一、绿豆几丁质酶的纯化和酶学性质分析(英文)（论文文献综述）
谷新晰[1]（2021）在《嗜热烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系解析及协同机制研究》文中研究说明魔芋低聚糖（konjac oligosaccharides,KOS）是一种功能性低聚糖,在食品、饲料和医药等行业有广泛的应用价值和前景,近几年倍受国内外学者关注。在寡糖的制备方法中,绿色、高效的生物酶解魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGM）是最具前景的生产方式。而作为底物的魔芋葡甘聚糖在水溶液中具有较高的粘度,以至无法靠增大底物浓度的方式提高产量。β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶等几个常用的甘露聚糖降解酶可以发挥一定的水解作用,但依然存在水解效率低,产物具有聚合度偏好性等问题,极大限制了魔芋低聚糖工业化生产的发展。本研究针对魔芋葡甘聚糖复杂结构,挖掘并优化有工业应用价值的高效降解魔芋葡甘聚糖酶系,以期探究生物降解魔芋葡甘聚糖全貌,促进魔芋低聚糖高质高效制备。为此,本研究拟从我国酿酒大曲中筛选高效降解魔芋葡甘聚糖的嗜热真菌;进而利用转录组和蛋白组学技术,分析嗜热真菌菌株在魔芋葡甘聚糖降解过程中降解酶系组成,并确定魔芋葡甘聚糖降解关键基因;最终对关键基因进行异源表达及酶学特性的表征,探究关键降解酶协同降解魔芋葡甘聚糖的作用,以期为魔芋葡甘聚糖大分子酶降解提供理论支持,为魔芋低聚糖制备工业提供优良的酶系资源。主要研究结果如下:1.酿酒大曲中高效降解魔芋葡甘聚糖嗜热真菌的筛选、鉴定及评估本研究以中、高温大曲为试验对象,从中筛选嗜热真菌,并依据形态学观察及ITS序列对菌株进分类鉴定。通过对粗酶液反应温度,甘露聚糖酶酶活力,及降解魔芋葡甘聚糖产物的粘度、聚合度等变化评估各菌株在魔芋葡甘聚糖降解中的能力,最后采用转录组学技术对性状优良的菌株进行产酶谱测定分析,全面评价嗜热真菌的产酶潜力。从中、高温大曲样品中共分离出20株产甘露聚糖酶的嗜热真菌,经形态学观察和ITS序列同源性分析后对其鉴定,发现这些菌株分别属于Lichtheimia ramosa,Rhizomucor pusillus,Rhizomucor tauricus,Rasamsonia composticola,Thermoascus crustaceus,Aspergillus fumigatus和Rhizopus microsporus。进一步研究发现Aspergillus fumigatus HBHF5的胞外发酵液水解魔芋胶可以使其黏度下降35.8%,水解产物的总还原糖（TRS）、直接还原糖（DRS）分别为1.88mg/m L、0.96mg/m L,水解产物的平均聚合度（DP）为1.97。在麸皮诱导条件下,共有239个CAZymes类基因表达,主要为淀粉、纤维素、半纤维素降解相关酶类。综上可知,A.fumigatus HBHF5可降解魔芋葡甘聚糖且糖苷水解酶系丰富,是一株有巨大应用潜力的产酶菌株。2.烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系的研究以葡萄糖或魔芋葡甘聚糖为唯一碳源培养的嗜热真菌A.fumigatus HBHF5为样品,利用转录组和蛋白质组技术进行A.fumigatus HBHF5的组学研究,解析该菌在魔芋粉诱导下差异表达基因相关信息,并参考A.fumigatus AF293基因组注释信息,探究该真菌在魔芋葡甘露聚糖降解需所酶的种类,为后续研究提供指导。经分析,该菌在转录组水平共鉴定9449个基因,其中显着上调644个基因,下调588个基因。在蛋白质组水平共鉴定到629个蛋白,其中156个蛋白上调表达,348个蛋白下调表达。两个组学差异表达的基因数为106个,其中56个基因上调表达,50个基因下调表达。进一步分析发现这些上调差异表达基因多为碳水化合物酶（CAZymes）,如纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、糖苷酶及辅助酶等,这一发现扩展了对甘露聚糖降解酶系的认知。3.降解魔芋葡甘聚糖关键酶的酶学特性表征及协同作用研究依据组学分析结果,将甘露聚糖降解酶基因进行真核异源表达、纯化及酶学性质分析,为后续研究提供试验材料。利用获得的酶蛋白分子进行魔芋低聚糖的制备研究,分析其降解活力和魔芋低聚糖成份的组成,筛选出制备魔芋低聚糖的相关酶。对获得的酶进行协同作用分析,筛选出具有协同制备魔芋低聚糖的酶类。从烟曲霉HBHF5降解魔芋葡甘聚糖上调差异表达基因谱中,成功对13个基因进行了异源表达,包括2个甘露聚糖酶（AfMan5A、AfMan5B）,3个果胶酶（AfPly C、AfPly A、AfPGL）,5个纤维素酶（AfCel5A、AfCel5B、AfEn,Afhp、AfPGL）,1个几丁质酶（AfChi）,1个单宁酶（AfTan）和1个膨胀素（AfSwol）,并对其进行了酶学特性表征及协同作用的分析研究。经测定,其中甘露聚糖酶AfMan5A、AfMan5B,果胶酶AfPGL,纤维素酶AfCel5A、AfCel5B、AfEn、Afhp以及膨胀素AfSwol,8个酶为典型嗜热酶,最适温度在60℃及以上,特别是纤维素酶AfCel5B,最适温度达到80℃。重组嗜热酶均具有良好的热稳定性,如AfMan5A在60℃条件下,保温处理60min,能保留95%酶活力;AfCel5B在70℃条件下,保温处理60min,能保留95%酶活力。重组酶同时具有宽阔的p H稳定范围,如嗜热酶AfEn,Afhp,AfCel5B,AfPGL在p H3-10能够保持80%以上的酶活力,特别是嗜热纤维素酶AfCel5B,在p H3-11范围内活性始终保持100%,基本不发生变化。唯一嗜碱酶为果胶裂解酶AfPly A,最适p H为8.0,在p H8-10能维持80%酶活力。重组酶与AfMan5B协同作用研究的结果表明,纤维素酶和β-甘露聚糖酶在共同降解魔芋葡甘聚糖时表现出良好协同作用,协同效率在1.30-3.96,特别是当AfCel5B先作用于魔芋葡甘聚糖底物后,甘露聚糖酶AfMan5B水解产物中总还原糖释放量提高了约300%。单宁酶也具有明显的促降解效果,最高可使水解效率提升70%。本研究首次发现,膨胀素也在魔芋葡甘聚糖降解中发挥积极作用（之前未见报道）,可以提升10～30%的水解效率;三个重组果胶酶均表现出不同程度的促进水解效果,协同效率在1.19-1.25,多聚半乳糖醛酸酶AfPGL最高可提升25%还原糖释放量。因此可以推断,若实现魔芋葡甘聚糖大分子高效降解,除需要β-甘露聚糖外,还应有纤维素酶、单宁酶、膨胀素、果胶酶等多酶系的共同作用。以上发现为魔芋葡甘聚糖的酶解提供了新的思路,丰富了现有的甘露聚糖降解理论。本研究从酿酒大曲中成功获得了一株产魔芋葡甘聚糖降解酶系的嗜热真菌Aspergillus fumigatus HBHF5,掌握了Aspergillus fumigatus HBHF5在魔芋葡甘聚糖降解过程中的双组学上调蛋白表达谱,并成功表达了13个重组魔芋甘露聚糖降解关键酶,明确了甘露聚糖酶AfMan5B与其他重组蛋白在魔芋葡甘聚糖降解过程中的协同作用关系,从理论上拓展了对甘露聚糖降解中协同作用酶系的认知,也为魔芋葡甘聚糖的酶解提供了新的思路。
邓俊劲[2]（2020）在《新型蛋白酶及几丁质酶的开发及其在虾加工废弃物中的应用》文中提出海洋含有丰富的蛋白质、几丁质等生物质,其中几丁质是自然界中除纤维素外的第二大生物质。随着水产养殖业的迅速发展,水产品加工业每年都会产生大量的废弃物,尤其是甲壳类动物的外壳。以虾为例,虾有50%以上的部分不能被直接食用,仅广东省每年虾加工产业产生的废弃虾壳就有几十万吨。这些废弃物通常被扔到垃圾堆或海洋中,造成了严重的环境污染与资源浪费。废弃物制成的虾壳粉,含有约50%的蛋白质、20%的几丁质以及天然抗氧化剂虾青素等有价值的组分,然而这些组分在虾壳中相互紧密结合,不能有效被动物消化吸收利用,因此虾壳粉价格仅为450元/吨,远低于营养价值相当的鱼粉（10,000元/吨）。传统的强酸碱等理化加工工艺抛弃了虾壳中的蛋白质和其他有价值组分,会造成严重的污染和浪费。蛋白酶、几丁质酶水解虾壳是其高值利用最有效且环境友好的技术,目前因缺乏高效的蛋白酶及几丁质酶成为该技术的瓶颈。本课题使用毕赤酵母和枯草芽孢杆菌表达系统进行蛋白酶与几丁质酶基因的异源表达,得到了酶活较高的5个酸性蛋白酶及1个几丁质酶,分别为来源于哈茨木霉的P6281（321.8 U/m L）,来源于热带假丝酵母的Candidapepsin,来源于近平滑假丝酵母的SAPP1,来源于卷枝毛霉的Saccharopepsin和类凝乳酶M3,以及来源于哈茨木霉的几丁质酶Chit46（31.4 U/m L）,并通过镍柱亲和层析纯化后对P6281和Chit46的酶学性质等进行了分析研究。酶产量在同类文献中处于较高水平,为后续应用打下基础。本课题对制备的蛋白酶及几丁质酶对虾壳废弃物的水解效果进行了研究,结果表明酸性蛋白酶P6281及Saccharopepsin对虾壳蛋白的水解效果最好。使用分步酶解对虾壳废弃物中的蛋白质进行回收,在最优条件下,虾壳蛋白的回收率达到91.8%。对虾壳蛋白水解产物的氨基酸组成进行分析,其必需氨基酸含量分别为45.1%和49.1%。脱蛋白后的虾壳使用几丁质酶Chit46处理,在最优条件下,几丁质的回收率达到88.9%。对几丁质水解产物的成分进行分析,发现其中含有聚合度2-6及其他3个聚合度更大的几丁寡糖。去除蛋白质和几丁质后的虾壳再使用乙酸乙酯抽提取,可以很容易地从中提取出虾青素,提取产物具有很强的抗氧化性。该酶解工艺避免了传统工艺中盐酸和氢氧化钠的大量使用,减少了对环境的污染,而且温和的反应条件避免了对虾壳中各成分结构和活性的破坏。在上述虾壳废弃物回收处理的基础上,本课题进一步对几丁质酶进行了改造,把来源于枯草芽孢杆菌糖苷酶的多糖结合域融合到Chit46上。成功制备了3个融合几丁质酶,融合几丁质酶的比酶活和底物结合活性获得了显着的提高,并且能直接水解虾壳废弃物,而无需先经过酸性蛋白酶预处理,打破了大部分几丁质酶不能直接处理虾壳的限制。制备的水解物是一个良好的碳氮源,能很好地支持微生物生长。体外模拟消化实验表明水解剩余物的消化率远远高于虾壳粉,处理后的虾壳废弃物的营养价值获得了提升。综上所述,本课题在制备得到高活性酸性蛋白酶及几丁质酶的基础上,对南美白对虾虾壳废弃物的回收利用进行了研究,建立了一套虾壳废弃物综合利用的绿色工艺,避免了传统工艺中强酸强碱试剂的使用,具有很大的经济和实用价值。
王贺[3]（2019）在《UV-C照射胁迫诱导凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶激活的机制研究》文中认为对虾加工过程中会产生大量的虾头副产物。虾头含有丰富的内源酶,酶活性高,易发生自溶。可利用内源酶的自溶作用回收虾头中的蛋白质等有用成分,也可提取内源酶制备生物酶制剂。前期研究发现经过UV-C照射胁迫可以促进虾头的自溶作用,主要由于其激活了内蛋白源酶,但其对内源蛋白酶的激活机制和对其他内源酶是否有激活作用尚不明确。本文在探究UV-C照射胁迫对凡纳滨对虾虾头主要内源酶激活效果的基础上,以其内源蛋白酶为研究对象,通过比较分析UV-C照射胁迫前后分离纯化的内源酸性、碱性蛋白酶在酶活影响因素、酶学性质、分子量及分子构象方面的差异性探讨其诱导凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶激活的分子机制。主要研究结果如下:（1）以酶活力为评价指标,研究比较温度、p H对UV-C照射胁迫前后凡纳滨对虾虾头主要内源酶酶活的影响规律。结果表明:UV-C照射胁迫前后虾头内源酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和多酚氧化酶的最适p H和最适温度无明显变化,对脂肪酶和几丁质酶的最适p H有所改变,最适温度无显着影响。虾头内源酸性蛋白酶最适为p H 3,温度为60℃左右;虾头内源碱性蛋白酶最适的p H为8,温度为50℃左右;内源性几丁质酶最适的p H为5～6,温度为40℃左右;内源性脂肪酶最适为p H 10,温度为40℃左右;内源性多酚氧化酶最适为p H 8,温度25℃左右。UV-C照射胁迫对凡纳滨对虾虾头主要内源酶包括酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶等均具有显着的激活作用。（2）以凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶为研究对象,通过专一性抑制剂、无机离子等因素研究比较UV-C照射胁迫前后内源蛋白酶酶活的变化规律。结果表明:加入适当的Na Cl可使酶活提高,且UV-C照射胁迫前后的酶活变化趋相似;其最佳料液比为1:3。通过UV-C照射胁迫后虾头内源碱性蛋白酶酶活提高了42%,而加入专一性胰蛋白酶抑制剂的虾头内源碱性蛋白酶酶活仅提高5%;UV-C照射胁迫后虾头内源酸性蛋白酶酶活提高了59%,而加入专一性胃蛋白酶抑制剂的虾头内源酸性蛋白酶酶活显着提高了36%。以上说明虾头内源酸性蛋白酶中有类胃蛋白酶活性,虾头内源碱性蛋白酶中有较高的类胰蛋白酶活性。（3）通过硫酸铵分级沉淀,结合凝胶层析、离子交换层析、电泳等手段对UV-C照射胁迫前后的虾头内源蛋白酶进行分离纯化,对其高活性内源蛋白酶测定其分子量并进行同源性分析与鉴定。结果表明:UV-C照射胁迫处理前后虾头内源酸性蛋白酶最佳沉淀的硫酸铵浓度为70%,虾头内源碱性蛋白酶的最佳沉淀的硫酸铵浓度为60%。通过纯化后的虾头内源碱性蛋白酶的分子量约为23 k Da,虾头内源酸性蛋白酶的分子量约为32 k Da。虾头内源碱性蛋白酶同凡纳滨对虾的胰蛋白酶分子结构具有很高的同源性,具有类胰蛋白酶的性质;虾头内源酸性蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶的分子结构具有很高的同源性,具有类胃蛋白酶的性质。（4）采用波谱解析手段探究UV-C照射胁迫对虾头内源蛋白酶空间构象的影响。结果表明:UV-C照射胁迫处理对于虾头内源碱性蛋白酶的二级结构变化不大,但是经过UV-C照射胁迫处理可能使得虾头内源碱性蛋白酶的空间构象适度展开,使得活性中心更易与蛋白底物结合,更易发挥其催化能力。虾头内源酸性蛋白酶经过UV-C照射胁迫处理经过圆二色谱分析可看出向β-折叠的低频区移动,经过荧光色谱分析UV-C照射胁迫处理后最大发射波长的峰位出现红移,红移跨度为10～25 nm。说明经过UV-C照射胁迫可能破坏了蛋白质分子中的氢键等各种次级键,进而破坏和改变蛋白的空间结构。在蛋白质变性过程中,芳香族氨基酸的分子侧链基团会逐渐暴露于水溶液里,其所处的环境极性增加,进而使其吸收峰增大。UV-C照射胁迫诱导内源蛋白酶空间构象的改变可能是其被激活的主要原因。UV-C照射胁迫可能使内源蛋白酶的空间构象适度展开,使得活性中心更易与蛋白底物结合,更易发挥其催化能力。
