植物乳杆菌抗噬菌体菌株的选育及噬菌体灭活条件的研究

论文摘要

乳酸菌是一类广泛应用于发酵工业的益生菌,对食品生产和人体健康有着重要作用。然而乳酸菌在发酵过程中易受到噬菌体的侵染,导致发酵减缓甚至失败,给发酵行业带来严重的经济损失。因此,噬菌体污染是发酵企业面临的一个巨大威胁。本文以分离自异常发酵液的植物乳杆菌噬菌体P1和其宿主菌植物乳杆菌LP作为研究对象,从化学杀菌剂和筛选自发突变抗噬菌体菌株两方面探索防治噬菌体的有效方法,并对抗噬菌体菌株产生抗性的机制进行了探究。通过次级感染的方式筛选出7株自发突变的抗噬菌体的植物乳杆菌菌株,挑选到2株抗性稳定的非溶源性菌株,其生长状况和产酸特性与原菌株无明显差别。对植物乳杆菌LP和抗噬菌体突变体B4、B7进行转录组学分析,结果表明B4菌体内EPS的合成增加,可能是B4对噬菌体产生抗性的原因,该机制属于抑制噬菌体吸附类别;B7对葡萄糖的利用率降低,释放的能量减少以及DNA和RNA的合成能力下降,噬菌体在宿主体内可利用的ATP和嘧啶减少,无法复制遗传物质,合成相应蛋白,可能是B7对噬菌体产生抗性的原因,该机制属于流产感染系统类别。比较了 16种不同方法保存植物乳杆菌噬菌体P1的效果,结果表明以二甲基亚砜作为稳定剂,且不需对噬菌体增值液进行过滤,置于低温保存均能使噬菌体保持较高的活性,适合一般实验室进行噬菌体的保存。采用乙醇、异丙醇、次氯酸钠和过氧乙酸作为噬菌体杀灭剂,研究不同浓度对噬菌体的灭活效果。结果表明75%的乙醇作用30 min可使噬菌体完全失活;50%的异丙醇需作用50 min才能完全灭活噬菌体;次氯酸钠的灭活效果随着浓度上升而增强,400 ppm的次氯酸钠作用10 min或使用200 ppm的次氯酸钠作用20min均使噬菌体P1完全灭活;过氧乙酸作灭菌剂时,0.15%、0.25%、045%的过氧乙酸使噬菌体在10 min之内达到完全灭活,灭活效果极佳。从灭活效果和经济成本角度综合考虑,可使用过氧乙酸作为噬菌体的灭杀剂。本论文筛选到植物乳杆菌的抗噬菌体菌株,并探索其抗性机制,同时对噬菌体P1的保存方法和灭活方法进行研究,为更好地利用噬菌体、了解噬菌体抗性机制以及制定有效的噬菌体防治措施奠定基础。

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致谢

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 乳酸菌研究进展

1.1.1 乳酸菌简介

1.1.2 乳酸菌功能

1.2 噬菌体

1.2.1 乳酸菌噬菌体

1.2.2 噬菌体感染乳酸菌的分子机制

1.2.3 乳酸菌抗噬菌体机制

1.3 噬菌体污染

1.3.1 乳酸菌噬菌体污染来源

1.3.2 乳酸菌噬菌体污染的防治措施

1.4 本课题立体依据及研究内容

1.4.1 立题依据及研究目的

1.4.2 研究内容

第二章植物乳杆菌抗噬菌体菌株的选育

2.1 前言

2.2 材料与仪器

2.2.1 菌株及噬菌体

2.2.2 培养基及主要试剂

2.2.3 主要仪器设备

2.3 试验方法

2.3.1 菌种活化

2.3.2 噬菌体的增殖

2.3.3 噬菌体最佳感染复数的测定

2.3.4 抗噬菌体菌株的分离

2.3.5 抗噬菌体菌株的形态观察

2.3.6 抗性菌株及敏感菌株测序鉴定

2.3.7 抗噬菌体菌株的抗性特征测定

2.3.8 噬菌体对抗性菌株的吸附测定

2.3.9 抗噬菌体菌株生长状况和产酸特性

2.4 结果和分析

2.4.1 噬菌体的最佳感染复数

2.4.2 抗噬菌体菌株的筛选结果

2.4.3 抗噬菌体菌株的形态

2.4.4 抗性菌株及敏感菌株测序鉴定

2.4.5 抗噬菌体菌株的抗性及其稳定性

2.4.6 抗性菌株及敏感菌株的吸附特性

2.4.7 抗噬菌体菌株生长状况和产酸特性

2.5 本章小结

第三章植物乳杆菌与抗噬菌体菌株转录组学分析

3.1 前言

3.2 材料与仪器

3.2.1 菌株

3.2.2 培养基及主要试剂

3.2.3 主要仪器设备

3.3 试验方法

3.3.1 样品的制备

3.3.2 总RNA提取

3.3.3 测序文库构建及质检

3.3.4 上机测序与数据前处理

3.3.5 基因表达差异分析

3.3.6 Gene ontology（GO）与KEGG Pathway代谢途经分析

3.4 结果与分析

3.4.1 转录组测序样品RNA的质量控制

3.4.2 参考基因组及数据比对

3.4.3 植物乳杆菌敏感菌株与抗噬菌体菌株基因表达差异

3.5 小结

第四章噬菌体保存方法和灭活条件的研究

4.1 前言

4.2 材料和仪器

4.2.1 菌株及噬菌体

4.2.2 培养基及主要试剂

4.2.3 主要仪器设备

4.3 试验方法

4.3.1 噬菌体增殖

4.3.2 保存剂及保存方法

4.3.3 噬菌体裂解活性检测

4.3.4 商业灭菌剂对噬菌体的灭活效果

4.4 结果与分析

4.4.1 噬菌体的保存结果

4.4.2 不同浓度的乙醇对噬菌体的灭活效果

4.4.3 不同浓度的异丙醇对噬菌体的灭活效果

4.4.4 不同浓度的次氯酸钠对噬菌体的灭活效果

4.4.5 不同浓度的过氧乙酸对噬菌体的灭活效果

4.5 本章小结

第五章结论与展望

5.1 主要结论

5.2 后续研究展望

参考文献

附:作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵慧莹

导师: 何国庆

关键词: 植物乳杆菌,噬菌体,灭活,抗噬菌体菌株,转录组,抗噬菌体机制

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 浙江大学

分类号: TS201.3

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