腺相关蛋白表达;电镜技术观察细胞内部结构;3D组织培养方法检测分化后的汗腺样细胞形成汗腺样结构的能力,并对形成的汗腺样结构进行免疫荧光染色检测。结果:(1)光学显微镜下观察构建的人汗腺细胞来源i PS细胞,呈克隆样生长,细胞边界明显,核质比较高,有形成类胚体的能力,与人胚胎干细胞相似;(2)PCR结果表明人汗腺细胞来源i PS细胞表达胚胎干细胞指标Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和Nanong,同时也表达汗腺相关指标K14和CD24;(3)免疫荧光染色结果显示人汗腺细胞来源i PS细胞表达胚胎干细胞标志物Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81;(4)细胞连续培养计数结果表明人汗腺细胞来源i PS细胞具有良好的增殖能力;(5)光学显微镜下观察,由汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化得到的汗腺样细胞,细胞变大,成上皮细胞样生长,核质比变小;而人汗腺细胞,细胞较大,具有明显的上皮细胞形态,呈铺路石状生长,细胞排列整齐。(6)Realtime-PCR结果显示,汗腺细胞来源i PS细胞在诱导的过程中,在m RNA水平上逐渐表达汗腺细胞指标EDA、EDAR、K8和CEA,且在分化的过程中逐渐接近汗腺细胞。(7)流式细胞仪技术检测结果表明,诱导后的细胞表达汗腺相关指标ED A大约63%,ED AR大约65%,K 8大约76%,C EA大约56%。(8)透射电镜结果 表明,诱导后得到的汗腺样细胞具有人汗腺细胞有的微绒毛,而汗腺细胞来源i PS细胞则没有微绒毛;(9)3D组织培养结果显示,汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化的汗腺样细胞能够在胶中形成汗腺管状结构,可见管状结构横截面以及管腔,可观察到诱导后的汗腺样细胞在胶中形成管腔的过程,汗腺样细胞在胶中增殖成团,中间的细胞逐渐凋亡,形成管腔;(10)免疫荧光染色的结果 表明,汗腺细胞来源i PS细胞诱导分化的汗腺样细胞在胶中形成的汗腺样结构表达部分汗腺相关基因。结论:利用i PS技术成功构建人汗腺细胞来源i PS细胞,并对其生物学特性进行了检测分析,与人胚胎干细胞相似;定向诱导人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞,光学显微镜、Realtime-PCR、免疫荧光染色、透射电镜及3D组织培养结果显示,人汗腺细胞来源i PS细胞能分化为汗腺样细胞,并且具有形成汗腺样结构的能力。第叁部分干细胞汗腺分化机制的探讨目的:在建立使用条件培养基(Condition media,CM)可诱导人汗腺来源i PS细胞分化为汗腺样细胞的基础上,分析CM中可能起关键作用的分子,为干细胞汗腺分化寻找合适的培养体系,为研究干细胞汗腺分化机制的研究提供理论依据。方法:取2×104的人汗腺来源i PS细胞(SG-i PS)铺于6孔板一孔中,加入诱导培养基(SGDM,汗腺细胞培养基:CM=1:1,额外添加50ng/ml EGF),分别取诱导7天,14天和21天的样本,利用Realtime-PCR方法检测分析不同分化时间点的汗腺样细胞的基因表达情况;针对BMP4和HGF信号通路,利用Realtime-PCR方法和免疫荧光染色的方法分析在分化过程中BMP4和HGF可能的来源,比较人汗腺细胞(SG)、人汗腺细胞培养中存在的成纤维细胞(SG-Fib)以及SG-Fib脱离SG环境培养2周的成纤维细胞(Fib);Western blot和ELISA检测CM中HGF和BMP4的存在;在SG-i PS分化到汗腺样细胞的过程中,加入HGF和BMP4拮抗剂,分化21天后Realtime-PCR方法检测汗腺相关基因的表达;在SG-i PS分化到汗腺样细胞的过程中额外添加HGF和BMP4,分化21天后Realtime-PCR方法检测汗腺相关基因的表达;结果:(1)Realtime-PCR方法检测结果显示,汗腺相关基因EDA、EDAR和LEF1的表达在分化过程中呈上升趋势,在第14天达到峰值,分化21天后表达水平接近正常汗腺细胞,说明EDA,EDAR和Left1在汗腺分化过程中发挥一定作用;进一步检测其上游基因表达,包括MAPK通路和Wnt通路中相关基因,发现ERK和β-catenin的表达呈现相关性。BMP4,HGF,FGF10是胞外与MAPK和Wnt通路有相关作用的分子,检测其受体在细胞膜上的表达,发现BMP4受体BMPR1和BMPR2及HGF受体HGFR在分化过程中均有表达,而FGF10受体FGFR2则没有表达;Realtime-PCR方法检测BMP4和HGF在分化过程中的来源结果发现,在细胞中,BMP4主要由汗腺细胞来源的成纤维细胞分泌,汗腺细胞也有不同程度的分泌,而HGF则主要由汗腺来源的成纤维细胞分泌,免疫荧光染色的结果也证明了这一结果;在汗腺来源CM中,Western blot和ELISA结果显示HGF和BMP4均有存在,这说明在CM中存在对汗腺分化具有作用的HGF和BMP4;(2)在分化过程中加入BMP4和HGF拮抗剂后,汗腺相关基因EDA、EDAR、CEA和K8均有不同程度的下降,加入HGF拮抗剂的基因表达下降的比加入BMP4拮抗剂的明显;在分化过程中额外加入BMP4和HGF重组蛋白取代CM中可能存在的未知分子,汗腺相关基因EDA、EDAR、CEA和K8表现出一定的相关性,但还不如汗腺诱导培养基诱导的效果明显。结论:由人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞的过程中,从CM中寻找到两个相关因子,HGF和BMP4在人汗腺来源i PS细胞分化为汗腺样细胞中起关键作用,得出两条可能的汗腺分化的作用途径:HGF和BMP4通路。HGF与细胞膜上的受体c-Met结合,促进细胞基质中β-catenin表达上升,β-catenin进入细胞核内与Lef1作用,激活EDA/EDAR信号通路,从而启动汗腺分化;BMP4与细胞膜上的受体BMPR1和BMPR2结合,激活MAPK通路中的其中一条ERK通路,随后ERK与细胞核中的Lef1作用激活EDA/EDAR信号通路,从而启动汗腺分化。综上所述,本课题成功分离提取了人外泌汗腺,建立了体外培养人外泌汗腺细胞的方法,并用体外培养的人外泌汗腺细胞成功构建的人汗腺细胞来源i PS细胞,对其生物学特性进行了鉴定,并在此基础上定向诱导人汗腺细胞来源i PS细胞分化为汗腺样细胞,对得到的汗腺样细胞进行了生物学特性及功能性鉴定,在诱导分化的过程中寻找到了两个可能的关键分子HGF和BMP4,建立了合适的干细胞汗腺分化培养体系,不仅为研究干细胞汗腺分化机制的研究提供有价值的理论依据,也为汗腺的功能性重建开拓新的途径,具有潜在的应用价值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
外泌汗腺论文参考文献
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