焦正龙[4]（2019）在《地衣芽孢杆菌TG116生防机制研究》文中研究说明由丝状真菌引起的植物病害是目前农业生产面临的主要问题,常规的化学防治方法存在着诸多诟病,例如农药残留、环境污染等问题,因此以环境友好型生防菌剂为代表的生物防治逐渐受到了人们的青睐,并得到了长足发展。目前,人们已经分离到了许多对植物病害具有良好防治效果的生防菌剂,并投入到了生产实践中。芽孢杆菌是细菌中研究最多的生防菌资源,研究发现其可以通过生态位竞争、直接拮抗、诱导植物产生系统防御和通过促进植物生长等途径达到防病治病的目的。生防芽孢杆菌通过直接产生蛋白酶、纤维素酶及几丁质酶等水解酶类水解病原真菌细胞壁来杀灭病原真菌是其重要的生防机制之一。TG116是本实验室从独角莲块茎中分离到的1株内生地衣芽孢杆菌。前期的研究表明,TG116对植物病原真菌具有广谱拮抗性,存在潜在的开发价值,但其抑菌机制尚不清楚。本研究以TG116为研究对象,采用层析和质谱联用等技术,分离、纯化和鉴定了TG116部分抗菌蛋白组分,并在生理生化、形态学和分子生物学水平探讨了其生防机制。主要研究结果如下:1.TG116对植物病原真菌具有广谱抗菌活性与极强的生长能力和环境适应性。2.TG116发酵液对植物病原真菌具有抗菌活性,最适发酵条件为温度30℃,pH 7.5,发酵时间120 h,增加氧含量可以提高发酵液的抑菌活性。3.70%饱和度（NH4）2SO4是最佳的沉淀条件,得到的粗蛋白具有稳定的抑菌活性及蛋白酶与纤维素酶等生物学活性,且具有良好的温度稳定性与紫外照射稳定性。4.TG116产蛋白酶最佳单因素发酵条件为温度40℃,pH 8.0,时间48 h,溶氧量越大,蛋白酶活性越高,通过响应面法优化后,最佳发酵条件为温度40.8℃、pH 8.0、时间55 h,可使蛋白酶活性提高4倍;酶学性质表明该蛋白酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为8.5,40℃水浴3 h后可保留80%以上的活性,具有良好的稳定性,50℃水浴2 h后保留60%以上的活性,高于60℃时失活;在pH大于7时,该蛋白酶具有较好的稳定性,活性基本保持不变,但在偏酸的环境下,迅速失活,所以为碱性蛋白酶;金属离子Mn2+、Co2+对蛋白酶酶活力具有一定的激活作用,其它金属离子如Mg2+、Ca2+、Na+、Zn2+、K+具有一定的抑制作用,变性剂具有强烈的抑制作用,且浓度越大抑制性越强,其中,EDTA的抑制性最强。5.TG116产纤维素酶最佳单因素发酵条件为温度40.0℃,pH 7.0,时间51 h,发酵体积为75 mL,通过响应面法优化后,最佳产纤维素酶发酵条件为温度39.0℃、pH 7.0、时间51.0 h,可使纤维素酶活性提高2倍;酶学性质表明该纤维素酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为3.5,在40℃水浴3 h后可保留80%以上的活性,具有良好的稳定性,50℃水浴2 h后保留60%以上的活性,高于60℃时该纤维素酶失活;在pH小于6时,该纤维素酶具有较好的稳定性,活性基本保持不变,但在偏碱的环境下,基本丧失酶活力,说明该纤维素酶为酸性纤维素酶;金属离子Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、NH4+、Li+对纤维素酶酶活力具有一定的激活作用,其它金属离子K+、Mn2+具有一定的抑制作用,变性剂具有强烈的抑制作用,且浓度越大抑制性越强,其中,Tris的抑制性最强。6.70%饱和度（NH4）2SO4沉淀得到的粗蛋白经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析,得到了12个不同的组分,其中5个具有明显的抑菌活性;将其中1个组分进行Sephadex G-50分子筛层析与SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得到了1条明显的条带,鉴定为胞外丝氨酸蛋白酶;该蛋白酶分子量约为86.17 kDa;显微观察发现该酶可导致病原真菌菌丝膨胀、折叠等异常现象,该蛋白酶还能影响孢子的萌发和发育,表现为使得孢子萌发率大幅度下降,已萌发孢子芽管细胞出现畸形或膨大,变成圆泡状物等。7.以已报道的丝氨酸蛋白酶编码基因为参照,通过设计专化引物克隆得到了1条长为1617 bp的片段,信息学证明其编码胞外丝氨酸蛋白酶,命名为Pase基因,并提交至GenBank（MK659579）;该蛋白酶相对分子量为53.84 kDa,理论等电点为5.29,分子式为C2321H3715N623O757S12;蛋白N端含有明显的疏水性,有3个可能跨膜结构,构成该蛋白的二级结构有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲等;具有3个保守序列,肽酶抑制剂I9（Peptidase inhibitor I9）、肽酶S8家族（Peptidase S8 family）和细胞表面丝氨酸蛋白酶（PAC5alike）;在细胞中可能存在于细胞质、线粒体基质、过氧化物酶体和溶酶体中,其N端含有1段信号肽,可能与该蛋白分泌到胞外的过程有关;最后对其蛋白质模体位置进行分析,发现可能具有N-糖基化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、丝氨酸蛋白酶,枯草杆菌酶家族,组氨酸活性位点与丝氨酸蛋白酶,枯草杆菌酶家族,丝氨酸活性位点,这些位点的存在与该蛋白发挥其功能可能有很大的关系。
姜顺[5]（2019）在《N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的表达研究及其应用》文中研究表明N-乙酰-β-D氨基葡萄糖（Glc NAc）是形成几丁质（又名甲壳素）的基本单位,它以β-（1,4）糖苷键聚合而成线状多聚物——几丁质。Glc NAc是葡萄糖衍生物,具有重要的生物功能,不仅是许多植物、真菌细胞壁的组成成分和昆虫外壳的结构成分,也是哺乳动物和人体结缔组织、关节中糖蛋白的重要成分。Glc NAc还具有抗菌消炎、预防骨关节疾病、促进伤口愈合等作用,因此在医药、保健品、食品和化妆品等领域具有广泛的应用。Glc NAc主要以几丁质为原料来生产,几丁质广泛存在于真菌、酵母等的细胞壁、或昆虫及虾蟹等的外骨骼中,是自然界中含量仅次于纤维素的天然多糖物质,全球每年水产产品消费后产生的废弃物中,几丁质的含量就超过了数千万吨,需要加以综合利用,变废为宝。传统的方法是使用浓酸、强碱将几丁质降解成N-乙酰氨基葡萄糖单体,这种化学方法水资源消耗大,而且环保压力大,因此,发展环境友好、条件温和的酶法水解几丁质成为了研究热点。酶法降解几丁质制备Glc NAc,具有易控制、产物纯度和得率高等优点。通过几种酶的联合水解,可提高生产效率和产品得率。例如几丁质酶能将几丁质水解成壳二糖,进一步在N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶（NAGases）的作用下水解成Glc NAc。因为NAGases是外切酶,活性普遍偏低,酶法制备Glc NAc的效率较低,因此,我们希望能提高NAGases的表达量和酶活力,增强胶体几丁质的酶解效率。本研究中,我们首先在毕赤酵母中成功了表达了来源于枯草芽孢杆菌的乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶Bs Nag Z,按毕赤酵母的密码子偏好性,优化并合成枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168来源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因nag Z,将合成的Bsnag Z基因克隆至表达载体p PICZαA上,转入毕赤酵母X33菌株中,成功进行了异源表达;通过不断提高Zeocin抗性素的浓度,筛选到一株Bsnag Z基因4拷贝整合的菌株,其发酵上清的酶活力达到3.2 U/m L,与单拷贝相比,酶活力提高了4.17倍。对重组酶进行酶学性质分析:最适温度60°C,最适p H 6.0。同时,重组酶具有良好的稳定性:在p H 4.5-10预处理12 h,仍保留80%以上的酶活力;将该酶置于50°C预处理1 h后,仍有80%的残余酶活.将重组Bs Nag Z应用于胶体几丁质的酶解中。酶解结果表明,Nag Z在50°C条件下酶解效果较好,在400μL酶解体系中加入150μL（7.5 U/m L）的Nag Z酶液,250μL 3%胶状几丁质底物,水解1 h后可以检测到N-乙酰氨基葡萄糖单体产生,但是产量极少。进一步通过偶联几丁质酶,几丁质酶先将胶体几丁质水解为二糖,再在Nag Z的作用下水解成Glc NAc,产物量有了很大的提升。其次,为了获得更多、更好的NAGase资源,我们根据Bs Nag Z的氨基酸序列在NCBI基因组数据库中筛选出来源于Bacillus coagulans DMS1的Nag Z基因Bc Nag Z,以及来源于Bacillus lichheniformis WX02的Nag Z基因Bl Nag Z,将两个基因都克隆到p ET-26b载体上,并在大肠杆菌中成功表达,通过对重组蛋白进行酶学性质进行研究,Bl Nag Z和Bc Nag Z的最适p H都为6.0,而Bc Nag Z的最适温度为75°C,较Bl Nag Z的60°C高。比较两种蛋白的表达水平和酶活力,Bl Nag Z酶活力更高、表达情况更好,因此对Bl Nag Z的诱导表达条件进行了优化,优化后,发酵上清的酶活力达到13.2 U/m L,提高了10倍。最后,将重组Nag Z应用于胶体几丁质的酶解中。酶解结果表明,Nag Z在50°C条件下酶解效果较好,在400μL酶解体系中加入150μL的Nag Z酶液,250μL 3%胶状几丁质底物,水解1 h后可以检测到N-乙酰氨基葡萄糖单体产生,但是产量极少。进一步通过偶联几丁质酶,几丁质酶先将胶体几丁质水解为二糖,再在Nag Z的作用下水解成Glc NAc,产物量有了很大的提升。而且由于Bl Nag Z的比酶活力较Bs Nag Z高,在同等酶量的情况下,Bl Nag Z的水解效率更快。综上所述,本研究首次将Bs Nag Z在毕赤酵母进行异源表达,并通过Zeocin抗性筛选提高基因的拷贝数,从而提高重组Bs Nag Z的表达量。同时将Bs Nag Z应用于胶体几丁质的酶解实验中,水解其产生Glc NAc单体。并通过偶联几丁二糖酶,可有效降解胶体几丁质,增加Glc NAc的产量。为了得到酶活力更高的Nag Z,我们在大肠杆菌中异源表达了来源于Bacillus coagulans DMS1的nag Z基因（Bc Nag Z）,以及来源于Bacillus lichheniformis WX02的nag Z基因（Bl Nag Z）,并对Bl Nag Z的发酵表达优化,得到的酶液也进行酶解实验,结果显示重组Nag Z能水解胶体几丁质得到单糖。本文为酶法高效生产Glc NAc奠定了基础。
