徐丹[1]2003年在《原肌球蛋白对血管平滑肌细胞游走能力影响的研究》文中提出目的： 原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)是肌肉收缩过程中的一种调节蛋白。本课题将基因重组的人平滑肌TM的同源体-β(hsmTM-β)表达于人冠状动脉平滑肌细胞(CASMC)中，旨在探讨TM对血管平滑肌细胞(VSMC)游走能力的影响，为探索平滑肌中原肌球蛋白的作用开辟新径。 方法与结果： 一．基因重组hsmTM-β 采用套式PCR技术，从人主动脉cDNA文库中扩增hsmTM-β的cDNA目的基因片段，用dGTP和T4 DNA聚合酶修饰；在逆转录病毒载体pLIB基础上正向插入AS-RI-Nru片段构建载体pLIB-AS，用限制性内切酶NruⅠ和EcoRI消化。目的基因和载体经酚氯仿抽提，盐乙醇沉淀纯化后，用GENECLEAN Turbo核酸纯化试剂盒从琼脂糖胶中提纯DNA，最后在DNA连接酶作用下，将hsmTM-β的cDNA反插入pLIB-AS中，获得重组质粒pLIB-AS-hsmTM-β。用热休克法将重组DNA转化入感受态大肠杆菌XL10-Gold中，重组质粒按质粒的小规模制备的碱裂解法提取和纯化后，用限制性内切酶EcoRI验证其全长，用PCR方法验证其插入片段。结果显示用反插入法可以实现hsmTM-β的基因重组。借助DNA SIS软件分析人平滑肌TM和鸡平滑肌TM的cDNA核苷酸序列，发现二者同源性达84.7％。 二．hsmTM-β重组体的转染和表达 参照逆转录病毒基因的转染和表达使用手册，在DMEM和SmBM细胞培养液中分别培养人胚肾细胞(AmphoPack-293)和人冠状动脉平滑肌细胞(CASMC)至第叁代，用CalPhos~(TM)哺乳类转染试剂盒，将hsmTM-β重组质粒pLIB-AS-hsmTM-β和含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA的重组质粒pLIB-EGFP分别转染进AnlphoPack一293中，产生逆转录病毒，然后感染CAsMC使基因表达。用chariot蛋白转染试剂盒将鸡胃平滑肌原肌球蛋白(gTM)转染进hsmTM一p/AS反义表达组细胞中。蛋白表达用Westem Blot法检测。 叁.WestemBlot分析 从CASMC中获取胞质蛋白，经12.5%SDS一AGE电泳后，将蛋白转至PDVF膜上，用Westem blot法分析TM表达。PDV下膜用5%脱脂奶粉封闭液过夜后，以兔抗原肌球蛋白多克隆抗体为一抗(l:1000)，抗兔免疫球蛋白抗体为二抗(1: 5000)，结果显示以纯gTM为标准，与对照组和EGFP表达组相比，基因重组后的hsmTM一p表达敲除。在hamTM一p/AS反义表达组细胞补充了gTM后表达平滑肌原肌球蛋白(s mTM)，并随gTM蛋白转染量增多smTM表达增多。 四.VSMC游走测定 用Boyden’5 Ch田刀ber方法测定vSMC的游走，聚碳酸盐滤过膜使用前以0.01%I型胶原包被。培养的CASMC细胞以2 xl护/ml的密度经胰蛋白酶消化后悬于游走细胞培养液DMEM(含0.4%BSA)中。于Ch田刀ber的上室加感染不同质粒的CASMC;下室加含有PDGF一BB和不含有PDGF一BB游走细胞培养液。将Chamber移至二氧化碳孵箱中，37oC孵育5小时。随机选取四个400X高倍视野(4H卫F)内游走细胞平均数评估细胞游走能力。 在PDGF一BB趋化剂刺激下，与对照组和EGFP表达组相比，单纯hsmTM一p/AS反义表达组细胞游走能力明显增强(P<005)。细胞的随机游走能力在hemTM一p基因敲除时同样增强(P<0.05)。在hsmTM一侧AS反义表达组细胞补充gTM之后，hsmTM一p基因敲除对细胞游走的刺激作用消失口<0.05)。 结论 人平滑肌TM一p和鸡胃平滑肌TM一p的cDNA核昔酸序列的同源性达84.7%。反插入法可实现hsmTM一p的基因重组，westem blot证实hsmTM基因敲除。Boyden’s Chamber法测定平滑肌细胞游走，在PDGF一BB趋化剂下和细胞随机游走下hsmTM一p基因敲除后CASMC的游走能力均增强。
