王之发[1]2016年在《细胞外基质支架材料在软骨组织再生和骨组织工程中应用的初步探讨》文中研究指明研究背景口腔颌面部骨、软骨组织生物性再生修复是口腔医学领域需要解决的棘手问题。口腔颌面部肿瘤、创伤以及先天性畸形等都会导致颌面部骨和软骨组织的缺损,如下颌骨成釉细胞瘤、髁突发育不良、先天性上颌骨缺失等等。目前,临床上治疗骨缺损的金标准仍然是“自体骨移植”,但这种拆东墙补西墙的修复方式需要开辟第二战场,给患者造成二次损伤,病人所受的伤害和所需的花费都要增加很多。组织工程和再生医学的出现以及蓬勃发展,为医学上治疗这类缺损提供了很好的方向。其中,支架材料作为组织工程领域的叁大支柱之一,对组织工程的成功构建起着非常重要的作用。现在常用的支架材料主要分为两类:一是来源于天然组织,如胶原等;二是人工合成的高分子支架材料,如PCL等。两种材料都各有其优势和不足。其中,细胞外基质支架材料(ECM)由于其在组织形成和器官发育中的重要作用而被人们所熟悉并深入研究,而且,ECM对于细胞的生物学行为如迁移、增殖和分化等也有着直接的影响。因此ECM作为一种支架材料有着其独特的优势。本实验就是着眼于探讨ECM支架材料在软骨再生和骨组织工程中的应用,为以后临床应用ECM修复组织缺损提供一些可靠的依据。第一部分软骨细胞来源的细胞外基质支架材料在软骨再生中应用的初步探讨实验一软骨细胞膜片的构建目的:探讨软骨细胞膜片的构建方法,并分析其结构特征。方法:分离4周龄幼兔的耳软骨细胞,在高糖DMEM培养条件下连续培养2周;然后对获得的膜片进行大体学、组织学和超微结构的观察。结果:幼兔耳软骨细胞分离后生长状态良好,连续培养2周后即可形成膜片状结构;HE和番红O染色均证实了膜片是由软骨细胞及其自身分泌的细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)构成,扫描电镜(Scanning electronic microscope,SEM)和投射电镜(Transmission electron microscope,TEM)也都证实了软骨细胞膜片是由大量的ECM和镶嵌在其中的软骨细胞构成。结论:软骨细胞经过适宜的培养后可以形成膜片状结构,可用于以后的实验。实验二软骨细胞来源的细胞外基质支架材料的制备及其特征分析目的:探讨软骨细胞膜片最佳的脱细胞方法,并分析其脱细胞前后组织结构和生物力学特征等有无变化。方法:取实验一培养的软骨细胞膜片,然后分别在1%、5%和10%SDS中脱细胞处理24h,然后均再经过1%Triton X-100和脱氧核糖核酸酶中去除细胞碎片和残余的DNA,在对其进行组织学、超微结构以及生物力学的检测,分析其脱细胞前后特性有无变化。结果:1%、5%和10%SDS叁组处理方法均可比较彻底地去除细胞,但10%SDS会对细胞膜片的结构和特性造成很大的损害;而1%SDS既能比较彻底地脱细胞,又能在最大程度上维持细胞膜片原有的组织学结构和生物力学特征。结论:1%SDS是本实验中最佳的脱细胞方法,脱细胞后所获得ECM可以用于下一步的实验。实验叁软骨细胞来源的细胞外基质支架材料在兔膝关节骨软骨缺损修复作用的初步探讨目的:探讨ECM在软骨缺损中的修复作用,并比较1%、5%和10%SDS叁种脱细胞方法的优劣。方法:35只成年新西兰大白兔随机分为四组,分别为1%、5%、10%SDS和空白对照组,另外叁只作为阳性对照;膝关节骨软骨缺损模型建立后,分别植入已成功制备的ECM支架材料;在移植后的6周和12周时,分别安乐死牺牲掉实验动物,取材进行大体学观察、Micro-CT扫描和组织学染色,并做大体学和组织学评分;比较各实验组间有无差异。结果:叁个实验组均可在一定程度上修复骨软骨缺损,但大体学和组织学分析均证实1%SDS制备的ECM具有最好的修复效果,在移植12周后,缺损处已基本被新生的透明软骨组织所充填;而且Micro-CT扫描也表明1%DS组中,软骨下骨板再生情况最好。结论:1%SDS是最佳的脱细胞方法,经过1%SDS制备而来的ECM可以很好地修复骨软骨缺损,该ECM支架材料可作为一种新型的生物材料用于组织工程和再生医学。实验四软骨细胞来源的细胞外基质支架材料修复作用机制的初步探讨目的:初步探讨软骨细胞来源的ECM支架材料在骨软骨缺损修复中的作用机理。方法:首先利用Transwell小室分析VEGF和BMSCs对内皮细胞的迁移有无影响,并通过添加VEGF抑制剂V1来观察VEGF被抵消后,各实验组中内皮细胞的迁移率有无变化;然后再分析ECM对BMSCs的迁移有无影响;最后再通过RT-PCR和Western Blot分析ECM对BMSCs的分化有无影响。结果:VEGF、BMSCs和软骨细胞砖(Chondrocytes bricks,CB)等都对内皮细胞的迁移具有促进作用,而且BMSCs与最佳浓度的VEGF(10ng/ml)的促进作用相当,但当加入VEGF抑制剂V1后,内皮细胞迁移率明显降低,说明BMSCs可通过分泌VEGF来募集更多的内皮细胞;同时ECM还可以促进BMSCs的迁移,而且RT-PCR和Western Blot也证明了软骨细胞来源的ECM可以降低BMSCs的骨向分化和增加其软骨向分化的能力。