陈聪聪[6]（2018）在《产壳聚糖酶Mitsuaria sp.C4菌株的研究》文中认为壳聚糖酶（chitosanase,EC 3.2.1.132）又称壳聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶（chitosan N-acetylglucosaminohydrolase）,专一性强,水解线性壳聚糖成壳寡糖。壳寡糖分子量低,易溶于水,易被人体吸收。我国已知的产壳聚糖酶菌株,产酶能力尚未能满足工业化生产需求,寻找新酶源,提高菌株产酶能力,极具研究价值。本研究从福建省泉州市惠安县崇武镇西沙湾沿海500米处土壤中筛选得到一株产壳聚糖酶活力较高的菌株,经生理生化和分子生物学鉴定命名为Mitsuaria sp.C4,通过紫外线诱变筛选得到一株遗传稳定、产酶活力高的Mitsuaria sp.ZY3,酶活力相对原始出发菌株提高2.77倍。结合单因素试验和响应面分析,其最佳产酶发酵条件如下（%,w/v）:1.6%胶体壳聚糖、0.14%K2HPO4.3H2O、0.06%KH2PO4、0.1%MgSO4.7H2O、0.6%蛋白胨和0.06%酵母粉,培养温度30℃,培养时间3 d,起始pH6.5,接种率1%,装液量35 mL,摇床转速150 rpm,最适产酶培养条件下,酶活力高达7.892 U/mL。采用硫酸铵分级盐析、透析和Sephadex G-75凝胶过滤层析方法从Mitsuaria sp.C4菌株上清发酵液分离提纯壳聚糖酶,SDS-PAGE电泳验纯,分子量大约为34 kDa。酶学性质研究表明:该酶酶促反应最适温度为40℃,最适pH为7.2,金属离子溶液浓度为20 mmol/L,以Mg2+为对照,结果发现Ca+、Zn2+、K+、Mn2+等对酶具有不同程度的抑制作用。以粉末壳聚糖为底物时,酶促反应表观米氏常数Km值为 2.449 g/L,Vmin 为 4× 102 g.L-1.min-1。提取Mitsuariasp.C4菌株基因组DNA,二代和三代测序结合,根据测序结果拼接、组装注释及分析,得到一个完整的约6 Mb的环状基因组DNA。
杨正凤[7]（2018）在《滇金丝猴粪便微生物宏基因组来源几丁质酶和β-半乳糖苷酶的研究》文中进行了进一步梳理几丁质酶（EC 3.2.1.14）通过断裂N-乙酰-D-氨基葡萄糖间的β-1,4-D-糖苷键将几丁质降解为不同聚合度的壳寡糖,被进一步开发和广泛利用,在避免资源浪费的同时也缓解了环境污染问题。β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）通过断裂乳糖中的β-1,4-D-半乳吡喃糖苷键将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,使人体更好地吸收和利用,在食品等领域应用广泛。目前,开发研究不同来源、具有更好特性的新型几丁质酶和β-半乳糖苷酶对于进一步扩大几丁质酶和β-半乳糖苷酶的应用领域和范围具有重要意义。动物胃肠道中存在大量、独特的微生物菌群,与动物的机体免疫、食物消化等方面密切相关,同时动物胃肠道微生物又是一个相对独立、巨大待开发的酶基因资源库,因此从中挖掘各种微生物酶资源并进行研究和开发利用具有重要意义。本论文从已构建的滇金丝猴粪便微生物宏基因组文库出发,结合生物信息学分析,以Fosmid质粒DNA为模板,利用PCR扩增获得几丁质酶基因chitiRBM1和β-半乳糖苷酶基因galRBM1,在Escherichia coli BL21（DE3）中异源表达并纯化后,对重组酶进行了相关性质及初步应用研究。结果如下:（1）重组几丁质酶ChitiRBM1的最适温度为50℃,最适pH为6.0,最适底物为胶体壳聚糖,对应的Km、Vmax以及Kcat分别为4.2419 mM,52.63μmol/h/mg,0.7252 min-1。在30℃、40℃条件下耐受20 h,保持70%以上相对酶活。pH5-9条件下耐受20 h,剩余70%以上的相对酶活。0-15%NaCl条件下耐受12 h后,该酶保持80%以上的相对酶活,终浓度30%NaCl条件耐受12 h下仍保留30%以上相对酶活。10mM终浓度的Mn2+、Fe2+对galRBM1酶活具有强烈激活作用,终浓度10mM Co2+和1%β-毓基乙醇对其酶活有明显促进作用,而终浓度10mM的Cu2+、Fe3+、Ag+、Ni2+、1%Tween-80对其酶活具有明显抑制作用,其余离子或试剂则对重组酶的酶活无明显影响。（2）β-半乳糖苷酶galRBM1的最适温度为50℃,最适pH为7.0,最适底物为ONPG（邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷）,对应的Km、Vmax以及Kcat分别为0.9862 mmol/L,5.2966 mmoL/min/mg,3.0896 s-1。在30-50℃条件下耐受4 h,剩余酶活保持85%以上。在pH3和pH4酸性条件下耐受1 h,剩余相对酶活分别为17.46%和37.87%,pH5-10范围内,酶活均保持80%以上,pH11的强碱条件下仍有70%以上的酶活。0-10%NaCl条件下耐受1 h,相对剩余酶活均保持80%以上,30%NaCl条件下耐受l h其相对酶活仍剩余40.87%。终浓度10mM的Fe3+,Fe2+对重组酶galRBM1酶活具有强烈激活作用,Cu2+、Ag+、1%Tween-80对其酶活具有明显抑制作用,其余金属离子及化学试剂无明显影响。综上,本研究获得一个几丁质酶和β-半乳糖苷酶,兼具pH耐受范围广且pH、温度稳定性良好,可耐受多种金属离子并具有较好的耐盐性等优良工业特性,使其在医药、食品、农业及乳制品加工和开发等领域中具有应用潜力。
牛鑫[8]（2016）在《灰盖鬼伞菌柄细胞壁结构、组成及细胞壁重构酶的研究》文中指出大型真菌有显着的子实体形态,典型的如像担子菌中的灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）,其子实体形成后在很短时间内开伞自溶并且释放担孢子。这一过程最最有趣的现象之一是菌柄在很短时间内长度实现数十倍的增加。前期研究表明主要的生长部位在菌盖内的菌柄区域,这一生长方式类似于植物中胚芽鞘的生长,该过程中主要依赖于细胞的伸长生长。一方面,菌柄细胞的生长需要摆脱细胞壁的束缚,因而细胞壁需要维持足够的可塑性,这样新合成的细胞壁组分才能嵌入已有的细胞壁中以实现细胞壁的伸长;另一个方面,菌柄组织形态的完整性需要细胞壁提供足够的机械强度来维持,也就是说细胞壁还要有足够的刚性。因此,在灰盖鬼伞子实体菌柄伸长生长过程中菌柄细胞壁发生了显着的重构修饰。本实验室前期以27mm长的幼嫩灰盖鬼伞子实体为研究对象确定了菌柄伸长生长区域及菌柄不同区域细胞壁的伸长特性。本文为了研究伸长生长中灰盖鬼伞菌柄细胞壁的重构修饰,我们对菌柄各区域细胞壁微观结构以及分子结构组成进行了研究,此外,对可能参与该过程的一些重构酶进行了异源重组表达和鉴定以及相关生物功能的分析。为了获得差异明显的对比结构,本研究选取生长至60mm的灰盖鬼伞子实体为研究对象,将菌柄从顶部到基部划分为6个区域,取其中1-10 mm为顶端、20-30 mm为中部、40-50 mm为基部以及50-60 mm为基部膨大四个区。顶端和中部为伸长区,基部与基部膨大为非伸长区。通过场发射扫描电镜（FESEM）发现灰盖鬼伞在菌柄伸长区域与非伸长区域细胞壁外表面都附着有大量颗粒物,但是内表面仅非伸长区有颗粒物。热碱可以去除这些颗粒物,在非伸长区碱处理后其细胞壁内外面均有无定形物附着。用β-1,3-葡聚糖酶不仅能去除细胞壁表面的这些颗粒物与无定形物,还能除去除非伸长区细胞壁外表面以外的大部分细胞壁中包埋几丁质微丝的基质组分。在伸长区域细胞壁内表面几丁质微丝紧排列密且横向分布,非伸长基部区域细胞壁的微丝分布稀松甚至随机取向。我们认为细胞壁表面的球状颗粒物和无定形物质的沉积、微丝结构以及细胞壁基质的改变可能引起细胞壁可塑性的丧失最终导致菌柄伸长的停止。为了研究菌柄顶端与基部的细胞壁碱不溶葡聚糖的分子结构的组成,将其用内切β-1,3-葡聚糖酶酶解,用阴离子高效液相色谱结合质谱（HPAEC-MS）的方法对酶解产物的结构和连接方式进行分析。结果表明伸长区顶端菌柄其β-1,3-葡聚糖链有较少的β-1,6-分支点,而非伸长区基部则含有较多。β-1,4-连接在顶端和基部几乎没有差异。β-1,3-葡聚糖链中分支点的增加可能引起其与细胞壁基质组分交联程度的增加从而引起细胞壁伸长的停止。另外菌柄基部耐葡聚糖酶解的组分显着多于菌柄顶端,进一步证明了随着菌柄细胞壁的成熟,其β-1,3-葡聚糖与细胞壁基质的交联更加紧密,从而使细胞壁更加耐各种酶的酶解。本文进一步对可能参与菌柄伸长过程的相关细胞壁重构酶进行毕赤酵母真核异源重组表达。其中有修饰细胞壁中几丁质的几丁质酶（chitinases）和几丁质脱乙酰化酶（chitin deacetylases）,修饰β-1,3-葡聚糖的内切β-1,3-葡聚糖糖苷转移酶（endo-1,3-beta-glucanosyltransferases）。异源表达的几丁质酶ChiⅢ,经过对其酶学特性的研究,我们认为该酶是一个从未报道的新几丁质酶,ChiⅢ既具有内切活性又具有外切活性。当以三糖至五糖低聚度的几丁质寡糖为底物时,它具有外切活性,释放N-乙酰氨基葡萄糖单体;当以五糖以上聚合度的几丁质寡糖为底物时,它具有内切活性,释放不同长度的几丁质寡糖。之前qPCR定量分析表明该酶在灰盖鬼伞生长过程中显着表达,推测其可能参与菌柄伸长过程细胞壁的软化过程,在子实体自溶过程参与细胞壁几丁质组分的降解。内切几丁质酶ChiEn1经过酶学性质鉴定,其既有内切活性又具有外切活性,还具有转糖基活性。这三种活性随着底物聚合度的不同而相互转变,通过外切几丁质二糖酶活作用方式从（GlcNAc）3-5非还原端释放（G1cNAc）2;通过内切几丁质酶活性作用方式从（GlcNAc）6-8释放（GlcNAc）3,能从（GlcNAc）4-6转（GlcNAc）2-生成更大寡糖,后来再降解为（G1cNAc）3,但是（G1cNAc）3不能发生转糖基作用,（G1cNAc）3最终转化为（G1cNAc）2和GlcNAc。将（G1cNAc）8从其非还原端水解（GlcNAc）3,对于不溶性几丁质不能有效水解。我们认为ChiEn1不具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性或者外切单糖活性,通过三种内源性酶活协同的新水解机制转化可溶性几丁质寡糖生成GlcNAc。该基因在菌盖扩张自溶水解过程中表达量较高,在菌柄各个部分表达量都很低,但是这也吻合其酶学特性,在高浓度酶作用时其表现出强烈的水解特性,低浓度时其转糖基活性较强,能够延长几丁质链。推测在菌柄伸长时参与几丁质链的延长,在菌盖扩张自溶水解过程协同其他几丁质酶主要参与菌盖细胞壁几丁质的降解。几丁质能够被几丁质脱乙酰化酶脱去乙酰基生成壳聚糖。几丁质和壳聚糖的化学性质差别很大,我们推测几丁质脱乙酰化酶可能参与改变菌柄成熟过程中细胞壁物理化学特性的重构修饰作用。我们重组表达了灰盖鬼伞几丁质脱乙酰化酶Cdal,我们首次通过结合脉冲电压安培检测器的阴离子高效液相色谱方法以（GlcNAc）n（n=1-6）为底物对其活性进行了分析,发现该酶能将几丁质二糖至六糖脱乙酰生成部分脱乙酰的几丁质寡糖,不能脱去N-乙酰氨基葡萄糖的乙酰基。通过荧光定量PCR分析发现,cdal随着菌柄的成熟其表达量增高,推测Cdal可能参与细胞壁的成熟过程中几丁质的重构修饰。内切β-1,3-葡聚糖糖基转移酶能够从β-1,3-葡聚寡糖链的内部切割,将生成的含有非还原端的寡糖酶复合体转移至已有β-1,3-葡聚寡糖非还原端上生成更长链的β-1,3-葡聚寡糖,从而使得较短的β-1,3-葡聚糖链延伸。在灰盖鬼中,两个内切β-1,3葡聚糖糖苷转移酶Glt1和Glt2,序列高度同源,蛋白分子量大小相近,活性相同,是严格的βH依赖性酶,仅在酸性条件下有活性。以昆布六糖为底物均能产生聚合度在2-23的昆布寡糖,对于聚合度四及更小寡糖没有转糖基活性。通过荧光定量PCR分析发现,rglt1和rglt2在菌柄顶部有较高表达量,推测内切β-1,3-葡聚糖糖基转移酶可能参与菌柄伸长过程中的葡聚糖链的延伸。
宋志凤[9]（2016）在《β-N-乙酰己糖胺酶的异源表达及酶学性质研究》文中提出几丁质是由N-乙酰-D-胺基葡萄糖（GlcNAc）单体通过β-1,4键组成的多糖,主要来源于昆虫与甲壳类动物,每年约有100亿吨的生物合成量,是地球上第二丰富的生物质。随着中国经济水平的发展,人民生活水平不断提高,蟹、虾等海产或水产甲壳类动物的消费量越来越大,但其壳却常被直接丢弃,导致几丁质未获得有效利用;且因几丁质在自然界中分解缓慢,还造成环境污染。几丁质可被内切几丁质酶水解生成壳寡糖,β-N-乙酰己糖胺酶可进一步水解壳寡糖生成GlcNAc。Glc NAc可应用于制药、功能性食品及化妆品等领域。目前,几丁质酶的商业化还面临很多的问题,其中一个重要的问题是β-N-乙酰己糖胺酶的活力低。此外,耐盐酶可应用于海产品加工等领域,在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源,但耐盐的β-N-乙酰己糖胺酶还尚未报导。本论文以解决几丁质的有效利用为目的,对3种β-N-乙酰己糖胺酶进行了异源表达和酶学性质研究。（1）本研究从3种细菌Sphingobacterium sp.HWLB1、Shinella sp.JB10和Microbacterium sp.HJ5中分别获得了重组β-N-乙酰己糖胺酶rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag,与已经报导酶学性质的β-N-乙酰己糖胺酶最高一致性分别为31%,41%和30%。（2）rHL1nag、rJB10nag及rHJ5nag的最适pH分别为pH 7.0、pH 6.0和pH 6.0,最适温度分别为40℃、50℃和45℃。（3）在最适条件下,rHJ5nag对2 mmol/L p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide和p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-galactosaminide、及0.50%（w/v）N,N’-diacetyl chitobiose和N,N’,N’’,N’’’-tetraacetyl chitotetraose的比活分别为1773.08±1.06 U mg-1、145.97±3.13 U mg-1、481.43 U mg-1和445.05 U mg-1,该酶对2 mmol/L p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide的Km、Vmax和kcat分别为0.70 mmol L-1、4046.00 mol min-1 mg-1和4344.00 s-1。（4）NaCl抗性:在20%（w/v）的NaCl中,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag的酶活分别为127%、56%和54%。NaCl稳定性:经10%（w/v）NaCl处理1 h,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag的酶活分别剩余127%、75%和119%。（5）在25℃及pH 6.0条件下,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag与商业内切几丁质酶协同作用几丁质降解,协同度分别为3.57、2.35和2.02。本研究获得了具有高活力和高耐盐性的β-N-乙酰己糖胺酶,其协同参与几丁质的有效降解,在几丁质的酶法加工及利用中具有潜在的应用价值,也为β-N-乙酰己糖胺酶相关活性机理的研究提供了良好的素材。