孔祥臣[2]2008年在《原肌球蛋白对肌球蛋白的作用研究》文中研究说明目的原肌球蛋白是一种细肌丝相关蛋白,对肌肉收缩起重要调节作用。有报道原肌球蛋白可以影响肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性,但其与肌球蛋白间的相互作用还不完全清楚。在本研究中,我们提出原肌球蛋白与肌球蛋白可能存在某种相互作用以及这种相互作用与肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性之间可能存在关联的假设。为了验证这个假设,我们在肌动蛋白存在和不存在两种条件下分别考察了心肌和平滑肌中原肌球蛋白与未磷酸化和磷酸化肌球蛋白的相互作用以及原肌球蛋白对两种状态肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性的影响。方法(1)结合实验:我们用结合实验考察原肌球蛋白与肌球蛋白的相互作用;(2)测定原肌球蛋白对不同状态肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性的影响。结果(1)肌动蛋白不存在条件下的相关实验:1)在结合实验中,原肌球蛋白可以分别减少心肌和平滑肌中肌球蛋白的沉淀量,这提示原肌球蛋白可以促进肌球蛋白的溶解,即具有促溶作用;2)在Mg~(2+)-ATPase活性测定实验中,原肌球蛋白可以分别增加心肌和平滑肌中肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性。(2)肌动蛋白存在条件下的相关实验:1)在结合实验中,原肌球蛋白可以显着抑制心肌和平滑肌中肌球蛋白与肌动蛋白之间的结合;2)在Mg~(2+)-ATPase活性测定实验中,原肌球蛋白可以抑制心肌中肌动蛋白激活的肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性,然而原肌球蛋白增加平滑肌中肌动蛋白激活的肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性。结论(1)本研究提示原肌球蛋白对肌球蛋白具有促溶作用,这种作用与其它调节蛋白如actin、calponin和caldesmon对肌球蛋白的作用不同,后叁者为与肌球蛋白结合使之沉淀。此外,原肌球蛋白对肌球蛋白的促溶作用具有如下两方面特征:第一,原肌球蛋白不仅对未磷酸化而且对磷酸化的肌球蛋白也具有促溶作用;第二,原肌球蛋白的这种促溶作用在心肌和平滑肌中具有一致性。(2)在肌动蛋白不存在条件下,原肌球蛋白增加肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性的作用在心肌和平滑肌中也具有一致性;(3)原肌球蛋白抑制心肌和平滑肌中肌球蛋白与肌动蛋白结合的作用在心肌和平滑肌中也具有一致性;(4)原肌球蛋白对心肌和平滑肌中肌动蛋白激活的肌球蛋白Mg~(2+)-ATPase活性的作用相反。本研究为更准确地阐明肌肉收缩机制提供了一些有用的信息。
杨静娴[3]2004年在《原肌球蛋白的分子生物学研究进展》文中指出原肌球蛋白 (TM )是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质 ,它以大量异构体形式广泛分布于各种真核细胞中。哺乳动物中的 4个TM基因已被确认 ,分别命名为TPM1、TPM2 、TPM3、TPM4 ,至少可表达出 2 0种TM异构体。TPM1基因突变与家族性肥大性心肌病有关 ;TPM3基因突变与线状肌病和骨骼肌无力有关
参考文献：
[1]. 原肌球蛋白对血管平滑肌细胞游走能力影响的研究[D]. 徐丹. 大连医科大学. 2003
[2]. 原肌球蛋白对肌球蛋白的作用研究[D]. 孔祥臣. 大连医科大学. 2008
[3]. 原肌球蛋白的分子生物学研究进展[J]. 杨静娴. 大连医科大学学报. 2004