结论:由于ECM或是富含ECM的CB具有很多生物活性成分,可以募集更多的干细胞达到缺损部位,启动修复和再生过程;而募集而来的干细胞又可以促进更多的血管内皮细胞迁移而来,同时也会分泌更多的VEGF,从而有利于组织再生的形成和维持;而同时,ECM又可以促进BMSCs的成软骨向分化,抑制其骨向分化,最终达到了软骨修复和再生。第二部分基于细胞外基质的骨髓间充质干细胞膜片在骨组织工程中应用的初步探讨实验一骨髓间充质干细胞膜片复合富血小板纤维蛋白在兔颅骨极限缺损修复作用的初步探讨目的:我们前期实验已经在裸鼠体内证实了富血小板纤维蛋白(Platelet-richfibrin,PRF)可以促进骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)膜片的成骨能力,本实验旨在验证BMSCs膜片-PRF复合体在骨缺损修复中是否有作用。方法:15只新西兰大白兔随进分为叁组:空白对照组(只做颅骨极限缺损而没有任何治疗);BMSCs膜片组(颅骨极限缺损+BMSCs膜片);BMSCs膜片-PRF复合组:(颅骨极限缺损+BMSCs膜片-PRF复合体)。移植8周后对其进行Micro-CT扫描和组织学分析。结果:空白对照组中仅有少量纤维组织覆盖缺损,而BMSCs膜片组中虽然有少量骨形成,但不足以修复缺损;但在BMSCs膜片-PRF复合组中,则可见大量新生的骨组织;新生骨体积/新生所有组织体积(Bone volume/Total volume,BV/TV)和组织学半定量分析也证实了BMSCs膜片-PRF复合组中缺损修复的效果最好。结论:BMSCs膜片-PRF复合体可以用于骨组织的缺损修复,该方法可作为一种新型的组织工程骨的构建方法,将来也许可以应用于临床。实验二骨髓间充质干细胞膜片复合脂肪来源干细胞构建组织工程骨的实验研究目的:探讨脂肪来源的间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)能否促进BMSCs膜片的成骨能力。方法:首先从同一供体身上分离培养ADSCs和BMSCs膜片,然后构建BMSCs膜片-ADSCs复合体,8只裸鼠随机分为两组:BMSCs膜片组,BMSCs膜片-ADSCs复合组;移植到裸鼠的背部皮下,移植8周后对其进行Micro-CT扫描和组织学分析。结果BMSCs膜片组中有少量散在分布的骨小梁和骨岛形成,但新生骨组织量很少;但在BMSCs膜片-ADSCs复合组中,则可见大量新生的骨组织和未完全成熟钙化的软骨组织;BV/TV和组织学半定量分析也证实了BMSCs膜片-ADSCs复合组中新生骨量更多。结论:BMSCs膜片-ADSCs复合体可以用于组织工程骨的构建。该方法可作为一种新型的组织工程骨的构建方法,将来也许可以应用于临床中。实验叁骨髓间充质干细胞膜片复合高温煅烧鸵鸟骨支架材料构建组织工程骨的实验研究目的:探讨BMSCs膜片和高温煅烧鸵鸟骨(Ostrich true bone ceramic,OTBC)支架材料用于构建组织工程骨的可能性。方法:首先制备OTBC支架材料,分析其理化特征、生物相容性和生物降解性,然后将预先培养的BMSCs膜片与OTBC复合后移植到裸鼠背部皮下观察期能否成骨,单纯OTBC材料作为对照组;移植8周后,组织学分析观察其成骨情况。结果:OTBC材料作为一种由羟基磷灰石(HA)和β-磷酸叁钙(β-TCP)构成的新型的支架材料,疏松多孔,具有很好地生物相容性和生物可降解性能;裸鼠体内成骨实验也证明了BMSCs膜片-OTBC联合应用具有很好地成骨潜能。结论:联合应用BMSCs膜片-OTBC支架材料具有很好的成骨潜能,该方法可作为一种新型的组织工程骨的构建方法,也许将来可应用于临床。
段巧艳[2]2007年在《骨髓间充质干细胞结合生物材料及向成骨细胞诱导分化的研究》文中研究指明研究目的：本课题初步研究了丝素羟基磷灰石复合材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性及其骨诱导性，为丝素羟基磷灰石复合材料作为支架材料应用于骨组织工程奠定理论基础。研究方法：实验组分为：丝素(Silk Fibroin，SF)、胶原(collagen，C)、羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、HA与丝素共混材料(1：1比例，HA／SF=1：1)、HA与丝素共混材料(4：1比例，HA／SF=4：1)、空白对照组。通过HE染色、MTT及流式细胞仪等方法比较BMSCs在不同的生物材料上的黏附、伸展、增殖情况及表面抗原表达情况。结合生物材料诱导BMSCs向成骨细胞定向分化，通过ALP活性检测，改良的钙钴法染色和Von Kossa染色鉴定诱导细胞的成骨特性及评价生物材料对BMSCs成骨性能的影响。结果：SF组、HA／SF=1：1组、HA／SF=4：1组、HA组与对照组相比，能够支持BMSCs的黏附、增殖，尤其是HA／SF=4：1复合材料可能和胶原一样能促进细胞的黏附、增殖。流式细胞仪分析表明丝素羟基磷灰石复合材料对BMSCs表面抗原表达影响较小。BMSCs在不同生物材料上成骨定向分化显示：HA／SF=4：1复合材料组的促成骨分化能力明显高于胶原、丝素及空白组，也高于HA／SF=1：1组，一定条件下，能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。结论：丝素羟基磷灰石复合材料具有良好的生物相容性及骨诱导性，为其进一步在骨组织工程领域应用展示了无比广阔的前景。