王晓辉[10]（2016）在《海洋细菌DL-6几丁质酶和几丁质结合蛋白的生化性质与功能研究》文中研究说明几丁质是海洋环境中含量最丰富,自然界中仅次于纤维素的第二大生物质资源。微生物几丁质酶（chitinase, chi, EC3.2.1.14）降解体系可协同作用几丁质制备高附加值几丁寡糖、几丁单糖及其衍生物等,具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、降血压和降低胆固醇等生物活性,在医药、农业、工业和食品等领域具有巨大的应用潜力。海洋具有低温、高盐、低光照及寡营养等极端环境,海洋微生物为了适应海洋环境,进化了与之相适应的特点,其基因组中蕴含有价值的基因资源。因此,研究产几丁质酶系海洋微生物及其分泌几丁质酶系的生化性质及几丁质降解机制等有助于阐明海洋环境几丁质降解代谢途径,开发利用新的几丁质酶资源。本论文以胶体几丁质为唯一碳源,从大连渤海湾底泥样品中分离到高产低温几丁质酶的海洋细菌。菌株形态特征结合16SrDNA系统发育分析,鉴定该菌株属于假交替单胞菌属,命名为Pseudoalteromonas sp.DL-6。酶谱分析与荧光底物酶活性检测推测Pseudoalteromonas sp.DL-6分泌不同作用类型的几丁质酶系。通过PCR技术成功克隆Pseudoalteromonas sp.DL-6的两个几丁质酶基因chiA和chiC,一个几丁质结合蛋白基因CBP58。构建了原核表达载体pET28a-ChiA、 pET28a-ChiC与pET23b-CBP58,在大肠杆菌中实现这些基因的可溶性表达。重组蛋白ChiA、CBP58和ChiC通过Ni-NTA亲和层析,1L培养基上清液中分别纯化获得33.74mg ChiA、19.04 mg ChiC和11.90mg CBP58, ChiA和ChiC的纯化倍数和回收率为7.32和7.18及63.25%和79.37%。酶学性质研究表明几丁质酶ChiA和ChiC具有适冷特性,最适作用温度分别为20℃和30℃,在4℃以胶体几丁质为底物的Kcat/Km分别为0.56和1.83。ChiC表现出较强的耐盐特性,在5 M NaCl下仍保持最高酶活的60%以上。除几丁质外,ChiA和ChiC还可以降解Chitosan和Avicel等,具有广泛的底物适应性。酶解产物分析表明ChiA为随机作用底物释放聚合度2-6几丁寡糖的内切几丁质酶,ChiC为持续作用底物生成几丁二糖的外切几丁质酶。扫描电子显微镜观察表明CBP58对几丁质多糖链产生剥离和松解等破坏作用。底物结合实验表明CBP58对α-chitin和collodial chitin结合能力最强,β-chitin及其nano-whiskers次之,对icel具有较弱结合能力。海洋耐冷细菌Pseudoalteromonas sp.DL-6几丁质酶系统通过协同降解机制作用几丁质,不仅为生物转化生产几丁寡糖提供了新途径,也有助于进一步阐明海洋环境几丁质代谢机制。
二、绿豆几丁质酶的纯化和酶学性质分析(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绿豆几丁质酶的纯化和酶学性质分析(英文)（论文提纲范文）
（1）嗜热烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系解析及协同机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 绪论 |
| 1.1 甘露聚糖种类与结构 |
| 1.1.1 线性甘露聚糖 |
| 1.1.2 半乳甘露聚糖 |
| 1.1.3 葡甘露聚糖 |
| 1.1.4 半乳葡甘露聚糖 |
| 1.2 魔芋葡甘聚糖的应用 |
| 1.2.1 乳制品 |
| 1.2.2 面制食品 |
| 1.2.3 低脂肉制品 |
| 1.2.4 低热量食品 |
| 1.2.5 寡糖产品 |
| 1.2.6 食品保鲜 |
| 1.3 甘露聚糖降解酶 |
| 1.3.1 甘露聚糖酶 |
| 1.3.2 β-甘露糖苷酶 |
| 1.3.3 β-葡萄糖苷酶 |
| 1.3.4 α-半乳糖苷酶 |
| 1.3.5 乙酰甘露聚糖脂酶 |
| 1.4 甘露聚糖的协同降解进展 |
| 1.4.1 甘露聚糖酶之间的同质协同作用 |
| 1.4.2 甘露聚糖酶与甘露糖苷酶之间的同质协同作用 |
| 1.4.3 甘露聚糖酶与半乳糖苷酶之间的协同 |
| 1.4.4 甘露聚糖酶与半乳糖苷酶和甘露糖苷酶的协同 |
| 1.5 嗜热真菌与嗜热酶研究进展 |
| 1.5.1 嗜热真菌 |
| 1.5.2 嗜热酶 |
| 1.6 烟曲霉研究进展 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 1.8 要研究内容 |
| 1.8.1 酿酒大曲中嗜热真菌的筛选及降解魔芋葡甘聚糖能力评估 |
| 1.8.2 嗜热真菌魔芋葡甘露聚糖降解酶系组份研究 |
| 1.8.3 嗜热真菌魔芋葡甘露聚糖降解酶性质分析和协同研究 |
| 2 大曲中产嗜热甘露聚糖酶真菌的筛选及评估 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 大曲 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物、菌株与质粒 |
| 2.1.4 试剂与仪器 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集和处理 |
| 2.2.2 嗜热真菌的分离 |
| 2.2.3 菌株的保存 |
| 2.2.4 菌株的鉴定 |
| 2.2.5 菌株所产甘露聚糖酶的酶学特性评估 |
| 2.2.6 菌株酶解魔芋产物的分析 |
| 2.2.7 菌株HBHF5的生长曲线的测定 |
| 2.2.8 菌株HBHF5的糖苷水解酶表达谱分析 |
| 2.2.9 数据分析及处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 嗜热真菌的筛选 |
| 2.3.2 菌株的鉴定 |
| 2.3.3 甘露聚糖酶性能的评估 |
| 2.3.4 菌株HBHF5糖苷水解酶的性能评估 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 烟曲霉HBHF5在魔芋诱导下的组学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株与培养基 |
| 3.1.2 主要试剂与设备 |
| 3.1.3 样品收集 |
| 3.1.4 转录组测序分析 |
| 3.1.5 非标记定量蛋白质组学(Label-free)分析 |
| 3.1.6 蛋白质组与转录组数据的联合分析 |
| 3.2 转录组测序及数据分析 |
| 3.2.1 转录组数据质量评价及比对分析 |
| 3.2.2 基因表达差异分析 |
| 3.2.3 差异表达基因的功能富集分析 |
| 3.2.4 差异表达的基因的CAZy分析 |
| 3.3 蛋白质组数据分析 |
| 3.3.1 样品蛋白浓度的测定 |
| 3.3.2 肽段特征与蛋白鉴定结果 |
| 3.3.3 分泌蛋白差异表达结果 |
| 3.3.4 差异蛋白的表达分析 |
| 3.4 差异表达基因和蛋白的关联分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 差异基因的克隆表达和酶学性质表征及协同作用分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒和基因 |
| 4.1.2 引物合成和核酸序列分析 |
| 4.1.3 试剂和培养基 |
| 4.1.4 常用溶液 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株总RNA的提取 |
| 4.2.2 c DNA基因的克隆 |
| 4.2.3 基因表达载体的构建 |
| 4.2.4 目的基因在毕赤酵母中的表达 |
| 4.2.5 酶蛋白分子生物信息学分析 |
| 4.2.6 重组酶的酶学性质分析 |
| 4.2.7 关键酶协同降解魔芋葡甘聚糖的测定 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组酶AfMan5A的性质分析 |
| 4.3.2 重组酶AfMan5B的表达及性质分析 |
| 4.3.3 果胶裂解酶AfPly C的性质分析 |
| 4.3.4 重组酶AfPly A的表达及性质分析 |
| 4.3.5 重组酶AfChi的表达及性质分析 |
| 4.3.6 重组酶AfEn的表达及性质分析 |
| 4.3.7 重组酶Afhp的表达及性质分析 |
| 4.3.8 重组酶AfCDH的表达及性质分析 |
| 4.3.9 重组酶AfCel5A的表达及性质分析 |
| 4.3.10 重组酶AfCel5B的表达及性质分析 |
| 4.3.11 重组酶AfPGL的表达及性质分析 |
| 4.3.12 重组酶AfTan的表达及性质分析 |
| 4.3.13 重组酶AfSwol的表达及性质分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）新型蛋白酶及几丁质酶的开发及其在虾加工废弃物中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照和缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白酶 |
| 1.2 几丁质酶 |
| 1.3 虾壳废弃物 |
| 1.3.1 虾壳废弃物现状 |
| 1.3.2 虾壳废弃物的生物活性成分 |
| 1.4 虾壳废弃物加工处理 |
| 1.4.1 虾壳废弃物加工发展现状及产业链关键制约环节 |
| 1.4.2 国内外现有技术 |
| 1.5 本课题的目的意义和研究内容 |
| 1.5.1 目的意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 新型蛋白酶及几丁质酶的开发 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细菌几丁质酶基因克隆与重组表达 |
| 2.3.2 真菌蛋白酶和几丁质酶基因克隆与重组表达 |
| 2.3.3 重组酸性蛋白酶和活性测定与性质研究 |
| 2.3.4 统计学分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 新型蛋白酶基因克隆与重组表达 |
| 2.4.2 重组酸性蛋白酶P6281的酶学性质 |
| 2.4.3 新型几丁质酶基因克隆与重组表达 |
| 2.4.4 重组几丁质酶Chit46的酶学性质 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 综合回收利用虾壳废弃物工艺的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 虾壳废弃物各项成分测定 |
| 3.2.3 蛋白酶水解虾壳蛋白效果比较 |
| 3.2.4 重组酸性蛋白酶P6281水解虾壳废弃物条件优化 |
| 3.2.5 重组酸性蛋白酶Saccharopepsin水解虾壳废弃物条件优化 |
| 3.2.6 虾壳废弃物蛋白水解物成分测定及抗氧化性 |
| 3.2.7 重组几丁质酶Chit46水解虾壳废弃物条件优化 |
| 3.2.8 虾壳废弃物几丁质水解产物的成分测定及抗炎效果 |
| 3.2.9 虾壳废弃物中虾青素提取 |
| 3.2.10 虾青素提取物分析 |
| 3.2.11 虾青素提取物抗氧化性测定 |
| 3.2.12 虾壳废弃物形态学观察 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 虾壳废弃物成分测定 |
| 3.3.2 蛋白酶水解虾壳蛋白效果比较 |
