华东部分地区羊源、水禽源产气荚膜梭菌的流行病学调查与毒力特性研究

论文摘要

产气荚膜梭菌是重要的人畜共患病原菌,在兽医临床已严重影响到畜禽的健康养殖。但国内有关该菌在肉羊与水禽的流行病学和毒力特性方面缺乏系统研究,一定程度制约了其临床防控。本研究采集了华东部分地区肉羊、水禽的样品,在对产气荚膜梭菌分子流行病学调查的基础上,鉴定了临床分离菌株的毒素基因型和药物敏感性。最后,运用实验小鼠对不同来源、毒素型产气荚膜梭菌的毒力进行测定,为该病的精准防控提供依据。1.华东部分地区肉羊源、水禽源产气荚膜梭菌的分子流行病学分析本实验对取自苏北地区的肉羊样品和华东部分地区的水禽样品进行快速增菌后,粗提DNA,以PCR法检测动物感染产气荚膜梭菌情况。结果显示,在肉羊临床934份粪样和20份组织样中,175份（18.74%）粪样和4份（20%）组织样检测出产气荚膜梭菌阳性。其中,健康粪样的阳性检出率为19.51%,发病粪样的阳性检出率为2.38%,检测出阳性组织样均为病死样;在水禽临床462份粪样和87份组织样中,202份（43.72%）粪样和3份（3.45%）组织样检测出产气荚膜梭菌阳性。其中,健康粪样的阳性检出率为45.79%,发病粪样的阳性检出率为4.35%;检测出阳性组织样均为健康组织。结果表明,肉羊样品中粪样和组织样产气荚膜梭菌的检出率无明显差异,水禽样品中粪样的检出率明显大于组织样,肉羊和水禽健康粪样中的检出率显著大于发病粪样,提示临床健康肉羊和水禽广泛携带该菌,且肉羊和水禽的死亡不一定是由于产气荚膜梭菌的感染。苏北肉羊源产气荚膜梭菌阳性率最高的地区为扬州,达到21.45%;华东部分地区水禽源产气荚膜梭菌阳性率最高的省份为江苏省,达到68.75%,江苏省各地的阳性率无明显差异。2.不同动物源产气荚膜梭菌分离株的毒素型分析将上文检测为阳性的菌液进行产气荚膜梭菌分离,单菌落进行PCR验证、革兰染色镜检、亚甲基蓝染色镜检、生化试验和牛乳发酵试验。实验共分离获得77株菌,均鉴定为产气荚膜梭菌。利用已发表引物,PCR检测本实验分离株所包含的毒素种类、确定各株的毒素型。结果显示,在68株肉羊源产气荚膜梭菌中,63.24%（43/68）的毒素基因型为A型（携带α毒素）,36.76%（25/68）为D型（携带α、ε毒素）;9株水禽源产气荚膜梭菌均为A型（9/9）。未发现B（携带α、β、ε毒素）、C（携带α、β毒素）、E（携带α、ι毒素）型。说明该地区肉羊大多携带A型菌,少部分携带D型菌;水禽只携带A型菌。3.产气荚膜梭菌分离株的药物敏感性分析选取肉羊源菌45株、水禽源菌5株,采用纸片扩散法对不同地区、不同动物种类的选择菌株进行药物敏感性试验,选择12种抗生素,以抑菌圈大小判断菌株对抗生素的敏感性。结果显示,对林可霉素、庆大霉素的耐药菌株比例较高,耐药率分别为34%（17/50）和32%（16/50）;大多数菌株都双重耐药,其中对两种及其以上抗生素耐药的菌株比率达56%（28/50）,只有少数为单一或三重耐药。南通、宿迁和徐州地区羊源菌株对庆大霉素和林可霉素、连云港地区羊源菌株对强力霉素的耐药比例较高,耐药率均大于50%;徐州地区水禽源菌株对四环素、九江地区水禽源菌株对四环素和复方新诺明、南昌地区水禽源菌株对恩诺沙星和复方新诺明、上饶地区水禽源菌株对复方新诺明的耐药比例较高,耐药率均为100%。A型菌株较D型对四环素、恩诺沙星和复方新诺明的耐药性稍高,其余均无明显差异。结果提示,养殖场存在着不合理使用抗生素的现象,导致菌株出现多重耐药风险。4.不同毒素型产气荚膜梭菌的毒力比较与小鼠感染试验将小鼠随机分为4组,在对试验菌进行平板菌落计数后,分别腹腔注射梭菌増菌培养基（第1组）、肉羊A型产气荚膜梭菌BC51株（第2组）、肉羊D型产气荚膜梭菌HC40株（第3组）和水禽A型产气荚膜梭菌IY1-2株（第4组）。以Reed-Muench法计算细菌的LD50。结果显示,第2组细菌浓度的LD50为5.6× 107 57CFU/mL,第3组为5.7× 105 5CFU/mL,第4组为3×106375CFU/mL。可见,肉羊源D型HC40株的毒力最强,水禽源A型IY1-2株次之,肉羊源A型BC51株毒力最弱。同种动物源、不同毒素型产气荚膜梭菌的毒力不同,相同毒素型、不同动物源的毒力不同的现象,可能与D型菌携带的α和ε毒素的协同作用、菌株在不同种动物肠道中定植的时间以及不同动物源相同毒素型菌株所携带的其他毒力因子的不同有关。本实验结果为后续研究提供了一定的思路和方向。小鼠感染产气荚膜梭菌后,发病迅速,腹部膨大、肠道臌气明显;皮肤呈青铜色、甚至黑色;解剖后可闻到有硫化氢的气味;肝脏、胃部、小肠等组织器官中发现有出血、充血、坏死、破溃等病变。提示该菌在动物体内大量繁殖,产生的毒素随血液循环系统到达全身,导致多器官损伤。本实验所得出的数据为下一步建立稳定的小鼠产气荚膜梭菌感染模型提供了参考,而感染模型的建立也可为各个学科对产气荚膜梭菌的深入研究提供合适的动物模型。全文研究结果提示,临床健康肉羊和水禽广泛携带产气荚膜梭菌,且以A型为主,而养殖场仍存在滥用抗生素的现象。本研究结果为该病的精准防控提供了依据,也为后续进一步研究提供了思路和方向。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张彤宇

导师: 邢华,成大荣,徐向明

关键词: 产气荚膜梭菌,肉羊,水禽,流行病学,药物敏感性,毒力特性

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 江苏现代农业(肉羊)产业技术体系疾病防控创新团队(SXGC[2017]301),江苏现代农业(肉羊)产业技术体系疾病防控创新团队(JATS[2018]306),江苏现代农业(水禽)产业技术体系集成创新中心(SXGC[2017]248)

分类号: S852.61

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000337

总页数: 65

文件大小: 4454K

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