宗晨[3]2013年在《基于人骨髓间充质干细胞的组织工程技术研究》文中研究说明组织工程(Tissue Engineering)一词最早由美国国家科学基金委员会于1987年正式提出。它是应用细胞生物学和工程学的原理,研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上面形成复合物,然后将细胞-生物材料复合物植入病损部位,在生物材料逐渐被机体降解吸收的同时,细胞不断增殖、分化,形成新的形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织,达到修复创伤和重建功能的目的。由于具有重大科学意义,巨大临床应用前景和潜在的开发价值,使其成为研究的热门课题。目前的研究领域已经涉及心脏、骨、软骨、肝胆、皮肤等多种组织或器官修复治疗。由创伤或肿瘤导致的骨缺损是临床常见外科疾病,目前采用的自体骨移植、异体骨移植及人工合成替代品等治疗方法存在各自不足,难以满足临床需要。组织工程化骨组织研究为骨缺损修复治疗开辟了新的途径。由于骨缺损在临床上的常见性和治疗上的迫切性,近年来骨组织工程研究发展迅速；加之其组成结构相对单一,组织工程化骨有望成为最早进入临床应用的组织工程研究成果之一。而骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSCs)具有高增殖率、多分化潜能以及低免疫原性等特性,是最理想的组织工程用种子细胞。因此,本研究的前两部分内容(即第二章和第叁章)主要是基于人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的骨组织工程技术研究。第一部分：主要评估了hMSCs以及hMSCs来源的成骨样细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架对大鼠颅骨极限缺损的修复效果。将制备的干细胞支架复合物及成骨细胞支架复合物移植入SD大鼠颅骨极限缺损区域。同时利用荧光染料CM-Dil对植入细胞进行体内示踪。一定时间后对大鼠颅骨样本进行大体观察、组织学染色等检测来评估缺损区域的骨再生情况。体内实验结果表明：植入的人源细胞在大鼠体内可存活10周时间,干细胞及成骨细胞支架复合物均有助于缺损区域的骨再生。在异种移植模型中,相比成骨细胞支架复合物,干细胞支架复合物促进骨再生能力更强。本研究证实了基于hMSCs的组织工程技术应用于异种移植的可行性,且未分化干细胞更适用于异种移植研究。第二部分：为了进一步优化骨组织工程技术体系,寻找最适用于组织工程骨构建的支架材料,我们进行了接下来的研究。共聚物复合支架和生物陶瓷复合聚合物支架是应用于骨组织工程研究的两种最典型代表。而对上述支架的生物相容性及骨修复能力进行全面的比较评估对于临床应用支架的选择或改进具有重要意义。于是本研究在制备PLGA支架和羟基磷灰石聚乳酸聚合物(nHAP/PLA)支架的基础上,通过检测hMSCs在上述两种支架上的粘附、增殖以及成骨分化潜能情况对两种支架的生物相容性进行全面比较。然后将上述两种支架与hMSCs的复合物移植到大鼠颅骨缺损区域对其骨修复能力进行评估。体外研究结果发现nHAP/PLA支架比PLGA支架更有助于细胞粘附、胞外基质的分泌以及hMSCs向成骨细胞分化。而移植实验结果显示,两种支架复合物均有助于缺损区域的矿化和骨再生,但植入PLGA支架细胞复合物的缺损区域骨重建效果更加理想。nHAP/PLA支架的体内骨修复能力之所以未达预期效果,我们认为最可能是由于其体内降解速度过慢,阻碍了新生组织的生长所致。这提示我们,理想的骨组织工程支架必须考虑到生物相容性、力学性能、骨诱导性以及降解性能等,只有各方面性能达到平衡状态才是最理想的。第叁部分：进行上述研究同时,我们一直思索是否可以将该研究思路和技术体系应用于其他组织损伤修复,拓展其应用领域。随着腹腔镜胆囊切除术的出现,手术引起的胆道损伤数量显着增加,且术后易产生胆道狭窄、胆漏等并发症。而目前治疗手段均存在各自不可避免的问题。组织工程技术有望给胆管损伤提供治疗新的思路,给病人带来新的曙光。本研究的主要目的是评估入骨髓间充质干细胞复合胆管仿生支架修复胆管损伤的可行性,探讨组织工程技术在胆管损伤修复领域的应用前景。我们在制备新型PCL/PLGA双层胆管仿生支架的基础上,利用自行设计的干细胞-管道支架复合物制备装置制备了高质量hMSCs-PCL/PLGA胆管支架复合物,并将其移植到猪胆管损伤区域。通过一系列生化及组织学检测评估胆管损伤的修复效果。体外实验结果证明PCL/PLGA胆管支架可支持hMSCs的粘附、增殖以及胞外基质分泌,具有良好的组织相容性。较于单纯胆管支架,植入细胞支架复合物的胆管其损伤修复效果更好,胆总管吻合口炎症反应更轻。上述研究表明,hMSCs-胆管支架复合物不仅可以支持胆汁流通,还有利于胆管损伤修复。此外还证实了hMSCs应用于胆管组织工程的可行性,这种策略将为胆管损伤治疗提供新的思路。