| 3.3.3 重组酸性蛋白酶P6281水解虾壳废弃物条件优化 |
| 3.3.4 重组酸性蛋白酶Saccharopepsin水解虾壳废弃物条件优化 |
| 3.3.5 虾壳废弃物蛋白水解物成分测定及抗氧化性 |
| 3.3.6 重组几丁质酶Chit46水解虾壳废弃物条件优化 |
| 3.3.7 虾壳废弃物几丁质水解产物的成分测定及抗炎效果 |
| 3.3.8 虾壳废弃物中虾青素提取、产物分析及抗氧化性测定 |
| 3.3.9 虾壳废弃物形态学观察 |
| 3.3.10 综合回收利用虾壳废弃物工艺的建立 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 虾壳废弃物回收工艺的优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 CBM基因克隆 |
| 4.2.3 CBM与 Chit46 基因融合 |
| 4.2.4 融合基因转化及融合蛋白诱导 |
| 4.2.5 融合几丁质酶的酶学性质研究 |
| 4.2.6 融合几丁质酶的水解模式 |
| 4.2.7 融合几丁质酶在虾壳水解中的应用 |
| 4.2.8 虾壳废弃物水解产物对微生物生长的影响 |
| 4.2.9 水解残留物的体外消化率 |
| 4.2.10 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 CBM基因克隆引物 |
| 4.3.2 融合几丁质酶诱导表达 |
| 4.3.3 融合几丁质酶的酶学性质 |
| 4.3.4 融合几丁质酶的水解模式 |
| 4.3.5 融合几丁质酶在虾壳水解中的应用 |
| 4.3.6 虾壳水解产物对微生物生长的影响及残留物的体外消化率 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新性研究成果 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）UV-C照射胁迫诱导凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 凡纳滨对虾及虾头资源 |
| 1.1.1 凡纳滨对虾的资源特性 |
| 1.1.2 凡纳滨对虾的加工利用 |
| 1.1.3 凡纳滨对虾虾头的结构和生化特性 |
| 1.2 虾头中的内源酶 |
| 1.2.1 多酚氧化酶 |
| 1.2.2 几丁质酶 |
| 1.2.3 脂肪酶 |
| 1.2.4 内源性蛋白酶 |
| 1.2.5 其他内源酶 |
| 1.3 内源酶开发利用 |
| 1.3.1 脂肪酶的回收利用 |
| 1.3.2 蛋白酶的回收利用 |
| 1.3.3 其他内源酶的回收利用 |
| 1.4 内源酶激活方法 |
| 1.4.1 超高压激活内源酶 |
| 1.4.2 金属离子激活内源酶 |
| 1.4.3 高压静电场激活内源酶 |
| 1.4.4 酶活剂激活内源酶 |
| 1.4.5 UV-C照射胁迫激活内源酶 |
| 1.5 内源酶结构的研究 |
| 1.5.1 荧光光谱法鉴定蛋白结构 |
| 1.5.2 紫外光谱法鉴定蛋白结构 |
| 1.5.3 傅里叶红外光谱法鉴定蛋白结构 |
| 1.5.4 圆二色谱法鉴定蛋白结构 |
| 1.5.5 质谱法鉴定蛋白结构 |
| 1.6 本课题的目的、意义及研究内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 2 UV-C照射胁迫对凡纳滨对虾虾头主要内源酶的激活作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 pH和温度对UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶酶活的影响 |
| 2.3.2 pH和温度对UV-C照射胁迫前后虾头内源脂肪酶酶活的影响 |
| 2.3.3 pH和温度对UV-C照射胁迫前后虾头内源几丁质酶酶活的影响 |
| 2.3.4 pH和温度对UV-C照射胁迫前后虾头内源多酚氧化酶酶活的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 理化因素对UV-C照射胁迫前后凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶酶活的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 原料与试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NaCl浓度对UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶酶活的影响 |
| 3.3.2 料液比对UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶的影响 |
| 3.3.3 金属离子对UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶的影响 |
| 3.4 结论 |
| 4 UV-C照射胁迫前后凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶的分离纯化与鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 虾头内源碱性蛋白酶的硫酸铵分级沉淀 |
| 4.3.2 虾头内源酸性蛋白酶的硫酸铵分级沉淀 |
| 4.3.3 虾头内源碱性蛋白酶的凝胶层析和离子交换层析分离 |
| 4.3.4 虾头内源碱性蛋白酶的凝胶电泳和高效液相色谱分析 |
| 4.3.5 虾头内源酸性蛋白酶的凝胶层析和离子交换层析分离 |
| 4.3.6 虾头内源酸性蛋白酶的凝胶电泳和高效液相色谱分析 |
| 4.3.7 虾头内源蛋白酶的质谱鉴定与同源性分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 UV-C照射胁迫前后凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶的构象解析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶的荧光光谱分析 |
| 5.3.2 UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶的紫外光谱分析 |
| 5.3.3 UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶的红外光谱分析 |
| 5.3.4 UV-C照射胁迫前后虾头内源蛋白酶的圆二色谱分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）地衣芽孢杆菌TG116生防机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 芽孢杆菌生防菌剂概述 |
| 1.1.1 生防菌剂研究现状 |
| 1.1.2 芽孢杆菌生防菌剂研究现状 |
| 1.2 生防机制研究概述 |
| 1.2.1 竞争作用 |
| 1.2.2 拮抗作用 |
| 1.2.3 诱导植物抗病性 |
| 1.2.4 促进植物生长 |
| 1.3 本论文的研究目的意义、技术路线与主要内容 |
| 1.3.1 研究目的和意义 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 1.3.3 主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 药品与仪器 |
| 2.1.4 主要试剂与缓冲液 |
| 2.2 地衣芽孢杆菌TG116 的培养 |
| 2.3 地衣芽孢杆菌TG116 对几种植物病原真菌的抑制作用 |
| 2.4 地衣芽孢杆菌TG116 发酵液的拮抗作用 |
| 2.4.1 发酵液的拮抗作用 |
| 2.4.2 初始pH对发酵液活性的影响 |
| 2.4.3 初始温度对发酵液活性的影响 |
| 2.4.4 装液量对发酵液活性的影响 |
| 2.4.5 培养时间对发酵液活性的影响 |
| 2.5 地衣芽孢杆菌TG116 粗蛋白的理化性质 |
| 2.5.1 粗蛋白的生物学活性 |
| 2.5.2 粗蛋白的温度稳定性 |
| 2.5.3 粗蛋白的紫外稳定性 |
| 2.6 地衣芽孢杆菌TG116 蛋白酶产酶条件优化与酶学性质研究 |
| 2.6.1 粗酶液的制备 |
| 2.6.2 蛋白酶活力测定 |
| 2.6.3 发酵温度优化 |
| 2.6.4 发酵pH优化 |
| 2.6.5 发酵时间优化 |
| 2.6.6 装液量优化 |
| 2.6.7 响应曲面法优化发酵条件 |
| 2.6.8 蛋白酶酶学性质研究 |
| 2.7 地衣芽孢杆菌TG116 纤维素酶产酶条件优化与酶学性质研究 |
| 2.7.1 粗酶液的制备 |
| 2.7.2 纤维素酶蛋白酶活力测定 |
| 2.7.3 发酵温度优化 |
| 2.7.4 发酵pH优化 |
| 2.7.5 发酵时间优化 |
| 2.7.6 装液量优化 |
| 2.7.7 响应曲面法优化发酵条件 |
| 2.7.8 纤维素酶酶学性质研究 |
| 2.8 地衣芽孢杆菌TG116 胞外蛋白酶的纯化 |
| 2.8.1 粗酶液的制备 |
| 2.8.2 硫酸铵分级沉淀 |
| 2.8.3 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析 |
| 2.8.4 Sephadex G-50 分子筛层析 |
| 2.8.5 蛋白酶相对分子量的测定 |
| 2.8.6 蛋白酶对病原真菌菌丝与孢子的影响 |
| 2.9 地衣芽孢杆菌TG116 脂肽类抗生素基因与碱性蛋白酶基因克隆及分析 |
| 2.9.1 引物设计与合成 |
| 2.9.2 TG116 胞外蛋白酶基因PCR扩增 |
| 2.9.3 TG116 Pase基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 2.10 数据分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 地衣芽孢杆菌TG116 对几种病原真菌的抑制作用 |
| 3.2 地衣芽孢杆菌TG116 发酵液的抗性研究与性质研究 |
| 3.2.1 TG116 生长曲线 |
| 3.2.2 发酵液的拮抗作用 |
| 3.2.3 初始pH对发酵液活性的影响 |
| 3.2.4 初始温度对发酵液活性的影响 |
| 3.2.5 装液量对发酵液活性的影响 |
| 3.2.6 培养时间对发酵液活性的影响 |
| 3.3 地衣芽孢杆菌TG116 粗蛋白的理化性质 |
| 3.3.1 粗蛋白的抑菌谱 |
| 3.3.2 粗蛋白的生物学活性 |
| 3.3.3 粗蛋白的温度稳定性 |
| 3.3.4 粗蛋白的紫外稳定性 |
| 3.4 地衣芽孢杆菌TG116 蛋白酶产酶条件优化与酶学性质研究 |
| 3.4.1 蛋白酶标准曲线 |
| 3.4.2 蛋白酶酶活 |
| 3.4.3 TG116 的产酶条件优化 |
| 3.4.4 响应面法优化TG116 产酶条件 |
| 3.4.5 酶学性质研究 |
| 3.5 地衣芽孢杆菌TG116 纤维素酶产酶条件优化与酶学性质研究 |
| 3.5.1 纤维素酶标准曲线 |
| 3.5.2 纤维素酶酶活 |
| 3.5.3 TG116 的产酶条件优化 |
| 3.5.4 响应面法优化TG116 产酶条件 |
| 3.5.5 酶学性质研究 |
| 3.6 地衣芽孢杆菌TG116 胞外粗提蛋白的纯化 |
| 3.6.1 TG116 最佳盐析条件 |
| 3.6.2 DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析 |
| 3.6.3 Sephadex G-50 分子筛层析 |
| 3.6.4 蛋白酶相对分子量的确定 |
| 3.6.5 蛋白酶的鉴定 |
| 3.6.6 蛋白酶对病原真菌菌丝与孢子的影响 |
| 3.7 地衣芽孢杆菌TG116 脂肽类抗生素基因与碱性蛋白酶基因克隆及分析 |
| 3.7.1 脂肽类抗生素基因与Pase基因的克隆 |
| 3.7.2 ORF的预测与分析 |
| 3.7.3 Pase编码蛋白的生物信息学分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 TG116 菌株与发酵液的生物学特性 |
| 4.2 TG116 菌株产蛋白酶的条件与酶学性质 |
| 4.3 TG116 菌株产纤维素酶的条件与酶学性质 |
| 4.4 TG116 菌株产拮抗物质的条件 |
| 4.5 TG116 菌株拮抗物质的分离纯化 |
| 4.6 TG116 菌株拮抗物质的性质 |
| 4.7 TG116 菌株拮抗物质对植物病原真菌的抑制作用 |
| 4.8 TG116 菌株拮抗物质的应用 |
| 4.9 TG116 菌株拮抗物质的基因克隆 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士研究生期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的表达研究及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 N-乙酰氨基葡萄糖的概述 |
| 1.2 N-乙酰氨基葡萄糖的应用 |
| 1.2.1 N-乙酰氨基葡萄糖在食品添加剂中的作用 |
| 1.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖在化妆品中的应用 |
| 1.2.3 N-乙酰氨基葡萄糖在医药中的应用 |
| 1.3 N-乙酰氨基葡萄糖的制备方法 |
| 1.3.1 化学法制备Glc NAc |
| 1.3.2 生物降解法 |
| 1.3.3 酶法制备 |
| 1.4 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质 |
| 1.4.1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的概述 |
| 1.4.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究现状 |
| 1.5 表达系统 |
| 1.5.1 毕赤酵母表达系统 |
| 1.5.2 大肠杆菌表达系统 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 1.6.1 本文选题的背景 |
| 1.6.2 本文选题的依据 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 酶与试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.1.5 主要缓冲液 |
| 2.1.6 PCR引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因的获取 |
| 2.2.2 PCR产物回收 |
| 2.2.3 构建重组表达载体 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态的制备及质粒DNA转化 |
| 2.2.5 重组菌株的验证 |
| 2.2.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.7 毕赤酵母感受态制备及重组质粒转化 |
| 2.2.8 重组菌株的筛选与保存 |
| 2.2.9 重组菌株的摇瓶诱导表达 |
| 2.2.10 Zeocin抗性筛选多拷贝菌株多拷贝菌株筛选 |
| 2.2.11 拷贝数测定 |
| 2.2.12 pNP法测定外切N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性 |
| 2.2.13 蛋白纯化和重组酶酶学性质分析 |
| 2.2.14 甲醇浓度对重组蛋白发酵条件优化 |
| 2.2.15 大肠分泌表达条件的优化 |
| 2.2.16 酶解产物的检测 |
| 2.2.16.1 胶体几丁质底物的制备 |
| 2.2.16.2 HPLC检测酶解产物 |
| 2.2.16.3 GlcNAc标准曲线绘制 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 Bs Nag Z在毕赤酵母X33 中的异源表达及酶学性质测定 |
| 3.1.1 目的基因合成与分析 |
| 3.1.2 重组载体p PICZαA-Bs Nag Z的构建 |
| 3.1.3 p PICZαA-Bs Nag Z的电转化和重组菌株验证 |
| 3.1.4 Bs Nag Z基因在酵母中的表达 |
| 3.1.5 Bs Nag Z高拷贝整合菌株的筛选 |
| 3.1.6 多拷贝重组菌株的诱导表达 |
| 3.1.7 基因拷贝数检测 |
| 3.1.8 Bs Nag Z重组酶酶学性质分析 |
| 3.1.9 重组BsNagZ对不同底物的酶解结果 |
| 3.2 新NagZ基因资源的筛选 |
| 3.2.1 基因来源 |
| 3.2.2 NagZ保守结构域和催化活性中心的分析 |
| 3.3 Bc Nag Z在大肠杆菌中的表达和表征 |
| 3.3.1 Bc Nag Z基因的克隆与重组表达载体的构建 |
| 3.3.2 NagZ在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 |
| 3.3.3 Bc Nag Z的酶学性质分析 |
| 3.3.4 动力学参数的测定 |
| 3.4 Bl Nag Z在大肠杆菌中的表达和表征 |
| 3.4.1 Bl Nag Z基因的克隆与重组表达载体的构建 |
| 3.4.2 Bl Nag Z在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 |
| 3.4.3 Bl Nag Z的酶学性质分析 |
| 3.4.4 动力学参数的测定 |
| 3.4.5 发酵条件的优化 |
| 3.4.6 Bl Nag Z对几丁质底物的酶解 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 结果与讨论 |
| 4.1.1 Bs Nag Z在毕赤酵母中的高效表达 |
| 4.1.2 酶活力更高的NagZ的获得 |
| 4.1.3 Nag Z酶解胶体几丁质制备Glc NAC单体 |
| 4.2 工作展望 |
| 4.2.1 NagZ酶活力的提高 |
| 4.2.2 酶解实验条件的优化 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）产壳聚糖酶Mitsuaria sp.C4菌株的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 绪论 |
| 1.1 甲壳素及壳聚糖简介 |
| 1.1.1 甲壳素的概述和应用 |
| 1.1.2 壳聚糖的来源和性质 |
| 1.2 壳聚糖酶概述 |
| 1.2.1 壳聚糖酶的发现 |
| 1.2.2 壳聚糖酶的分类 |
| 1.2.3 壳聚糖酶酶活力的测定 |
| 1.2.4 壳聚糖酶的纯化方法 |
| 1.2.5 壳聚糖酶的酶学性质 |
| 1.2.6 壳聚糖酶的功能及应用 |
| 1.3 壳寡糖概述 |
| 1.3.1 壳寡糖的定义 |
| 1.3.2 壳寡糖的制备方法 |
| 1.3.3 壳寡糖的应用 |
| 1.4 本课题研究目的与内容 |
| 1.4.1 本课题研究的目的 |
| 1.4.2 本课题主要研究内容 |
| 1.4.3 本研究实验技术路线图 |
| 第一章 产壳聚糖酶海洋微生物菌株的筛选和鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 1%胶体壳聚糖的制备 |
| 1.2.2 产壳聚糖酶菌株的初筛 |
| 1.2.3 产壳聚糖酶菌株的复筛 |
| 1.2.4 菌株鉴定 |
| 1.2.5 菌株诱变选育 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 菌株的筛选结果 |
| 1.3.2 菌株鉴定分析 |
| 1.3.3 C4菌株鉴定结果 |
| 1.3.4 菌株诱变选育结果分析 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 产壳聚糖酶菌株的发酵产酶条件研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 培养基与试剂的制备 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株生长及产酶特性研究 |
| 2.2.2 发酵培养基的优化 |
| 2.2.3 发酵条件的优化 |
| 2.2.4 Plackett-Burman实验设计 |
| 2.2.5 最陡爬坡实验设计 |
| 2.2.6 响应面实验设计 |
| 2.2.7 优化后发酵曲线 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株生长及产酶特性研究结果 |
| 2.3.2 发酵培养基的优化结果 |
| 2.3.3 发酵条件的优化结果 |
| 2.3.4 响应面分析结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 壳聚糖酶的分离纯化与性质研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 培养基与试剂制备 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌种复壮 |
| 3.2.2 壳聚糖酶粗酶液的制备 |
| 3.2.3 酶学性质的研究 |
| 3.2.4 壳聚糖酶降解产物分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 粗酶液壳聚糖酶活力测定结果 |
| 3.3.2 硫酸铵的盐析曲线 |
| 3.3.3 壳聚糖酶的分离纯化 |
| 3.3.4 蛋白质纯度检测和分子量测定 |
| 3.3.5 壳聚糖酶酶学性质 |
| 3.3.6 壳聚糖酶降解产物分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 Mitsuaria sp.C4菌株基因组测序 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Mitsuaria sp.C4菌株的培养 |
| 4.2.2 基因组DNA的提取 |
| 4.2.3 基因组DNA测序、组装与注释 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 原始数据质量剪切后测序数据统计 |
| 4.3.2 基因组概况 |
| 4.3.3 基因组组分分析 |
| 4.3.4 基因功能分析 |
| 4.3.5 全基因组图谱 |
| 4.3.6 基因组完整度检验 |
| 4.3.7 全基因组平均核苷酸同源性分析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 附录1 相关试剂及缓冲液配方 |
| 附录2 主要符号缩略表 |
| 附录3 测序所需软件和数据库 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）滇金丝猴粪便微生物宏基因组来源几丁质酶和β-半乳糖苷酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 术语及符号说明 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 几丁质酶及其应用 |
| 1.1.1 几丁质及其应用现状 |
| 1.1.2 低聚几丁质衍生物的制备方法 |
| 1.1.3 几丁质酶简介 |
| 1.1.4 几丁质酶的来源及性质 |
| 1.1.5 几丁质酶的分类 |
| 1.1.6 几丁质酶酶解产物的应用 |
| 1.1.6.1 应用于食品领域 |
| 1.1.6.2 应用于医药领域 |
| 1.1.6.3 应用于化妆品领域 |
| 1.1.6.4 应用于农业领域 |
| 1.2 β-半乳糖苷酶 |
| 1.2.1 β-半乳糖苷酶简介 |
| 1.2.2 β-半乳糖苷酶的来源和分类 |
| 1.2.3 β-半乳糖苷酶的应用 |
| 1.2.3.1 降解乳糖 |
| 1.2.3.2 乳制品生产及开发中的应用 |
| 1.2.3.3 低聚半乳糖的生产 |
| 1.3 宏基因组来源几丁质酶和β-半乳糖苷酶的研究现状 |
| 1.3.1 宏基因组学概述 |
| 1.3.2 开发滇金丝猴胃肠道微生物酶资源的潜力 |
| 1.3.3 来源于宏基因组的几丁质酶的研究概况 |
| 1.3.4 来源于宏基因组的β-半乳糖苷酶的研究概况 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 几丁质酶基因chitiRBM1的异源表达与酶学性质、初步应用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品、菌株和载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 常用培养基 |
| 2.1.5 常用试剂溶液 |
| 2.1.6 引物合成及DNA测序 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 序列分析 |
| 2.2.2 目的基因chitiRBM1的扩增 |
| 2.2.2.1 chitiRBM1的获得与扩增 |
| 2.2.2.2 chitiRBM1基因扩增产物的纯化 |
| 2.2.3 重组质粒的构建 |
| 2.2.3.1 侧翼序列的扩增 |
| 2.2.3.2 pEASY-E2载体质粒的提取 |
| 2.2.3.3 大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.2.3.4 酶切pEASY-E2环状质粒 |
| 2.2.3.5 几丁质酶基因chitiRBM1与pEASY-E2线性载体的连接、转化 |
| 2.2.3.6 几丁质酶阳性克隆子的鉴定 |
| 2.2.4 重组酶ChitiRBM1在大肠杆菌中的异源表达 |