李泸平[4]2016年在《组织工程化尿道构建及尿道缺损修复的实验性研究》文中研究表明研究背景及目的先天性尿道下裂以及尿道外伤、肿瘤、尿道狭窄等疾病的发生目前有逐年增高趋势,其有效解决办法还依赖于外科手术治疗。传统的外科手术处理,多应用自身包皮、阴囊组织原位修复,或者应用颊粘膜、膀胱粘膜等自体组织移植修复处理。但明显的缺陷就是容易并发术后尿道瘘、尿道再狭窄、尿道结石等,且对于再次手术、尿道缺损较长的病例,容易因自身修复材料不足而令临床医生产生治疗上的无奈。随着医学技术和相关学科的发展,组织工程学首先在骨科及皮肤科等领域出现并取得了一定的研究进展。这也为目前面临的尿道修复材料来源难题提供了一种全新的解决思路。目前国内外学者已经进行了该领域的实验性研究及少部分临床应用的尝试,取得了一定成就,也不同程度地暴露出了一些问题和弊端。特别是在种子细胞的选择方面,仍存在不少争议。研究发现,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,可定向分化为外胚层的神经元和神经胶质细胞、中胚层的成骨细胞和脂肪细胞、内胚层的肝细胞等。BMSCs具备与ECM的良好生物相容性,在组织工程研究中得到了广泛的应用,并首先在组织工程骨组织的构建试验中取得了很大的成功。另有研究证实,干细胞与尿道上皮细胞的直接接触可以诱导其向尿路上皮定向分化,但具体机制尚不明确。BMSCs的体外分离与培养主要采用以下几种方式:(1)贴壁筛选法;(2)密度梯度离心法;(3)免疫磁珠筛选法;(4)流式细胞仪分选法。尿路上皮细胞是较难培养的上皮细胞之一,既往人们曾经认为尿路上皮细胞会自然衰老凋亡,正常的尿路上皮细胞可以在体外存活,但时间短,很难在体外培养、传代,且无证据表明细胞有数量的增加。随着细胞培养技术的不断完善和细胞培养条件的优化,尿路上皮细胞的培养研究逐步展开并不断获得成功。动物实验表明,膀胱来源的尿路上皮细胞可在体外培养传代至3~12代。国外的研究随后证实,人膀胱移行上皮细胞的体外培养方面的研究也获得了成功。膀胱来源的尿路上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。本实验拟通过应用干细胞(骨髓间充质干细胞)和成体细胞(尿路上皮细胞)联合脱细胞基质材料的体外培养,并应用于长段尿道缺损的修复研究。通过比较实验结果,以期寻找更为理想的种子细胞,进一步推动尿道组织工程的发展。方法1.种子细胞的制备、筛选及鉴定1.1骨髓间充质干细胞的制备、筛选与鉴定选取雄性新西兰白兔为实验对象,抽取双下肢骨髓,利用密度梯度离心法分离提取骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增、传代。应用流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD44的表达,鉴定确认为骨髓间充质干细胞。将其作为实验用种子细胞之一。1.2尿路上皮细胞的制备、筛选与鉴定以雄性新西兰白兔为实验动物,机械分离法及酶消化法分离提取膀胱黏膜组织中的尿路上皮细胞,进行体外培养、传代。应用免疫荧光法鉴定尿路上皮细胞表面特异性表达因子及标记物——细胞角蛋白-18(CK-18)与和尿溶蛋白-2(UP2)的表达水平,鉴定确认尿路上皮细胞,并作为另外一种实验用种子细胞。2.种子细胞—脱细胞基质材料的复合培养与标记2.1骨髓间充质干细胞(BMSC)—脱细胞基质的制备选取培养传代后已接近90%融合的第4代BMSC,加入含有0.2%5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)的无血清低糖DMEM溶液培养标记,然后应用移液器将制备好的细胞悬液均匀滴加到脱细胞基质粘膜面。联合培养制备复合材料备用。2.2尿路上皮细胞—脱细胞基质的制备选取传代培养后已接近90%融合的第4代尿路上皮细胞备用,0.2%5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)共同培养标记。应用移液器将制备好的细胞悬液均匀滴加到脱细胞基质粘膜面,联合培养制备复合材料备用。3.尿道缺损模型的制作与修复3.1尿道缺损模型的制作全麻下游离雄性新西兰白兔尿道,切除中段尿道长约3cm,人工制作尿道缺损动物模型,备用。3.2尿道缺损的修复56只雄性成年新西兰兔,应用随机数字法分组,分为4组,每组14只。具体分组及修复操作如下:A组(无细胞对照组)即:单纯应用异种脱细胞基质修复组。应用空白脱细胞基质材料直接制作管状尿道,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建;B组(假手术组)即:假手术对照组。