| 2.2.5 几丁质酶的纯化 |
| 2.2.5.1 纯化 |
| 2.2.5.2 纯化效果的验证 |
| 2.2.5.3 重组酶蛋白含量的测定 |
| 2.2.6 重组几丁质酶活力的测定 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 chitiRBM1的序列分析及全长基因的扩增 |
| 2.3.1.1 chitiRBM1的序列分析 |
| 2.3.1.2 chitiRBM1全长基因的扩增 |
| 2.3.2 重组几丁质酶ChitiRBM1的SDS-PAGE鉴定与蛋白含量测定 |
| 2.3.3 重组几丁质酶ChitiRBM1的酶学特性 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 β-半乳糖苷酶基因galRBM1的异源表达与酶学性质研究. |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品、菌株和载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要培养基 |
| 3.1.5 常用试剂溶液 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 序列分析方法 |
| 3.2.2 galRBM1目的基因的扩增 |
| 3.2.2.1 galRBM1的扩增 |
| 3.2.2.2 galRBM1基因扩增产物的纯化 |
| 3.2.3 重组质粒的构建 |
| 3.2.2.1 侧翼序列的扩增 |
| 3.2.3.2 pEASY-E1载体质粒的提取 |
| 3.2.3.3 大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 3.2.3.4 酶切pEASY-E1环状质粒 |
| 3.2.3.5 β-半乳糖苷酶基因galRBM1与pEASY-E1线性载体的连接、转化 |
| 3.2.3.6 几丁质酶阳性克隆子的鉴定 |
| 3.2.4 重组酶galRBM1在大肠杆菌中的异源表达 |
| 3.2.5 几丁质酶精纯酶的制备 |
| 3.2.5.1 纯化 |
| 3.2.5.2 纯化效果的验证 |
| 3.2.5.3 重组酶蛋白含量的测定 |
| 3.2.6 β-半乳糖苷酶酶活测定方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 GalRBM1的序列分析 |
| 3.3.2 galRBM1的扩增 |
| 3.3.3 重组酶GalRBM1的异源表达与纯化 |
| 3.3.4 重组酶galRBM1的酶学特性 |
| 3.3.5 酶学性质鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验中所使用的缓冲液的配置 |
| A1 不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制 |
| A2 不同pH值的甘氨酸-NaOH缓冲液的配制 |
| A3 不同pH值的Tris-HCl缓冲液的配制 |
| 附录B 三个重组β-N-乙酰己糖胺酶基因序列 |
| B1 ChitiRBM1的核酸序列 |
| B2 galRBM1的核酸序列 |
| 附录C 氨基酸中英文对照及缩写表 |
（8）灰盖鬼伞菌柄细胞壁结构、组成及细胞壁重构酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 菌柄伸长生长与细胞壁扩张作用 |
| 1.2 真菌细胞壁的超微结构 |
| 1.3 真菌细胞壁的化学组成与分子结构 |
| 1.3.1 真菌细胞壁的组成成分 |
| 1.3.1.1 几丁质和壳聚糖 |
| 1.3.1.2 葡聚糖 |
| 1.3.1.3 黑色素 |
| 1.3.1.4 真菌细胞壁蛋白 |
| 1.3.2 真菌细胞壁的分子组成与结构 |
| 1.3.2.1 酿酒酵母细胞壁的分子组成与结构 |
| 1.3.2.2 粟酒裂殖酵母细胞壁分子组成与结构 |
| 1.3.2.3 烟曲霉的细胞壁分子组成与结构 |
| 1.4 细胞壁的重构与重构蛋白 |
| 1.4.1 细胞壁的重构 |
| 1.4.2 细胞壁重构蛋白 |
| 1.4.2.1 几丁质酶 |
| 1.4.2.2 几丁质脱乙酰化酶 |
| 1.4.2.3 β-1,3-葡聚糖酶 |
| 1.4.2.4 β-1,3-葡聚糖糖基转移酶 |
| 1.4.2.5 α-1,3-葡聚糖酶 |
| 1.4.2.6 细胞壁扩展蛋白 |
| 1.5 灰盖鬼伞介绍 |
| 1.6 本论文的研究目的和主要研究内容 |
| 第二章 灰盖鬼伞菌柄细胞壁超微结构的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 培养基及培养条件 |
| 2.1.3 灰盖鬼伞菌柄伸长生长的测量 |
| 2.1.4 不同部位菌柄的扩张活性的检测 |
| 2.1.5 细胞壁处理 |
| 2.1.5.1 菌柄碱处理 |
| 2.1.5.2 菌柄酶解处理 |
| 2.1.6 酶活的分析 |
| 2.1.7 水解酶的分离纯化 |
| 2.1.7.1 几丁质酶的纯化 |
| 2.1.7.2 蛋白酶的纯化 |
| 2.1.7.3 β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化 |
| 2.1.8 扫描电镜样品处理 |
| 2.1.9 透射电镜样品处理及观察 |
| 2.1.9.1 透射电镜制样主要试剂的配制 |
| 2.1.9.2 灰盖鬼伞菌柄细胞壁的透射电镜观察 |
| 2.1.10 数据处理 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 灰盖鬼伞菌柄不同部位伸长生长特性 |
| 2.2.2 灰盖鬼伞菌柄不同部位细胞壁的酸伸长特性 |
| 2.2.3 灰盖鬼伞未处理菌柄不同区域细胞壁的超微结构特征 |
| 2.2.4 灰盖鬼伞菌柄各区域碱处理后的细胞壁超微结构特征 |
| 2.2.5 灰盖鬼伞菌柄不同区域水解酶处理后细胞壁的超微结构特征 |
| 2.2.6 灰盖鬼伞菌柄不同区域细胞壁厚度的测定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 灰盖鬼伞菌柄细胞壁碱不溶葡聚糖分子结构的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 灰盖鬼伞菌柄细胞壁的制备 |
| 3.1.2 细胞壁的碱处理 |
| 3.1.3 碱不溶细胞壁组分的酶解处理 |
| 3.1.4 碱不溶细胞壁提取组分的液相色谱分析 |
| 3.1.5 碱不溶细胞壁葡聚糖组分的液相色谱-质谱联用在线分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 碱不溶性葡聚糖酶解片段的HPAEC-PAD分析 |
| 3.2.2 在线质谱分析以及二级质谱结果 |
| 3.2.3 细胞壁碱不溶葡聚糖分支度的定量 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 灰盖鬼伞几丁质酶ChiⅢ的基因克隆、重组表达、鉴定和性质研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 PCR引物设计 |
| 4.1.3 ChiⅢ基因的扩增 |
| 4.1.4 ChiⅢ表达质粒的构建、发酵及表达分析 |
| 4.1.5 重组蛋白的亲和层析纯化 |
| 4.1.6 几丁质酶ChiⅢ的质谱鉴定 |
| 4.1.7 几丁质酶的活性测定 |
| 4.1.8 HPLC分析 |
| 4.1.9 进化树分析 |
| 4.1.10 蛋白结构分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 ChiⅢ扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及纯化 |
| 4.2.2 pPICZaA质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测及纯化 |
| 4.2.3 毕赤酵母表达载体的构建和鉴定 |
| 4.2.4 ChiⅢ基因的真核表达产物检测 |
| 4.2.5 ChiⅢ的质谱鉴定 |
| 4.2.6 ChiⅢ的酶学特征 |
| 4.2.7 水解产物分析 |
| 4.2.8 序列的分析和酶结构 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 灰盖鬼伞几丁质酶ChiEn1的基因克隆、重组表达、鉴定和性质研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株和质粒及培养基 |
| 5.1.2 PCR引物设计 |
| 5.1.3 ChiEn1基因的扩增 |
| 5.1.4 ChiEn1表达质粒的构建、发酵及表达分析 |
| 5.1.5 重组蛋白ChiEn1的亲和层析纯化 |
| 5.1.6 几丁质酶ChiEn1的质谱鉴定 |
| 5.1.7 几丁质酶的活性测定 |
| 5.1.8 HPLC分析 |
| 5.1.9 蛋白结构分析 |
| 5.1.10 chien1的表达分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 ChiEn1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及纯化 |
| 5.2.2 ChiEn1的亲和层析及SDS-PAGE检测 |
| 5.2.3 ChiEN的蛋白质质谱鉴定结果 |
| 5.2.4 ChiEn1的酶学特征 |
| 5.2.5 ChiEn1对几丁质寡糖的水解产物分析 |
| 5.2.6 ChiEn1对(GlcNAc)_(1-3)-pNP的水解 |
| 5.2.7 ChiEn1对几丁质寡糖水解产物异头体的构型分析 |
| 5.2.8 ChiEn1的蛋白结构模拟 |
| 5.2.9 chien1在灰盖鬼伞中不同部位的定量分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 灰盖鬼伞几丁质脱乙酰化酶Cda1的基因克隆、重组表达、鉴定和性质研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 菌株和质粒及培养基 |
| 6.1.2 PCR引物设计 |
| 6.1.3 Cda1基因的扩增 |
| 6.1.4 Cda1表达质粒的构建、发酵及表达分析 |
| 6.1.5 重组蛋白Cda1的亲和层析纯化 |
| 6.1.6 几丁质脱乙酰化酶的活性测定方法 |
| 6.1.7 HPAEC条件 |
| 6.1.8 几丁质寡糖脱乙酰化产物质谱分析 |
| 6.1.9 cda1在灰盖鬼伞不同部位的转录水平分析 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 Cda1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及纯化 |
| 6.2.2 Cda1的亲和层析及SDS-PAGE检测 |
| 6.2.3 Cda1的酶学特性 |
| 6.2.4 Cda1对几丁质寡糖的脱乙酰产物分析 |
| 6.2.5 cda1在灰盖鬼伞菌柄不同部位表达分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 灰盖鬼伞内切β-1,3-葡聚糖转糖苷酶rGlt1和rGlt2的基因克隆、重组表达、鉴定和性质研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 菌株和质粒及培养基 |
| 7.1.2 PCR引物设计 |
| 7.1.3 rGlt1和rGlt2基因的扩增 |
| 7.1.4 rGlt1和rGlt2表达质粒的构建、发酵及表达分析 |
| 7.1.5 重组蛋白rGlt1和rGlt2的亲和层析纯化 |
| 7.1.6 转糖基活性的检测 |
| 7.1.7 葡聚糖酶活性测定 |
| 7.1.8 温度和pH对Glt1蛋白活性的影响 |
| 7.1.9 Glt1对不同昆布寡糖的转糖基活性 |
| 7.1.10 HPAEC-PAD |
| 7.1.11 glt1和glt2在菌柄不同区域的qPCR分析 |
| 7.1.12 Glt1和Glt2进化树的构建 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 rglt1和rglt2扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及纯化 |
| 7.2.2 rGlt1的亲和层析及SDS-PAGE检测 |
| 7.2.3 rGlt2的亲和层析及SDS-PAGE检测 |
| 7.2.4 rGlt1和rGlt2的糖基转移酶活 |
| 7.2.5 rGlt1和rGlt2的内切活性的检测 |
| 7.2.6 rGlt1对昆布六糖的最适反应温度和最适pH |
| 7.2.7 rGlt1对不同寡糖的转糖基作用 |
| 7.2.8 glt1和glt2的qPCR分析 |
| 7.2.9 Glt1和Glt2的进化树分析 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文总结 |
| 附录 |
| 1 本论文所使用的仪器 |
| 2 主要试剂及来源 |
| 3 主要培养基和试剂的配制 |
| 4 标准曲线的绘制 |
| 4.1 Folin-酚法测蛋白浓度-酪氨酸标曲(用于测蛋白酶活) |
| 4.2 考马斯亮蓝法(Bradford法)测蛋白浓度-BSA标曲 |
| 4.3 DNS法测还原糖:N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线(测几丁质酶活) |
| 4.4 DNS法测还原糖:葡萄糖标准曲线(测葡聚糖酶活) |
| 4.5 对硝基苯胺标准曲线(用于几丁质脱乙酰化酶酶活分析) |
| 4.6 阴离子高效液相计算酶活-几丁质寡糖标准曲线 |
| 5 异源重组表达相关实验操作步骤 |
| 5.1 灰盖鬼伞总RNA的提取 |
| 5.2 灰盖鬼伞cDNA的合成 |
| 5.3 PCR扩增产物的检测及其目的片段的纯化回收 |
| 5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 5.5 pPICZαA质粒的提取 |
| 5.6 pPICZαA质粒的双酶切 |
| 5.7 毕赤酵母表达载体的构建 |
| 5.8 毕赤酵母表达载体的线性化 |
| 5.9 毕赤酵母的电转 |
| 5.10 重组蛋白的发酵及表达分析 |
| 6 缩写 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（9）β-N-乙酰己糖胺酶的异源表达及酶学性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语及符号说明 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 几丁质及其降解产物的应用 |
| 1.2 β-N-乙酰己糖胺酶研究概况 |
| 1.2.1 几丁质酶与 β-N-乙酰己糖胺酶 |
| 1.2.2 β-N-乙酰己糖胺酶的分类 |
| 1.2.3 β-N-乙酰己糖胺酶的来源与性质 |
| 1.2.4 β-N-乙酰己糖胺酶的结构 |
| 1.2.5 β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质 |
| 1.2.6 β-N-乙酰己糖胺酶的功能 |
| 1.3 β-N-乙酰己糖胺酶的应用 |
| 1.3.1 β-N-乙酰己糖胺酶在几丁质降解中的应用 |
| 1.3.2 β-N-乙酰己糖胺酶在绿色农药中的应用 |
| 1.3.3 β-N-乙酰己糖胺酶在医学上的应用 |
| 1.3.4 β-N-乙酰己糖胺酶在水生生态毒理学中的应用 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 重组 β-N-乙酰己糖胺酶基因的异源表达及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 常用溶液 |
| 2.1.5 常用培养基 |
| 2.1.6 DNA测序与引物合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 序列分析 |
| 2.2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.4 重组 β-N-乙酰己糖胺酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的诱导表达 |
| 2.2.5 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的纯化和鉴定 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的基因表达 |
| 2.3.2 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的纯化和鉴定 |
| 2.3.3 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 常用溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的定量 |
| 3.2.2 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的酶活测定方法 |
| 3.2.3 重组 β-N-乙酰己糖胺酶的酶学特性分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 重组 β-N-乙酰己糖胺酶r HL1nag的酶学性质研究 |
| 3.3.2 重组 β-N-乙酰己糖胺酶r JB10nag的酶学性质研究 |
| 3.3.3 重组 β-N-乙酰己糖胺酶r HJ5nag的酶学性质研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 创新 |
| 4.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 附录 |
| 附录A 实验中所使用的缓冲液的配置 |
| A1 不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制 |
| A2 不同pH值的甘氨酸-NaOH缓冲液的配制 |
| A3 不同pH值的Tris-HCl缓冲液的配制 |
| 附录B 三个重组 β-N-乙酰己糖胺酶基因序列 |
| B1 HL1nag的核酸序列 |
| B2 JB10nag的核酸序列 |
| B3 HJ5nag的核酸序列 |
| 附录C 三个重组 β-N-乙酰己糖胺酶氨基酸序列 |
| C1 HL1nag的氨基酸序列 |
| C2 JB10nag的氨基酸序列 |
| C3 HJ5nag的氨基酸序列 |
| 附录D 氨基酸中英文对照及缩写表 |
（10）海洋细菌DL-6几丁质酶和几丁质结合蛋白的生化性质与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 几丁质 |
| 1.1.1 几丁质的结构 |
| 1.1.2 几丁质的降解 |
| 1.2 几丁质酶 |
| 1.2.1 几丁质酶的来源和分类 |
| 1.2.2 几丁质酶的空间结构与催化机制 |
| 1.2.3 几丁质酶酶活测定方法 |
| 1.2.4 酶解产物的检测分析 |
| 1.2.5 几丁质酶的应用 |
| 1.3 几丁质结合蛋白(CBP)的研究 |
| 1.3.1 CBP的定义与分类 |
| 1.3.2 CBP结构与功能 |
| 1.4 海洋环境几丁质酶研究进展 |
| 1.5 论文的研究思路和内容 |
| 2 产低温几丁质酶菌株的筛选与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 胶体几丁质和培养基的配制 |
| 2.2.5 产酶菌株的筛选 |
| 2.2.6 产酶菌株的鉴定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 产酶菌株的筛选结果 |
| 2.3.2 产酶菌株16S rDNA序列分析与系统发育树的构建 |
| 2.3.3 产酶菌株最适温度的研究 |
| 2.3.4 产酶菌株生长曲线与产酶曲线的测定 |
| 2.3.5 菌株DL-6粗酶液最适反应温度和温度稳定性的测定 |
| 2.3.6 SDS-PAGE及酶谱分析 |
| 2.3.7 菌株DL-6几丁质酶系的初步研究 |
| 2.4 小结 |
| 3 几丁质酶系基因的克隆与序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 几丁质酶系基因的克隆 |
| 3.2.6 几丁质酶系基因的生物信息学分析 |
| 3.2.7 同源模建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 几丁质酶系基因全序列的克隆 |
| 3.3.2 几丁质酶系基因及其编码氨基酸序列分析 |
| 3.3.3 chiA和chiC基因编码氨基酸序列与保守氨基酸残基的分析 |
| 3.3.4 同源模建ChiA和ChiC的三维结构分析保守的催化氨基酸 |
| 3.3.5 CBP58编码氨基酸序列保守氨基酸残基的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 几丁质酶系蛋白的重组表达与纯化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 质粒 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 几丁质酶系基因表达质粒的构建 |
| 4.2.6 重组质粒的菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定 |
| 4.2.7 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 chiA/chiC/CBP58基因表达质粒的构建 |
| 4.3.2 ChiA/ChiC/CBP58在大肠杆菌内的重组表达 |
| 4.3.3 ChiA/ChiC/CBP58的Ni-NTA亲和纯化 |
| 4.3.4 重组蛋白的酶谱分析 |
| 4.3.5 4-甲基伞形酮荧光底物检测ChiA和ChiC酶活性 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 几丁质酶ChiA和ChiC的生化性质表征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 4-甲基伞形酮荧光底物测定酶活 |
| 5.2.4 铁氰化钾法(Schales法)测定还原糖含量 |
| 5.2.5 酶学性质表征 |
| 5.2.6 酶动力学参数的测定 |
| 5.2.7 底物特异性 |
| 5.2.8 高效液相色谱(HPLC)分析酶的作用方式 |
| 5.2.9 酶的降解产物分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组蛋白ChiA和ChiC酶学性质研究 |
| 5.3.2 酶动力学参数的测定 |
| 5.3.3 ChiA和ChiC的底物特异性 |
| 5.3.4 ChiA和ChiC的降解模式 |
| 5.3.5 ChiA和ChiC降解产物的分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 几丁质结合蛋白CBP58底物结合与协同降解作用研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 CBP58的功能研究 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 扫描电子显微镜(SEM)观察CBP58底物结合 |
| 6.3.2 CBP58与不同底物结合活性测定 |
| 6.3.3 几丁质酶系协同降解机制研究 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A Pseudoalteromonas sp.DL-6的16S rDNA序列 |
| 附录B 几丁质酶chiA的序列 |
| 附录C 几丁质酶chiC的序列 |
| 附录D 几丁质结合蛋白CBP58的序列 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、绿豆几丁质酶的纯化和酶学性质分析(英文)（论文参考文献）
- [1]嗜热烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系解析及协同机制研究[D]. 谷新晰. 东北农业大学, 2021
- [2]新型蛋白酶及几丁质酶的开发及其在虾加工废弃物中的应用[D]. 邓俊劲. 华南理工大学, 2020(02)
- [3]UV-C照射胁迫诱导凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶激活的机制研究[D]. 王贺. 广东海洋大学, 2019(02)
- [4]地衣芽孢杆菌TG116生防机制研究[D]. 焦正龙. 西北师范大学, 2019(06)
- [5]N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的表达研究及其应用[D]. 姜顺. 湖北大学, 2019(05)
- [6]产壳聚糖酶Mitsuaria sp.C4菌株的研究[D]. 陈聪聪. 福建师范大学, 2018(05)
- [7]滇金丝猴粪便微生物宏基因组来源几丁质酶和β-半乳糖苷酶的研究[D]. 杨正凤. 云南师范大学, 2018(01)
- [8]灰盖鬼伞菌柄细胞壁结构、组成及细胞壁重构酶的研究[D]. 牛鑫. 南京师范大学, 2016(01)
- [9]β-N-乙酰己糖胺酶的异源表达及酶学性质研究[D]. 宋志凤. 云南师范大学, 2016(02)
- [10]海洋细菌DL-6几丁质酶和几丁质结合蛋白的生化性质与功能研究[D]. 王晓辉. 大连理工大学, 2016(03)