尿道缺损模型制作成功后,将尿道缺损后的两个尿道断端直接行端端吻合,恢复尿道连续性;C组(BMSCs组)即:BMSC复合异种脱细胞基质手术修复组。将BMSCs联合脱细胞基质材料联合培养后,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建,作为实验组之一;D组(尿路上皮细胞组)即:为尿路上皮细胞复合脱细胞基质手术修复组。将尿路上皮细胞联合脱细胞基质材料联合培养后,用于尿道缺损模型的尿道修复与重建,作为另一实验组。结果1.BMSCs呈贴壁式生长,由短梭形逐渐演变为长梭形外观。应用流式细胞仪检测传代至第4代的BMSC,可见其表达CD44阳性,而CD34的表达则为阴性,符合间充质干细胞特征;2.尿路上皮细胞呈贴壁式生长,呈圆形、类圆形外观,逐渐融合形成铺路石样外观。免疫荧光实验结果显示所培养的细胞表达CK-18与UP2呈阳性;3.BMSCs及尿路上皮细胞接种后脱细胞基质材料透明度降低,细胞均呈集落样生长,形成网状结构。4.四组试验动物均全部存活,B组修复后恢复最为顺利,A组修复效果最差,C、D组实验动物观察至术后12周修复效果相当,经统计学检验处理,两组差异无统计学意义。结论1.成功分离获得BMSCs,操作简单且来源丰富,可作为尿道组织工程种子细胞备选;2.成功分离获得尿路上皮细胞,细胞数量多,浓度高,可作为尿道组织工程种子细胞备选;3.BMSCs及尿路上皮细胞均能在脱细胞基质材料上贴附生长,形成立体网状结构,可以作为尿道缺损替代修复材料;4.`BMSCs和尿路上皮细胞均可作为种子细胞应用于组织工程化尿道的构建和长段尿道缺损的修复。
王飞[5]2015年在《人骨髓间充质干细胞和PLGA/TCP材料复合物在饲喂—培养灌流细胞罐中的成骨和成软骨分化》文中指出骨组织工程是一个涉及到多种学科的交叉研究领域,在骨缺损、骨不连等疾病的修复和重建治疗方面它已经展示了良好的发展前景。目前,骨组织工程的研究主要集中于以下叁个方面:(1)种子细胞的研究;(2)生物支架材料的研究;(3)工程化骨组织的体外构建。细胞-支架材料复合物的体外构建是骨组织工程中最重要的环节之一。我们实验室有关“个性化骨组织的细胞罐培养及其在动物中的应用研究”课题也主要围绕细胞-支架材料复合物的体外构建进行。本论文选择人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)作为种子细胞。我们验证了hBMSCs在进行孔板培养时的增殖能力、成骨分化和成软骨分化能力,hBMSCs进行成骨分化和成软骨分化后的染色实验、重要生化指标分析和标志基因的蛋白表达检测均表明,成骨和成软骨分化组相较于对照组,在细胞形态、重要生化指标和标志基因的蛋白表达上均发生了显着的变化,呈现出明显的分化趋势,证实了hBMSCs作为种子细胞的可行性。本论文针对四种细胞因子包括促红细胞生成素(EPO)、神经生长因子(NGF)、胰岛素类生长因子-1(IGF-1)和β-干扰素(IFN-β)进行诱导hBMSCs成软骨分化的检测,筛选出能促进hBMSCs成软骨分化的新细胞因子。结果发现完全培养基中加入100ng/mL IFN-β,h BMSCs在形态上发生显着变化,alcain blue染色和GAG总含量检测均证实IFN-β具有诱导hBMSCs成软骨分化的能力。IFN-β和TGF-β3的不同组合实验结果表明,IFN-β促进hBMSCs成软骨分化的能力要强于传统成软骨诱导因子TGF-β3,而且两者一起作用的效果要远远好于单独作用。不同浓度的IFN-β实验结果表明,100ng/m L IFN-β和10ng/m L TGF-β3组合促进hBMSCs成软骨分化的效果更好。本论文选择聚乳酸-羟基乙酸/磷酸叁钙(PLGA/TCP)材料作为hBMSCs增殖和分化的支架材料,我们首先验证了PLGA/TCP材料是否具有良好的生物相容性。扫描电镜结果展示hBMSCs充分利用材料的多孔特性,在材料上的增殖能力明显好于2D的孔板培养。MTT检测和ALP酶活性检测结果表明,PLGA/TCP材料具有良好的生物相容性,不仅能支持hBMSCs的粘附和生长,还能促进hBMSCs的增殖和分化。我们接着检测了PLGA/TCP材料在动物体内的生物安全性,热原实验、溶血实验、急性全身毒性实验、皮内刺激反应实验、皮下植入实验等实验结果均表明PLGA/TCP材料在动物体内的生物安全性良好,且降解速度适宜,降解产物无害,可以作为hBMSCs的载体支架植入体内。本论文设计的饲喂-培养灌流细胞罐系统同时处理多个hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物。支架被固定在培养罐中,饲喂罐通过实时的监控和控制系统为细胞提供含有充足的营养和氧气、具有适宜pH值和温度的培养基。我们分析了hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物在饲喂-培养灌流细胞罐系统中进行动态培养时的成骨分化和成软骨分化水平。扫描电镜、重要生化指标、qRT-PCR、western blotting等检测结果表明在细胞罐的动态培养下,hBMSCs在PLGA/TCP支架上不仅增殖迅速,而且其成骨分化水平比静态培养时更高,各项数据之间比较都具有明显差异,其成软骨分化水平和静态培养时相当。我们依据以上数据验证了饲喂-培养灌流细胞罐系统应用于骨组织工程的可行性。我们的研究证明了利用hBMSCs作为种子细胞,PLGA/TCP材料作为细胞支架,由具有组成结构优势的饲喂-培养灌流细胞罐系统对hBMSCs和PLGA/TCP支架复合物进行动态培养,从而大规模进行骨组织工程所需要细胞-支架材料复合物的体外构建具有非常高的可行性。而IFN-β促进间充质干细胞成软骨分化能力的发现为骨组织工程指出了新的研究方向。
胡斌[6]2016年在《骨髓间充质干细胞与软骨细胞聚集共培养修复兔膝关节骨软骨缺损的研究》文中指出一、体外骨髓间充质干细胞与软骨细胞聚集共培养体系的建立目的:探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)与软骨细胞(Articular Chontrocytes,ACs)在体外通过离心聚集构建的共培养体系下,其分化为ACs的能力。方法:4周龄新西兰大白兔幼兔在无菌环境下,取其骨髓和软骨,通过分离、贴壁培养、传代BMSCs和ACs。利用流式细胞仪测CD44、CD31对BMSCs进行鉴定,利用阿利新蓝染色、番红花O-亮绿染色及Ⅱ型胶原染色免疫组化染色对ACs进行鉴定。ACs和BMSCs按1:3的比例混合为CO组,细胞总数为4×107,在500g离心力下离心5分钟,聚集共培养于15ml离心管内。另取等量的ACs为AC组,以上述方法培养于离心管内作对比研究。隔日换液,收集细胞培养上清液,利用阿利新蓝比色法定量检测细胞糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量,酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)定量检测Ⅱ型胶原含量。结果:经鉴定获取的BMSCs CD44(+)、CD31(-);ACs阿利新蓝、番红花O-亮绿及Ⅱ型胶原染色免疫组化染色均阳性。利用贴壁培养传代可获取满意纯度BMSCs和ACs。CO组与AC组离心管内聚集共培养叁周,检测分泌的GAG含量和Ⅱ型胶原含量无差异(P>0.05);至第四周末检测分泌的GAG含量和Ⅱ型胶原含量有差异(P<0.05)。结论:BMSCs和ACs通过离心管内聚集共培养可诱导BMSCs分化为ACs。二、体内骨髓间充质干细胞与软骨细胞聚集修复兔膝关节骨软骨缺损目的:研究利用bmscs和acs离心管内聚集共培养构建无支架细胞团修复兔膝关节骨软骨缺损的能力。比较细胞共培养体系与acs、bmscs及空白体内修复骨软骨缺损的能力。方法:构建兔膝关节骨软骨缺损模型,以手摇钻在兔膝关节双侧股骨髁间凹制造直径4mm的骨软骨缺损。将acs和bmscs分别染以细胞膜荧光染色剂pkh-67和pkh-26后,以1:3的比例混合,细胞总数为4×107,于15ml离心管内500g离心5分钟成团。再分别以等量bmscs和acs以上述方式处理制成的细胞团。用这叁组细胞团分别修复兔膝关节骨软骨缺损。另留取一组关节缺损不修复,作为空白组。共四个处理组:共培养修复组(co组)、acs修复组(ac组)、bmscs修复组(bmsc组)、空白组(empty组)。每个组样本量18只兔36膝。在兔体内修复关节骨软骨缺损后分别在4周、8周、12周叁个时间点各取每组12个样本,取出关节后,按照cook's评分系统进行关节修复情况的大体评价。各样本取样切片,进行组织细胞学观察(冰冻切片观察细胞荧光、he染色观察修复组织细胞形态、番红花o染色观察软骨细胞分泌gag的能力、Ⅱ型胶原免疫组化染色观察acs分泌Ⅱ型胶原的能力),并按wakitani's组织学评分系统进行评分。结果:各组兔膝关节骨软骨缺损得到不同程度修复,co组和ac组修复外观优于bmsc组和empty组,cook's评分结果有统计学意义(p<0.05),co组与ac组的cook's评分结果无统计学意义(p>0.05)。12周冰冻切片荧光显示bmscs和acs共同参与了骨软骨的修复,但单纯bmsc组中外源bmscs参与修复骨软骨的能力有限。各时间点co组和ac组的骨软骨缺损由透明软骨细胞或纤维软骨细胞修复,软骨细胞外基质分泌丰富;bmsc组和empty组的骨软骨缺损由纤维组织修复,缺乏软骨细胞外基质。co组和ac组的wakitani's组织学评分与bmsc组和empty组的差异有统计学意义(p<0.05)。co组与ac组的wakitani's组织学评分差异无统计学意义(p>0.05)。结论:1、可利用离心管内聚集共培养技术制作无支架细胞团修复兔膝关节骨软骨缺损。2、体内BMSCs可被ACs诱导分化为软骨细胞并参与修复骨软骨缺损,BMSCs修复骨软骨的能力有限。3、BMSCs和ACs聚集成团共培养体系无支架修复兔膝关节骨软骨缺损的能力不弱于全软骨细胞团,可替代全软骨以节约软骨细胞的使用。
吴晶磊[7]2012年在《纳米纱叁维支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨》文中研究说明组织工程学是应用细胞生物学、生物材料学和工程学原理,以组织工程支架、种子细胞和生长因子为基础,来研究和开发生物活性替代物用于创伤组织修复以及组织再生的一门科学。组织工程支架的构建是组织工程学的核心内容和研究热点之一。静电纺丝技术可以将天然材料、合成材料以及二者的复合物制备成纳米或微米纤维膜。这种静电纺纤维膜比表面积大,孔隙率高,结构上十分类似于细胞外基质,因而十分具有组织工程应用前景。目前有很多静电纺纤维支架在皮肤、血管以及神经修复方面的应用,但是鲜有静电纺纤维支架成功修复软骨组织的报道。软骨组织都有一定的厚度(2.2-2.5毫米),而细胞仅能在传统静电纺纤维支架的表面呈单层生长,因而不能完全修复软骨组织。本研究中,我们通过改进静电纺丝接收装置,用动态液体接收静电纺纳米纤维。此过程中,静电纺聚乳酸-聚已内酯/胶原纳米纤维通过水流漩涡的作用抱合成一束纱(～24微米,称之为纳米纱),并通过一个转轴接收,再经冷冻干燥成型,即得到纳米纱叁维支架。场发射扫描电镜(FE-SEM)表明,这种新型叁维支架是由取向排列的纳米纱组成,疏松多孔,纱表面粗糙,纱与纱之间形成大孔和沟槽结构。傅利叶红外测试结果证明,支架中有聚乳酸-聚已内酯和胶原的特征吸收峰并且没有新的吸收峰产生,说明支架制备过程对材料化学成分没有影响。此外,力学测试结果证明该支架具备良好的力学性能。体外生物相容性测试以猪髋内皮细胞(PIEC)和小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)种子细胞。MTT结果表明,纳米纱叁维支架比传统静电纺纳米纤维支架更利于细胞生长,PIEC和MC3T3-E1在纳米纱叁维支架增殖速度更快;组织学分析(H&E染色)表明细胞能逐渐长入纳米纱叁维支架内部,而仅在纳米纤维支架的表面生长;FE-SEM和激光共聚焦扫描(CLSM)都证明细胞在纳米纱叁维支架上铺展更开,呈梭形或线形生长。此外,PIEC在纳米纱支架上沿着纳米纱生长,形成类似毛细血管结构,说明这种纳米纱叁维支架能够引导细胞生长,或许能促进再生组织血管化。为了进一步提高支架的性能,我们通过冷冻干燥将胶原/透明质酸复合到纳米纱支架中,得到形态更稳定的仿生叁维支架。以兔源骨髓间充质干细胞(BMSC)为种子细胞复合叁维支架体外构建组织工程软骨。阿尔新蓝染色结果均表明,在含转化生长因子(TGF-β1)的诱导培养基中,可以将BMSC诱导为软骨细胞;CLSM证明细胞在支架上沿纳米纱方向呈取向生长。此外,H&E切片证明细胞能长入支架内部。将叁维支架与医用大孔β-磷酸叁钙(β-TCP)通过冷冻干燥结合,得到骨-软骨双相支架。BMSC在双相支架上体外诱导培养叁周后,植入骨-软骨缺损兔体内。结果表明,叁个月后,植入细胞-支架组的兔骨-软骨缺损得到完全修复。
陈诚, 李淑慧, 张文丽, 李一鸣, 周晶[8]2014年在《富血小板纤维蛋白释放转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响》文中提出背景:骨髓间充质干细胞是组织修复的理想细胞,能否提高其体外增殖的能力是促进组织修复的关键因素。目的:观察转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响。方法:兔耳中央动脉抽血,离心制备富血小板纤维蛋白,置于新鲜的DMEM培养液中,分别于37℃下静置7,14,21,28 d,收集富血小板纤维蛋白析出液,检测析出液中转化生长因子β1质量浓度。抽取兔骨髓进行体外培养骨髓间充质干细胞,将收集的富血小板纤维蛋白析出液配制成条件培养液作用于骨髓间充质干细胞,观察其对骨髓间充质干细胞增殖的影响。结果与结论:转化生长因子β1质量浓度随着时间的递增而增高,21-28 d是质量浓度增长最快阶段,在28 d时达到高峰;同一刺激浓度下,骨髓间充质干细胞增殖在0至1 d降低,1至2 d明显升高,2至3 d为平缓期,骨髓间充质干细胞增殖速度最快的是150 ng/L组。实验证实了富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1的质量浓度随着时间的增加而增高,含有不同质量浓度转化生长因子β1的条件培养基对骨髓间充质干细胞增殖起到不同的促进作用,骨髓间充质干细胞在含有质量浓度为150 ng/L转化生长因子β1的条件培养基中培养两叁天时,增殖速度为最快。
邢军超[9]2014年在《间充质干细胞在组织工程骨修复骨缺损起始环节中的作用机理研究》文中进行了进一步梳理研究背景：临床上,由肿瘤切除、创伤、先天性骨关节病、骨感染性疾病和骨关节炎等原因所致的大节段骨缺损十分常见且修复困难,通过组织工程学技术将种子细胞MSCs (mesenchymal stem cells,间充质干细胞)接种于叁维立体支架构建的组织工程骨在大节段骨缺损治疗中的安全性和有效性已经被证实,组织工程骨成为目前修复大节段骨缺损最有希望的策略之一。种子细胞MSCs在组织工程骨的成骨修复过程中发挥重要作用,但具体作用机制不详,严重制约了组织工程骨的应用和发展。骨缺损的修复由早期炎症反应启动,此过程释放大量趋化因子和炎症介质,诱导内源性成骨前体细胞向组织损伤部位迁移。组织工程和再生医学最近的研究表明MSCs可能通过募集宿主成骨相关细胞的间接方式促进骨缺损修复。在体外培养过程中,MSCs可自发分泌多种与细胞迁移密切相关的趋化因子,其表面同时表达多种趋化因子受体。基于此,我们提出MSCs促进成骨修复的可能机制：在组织工程骨修复骨缺损的早期,局部创伤产生的炎症微环境刺激了种子细胞MSCs,MSCs通过分泌多种趋化因子和细胞因子,如SDF-1(stromal cell-derived factor-1,基质细胞衍生因子1)、MCP-1(monocyte chemotactic protein-1,单核细胞趋化蛋白1)等,募集宿主的成骨相关细胞迁移至骨缺损部位促进成骨修复。研究目的：(1)分离、培养hBMSCs (human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,人骨髓来源间充质干细胞)和mBMSCs (mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells,小鼠骨髓来源间充质干细胞),作为研究对象和实验材料。(2)体外模拟炎症微环境,观察其对hBMSCs分泌表达谱及其募集宿主hBMSCs能力的影响,筛选在种子细胞募集宿主hBMSCs过程中发挥重要作用的趋化因子。(3)以mBMSCs为种子细胞复合pDBM (partially decalcified bone matrix,部分脱钙骨基质)支架构建组织工程骨,构建稳定、可重复性好、适用于骨组织工程基础研究的小鼠双侧临界股骨缺损模型,组织工程骨移植骨缺损后评价组织工程骨的成骨修复效果,比较最终的新生骨组织中外源性和宿主内源性细胞所占比例。(4)组织工程骨移植小鼠股骨缺损,观察宿主细胞募集情况,明确募集的宿主细胞种类,初步探索种子细胞募集宿主细胞的作用机制。研究方法：(1)采用密度梯度离心结合贴壁的方法分离培养hBMSCs,采用全骨髓细胞贴壁的方法分离培养mBMSCs, hBMSCs和mBMSCs均通过细胞形态、细胞表面的抗原标志物和多向分化潜能鉴定。(2)在体外向培养基中加入IL-1β(interleukin-1β,白介素1β)、IL-6和TNF-α (tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子α)模拟炎症微环境并刺激hBMSCs,收集条件培养基,通过Transwell迁移实验检测不同的条件培养基对hBMSCs的募集作用,通过半定量和定量的细胞因子抗体芯片筛选在宿主hBMSCs募集过程中发挥重要作用的趋化因子。(3)采用双面静置接种法,以野生型mBMSCs作为种子细胞复合pDBM支架构建组织工程骨,环境扫描电镜观察确认构建结果；以GFP (green fluorescent protein,绿色荧光蛋白)+转基因小鼠为受体,利用本课题组自行设计的小鼠股骨内固定钢板制备双侧股骨临界骨缺损模型；左右两侧股骨缺损分别移植组织工程骨和pDBM支架,术后通过Micro-CT、HE (hematoxylin-eosin,苏木精伊红)染色和检测OCN (osteocalcin,骨钙素)mRNA表达量比较组织工程骨与pDBM支架的成骨修复效果；通过激光共聚焦显微镜扫描、计算、比较新生骨组织中外源性和内源性细胞比例。(4)移植术后不同时相点取双侧股骨或移植物,通过小动物活体成像系统初步观察宿主细胞募集情况,制备组织切片,通过病理染色及细胞计数评价种子细胞对宿主细胞的募集作用,通过免疫荧光染色明确募集的宿主细胞种类；移植术后不同时相点取双侧股骨或移植物,通过RT-PCR比较组织工程骨和pDBM支架内SDF-1、CXCR4 (C-X-C motif chemokine receptor-4, CXC类趋化因子受体4)、MCP-1、CCR2(C-C motif chemokine receptor-2,CC类趋化因子受体2)、CD34、CD14和CD31 mRNA表达量的差异,初步探索种子细胞募集宿主细胞的作用机制。研究结果：(1)采用密度梯度离心结合细胞贴壁法分离的第四代人骨髓间充质干细胞,镜下可见成纤维细胞样细胞贴壁生长,呈长梭形,形态均一；流式细胞检测细胞表型显示：MSCs抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105高表达；造血系抗原CD34、CD45和内皮细胞系抗原CD31低表达；诱导分化的第四代细胞经茜素红染色和油红O染色证实具有成骨和成脂分化潜能。采用全骨髓细胞贴壁的方法分离培养的第四代小鼠骨髓间充质干细胞,具有均一的成纤维细胞形态,呈漩涡状生长；流式细胞检测细胞表型显示：MSCs抗原CD73、CD90和CD105阳性：造血系抗原CD45以及内皮细胞系抗原CD31均为阴性；特殊病理染色证实第四代细胞具有成骨、成脂分化能力。(2)未经炎症微环境刺激的hBMSCs的条件培养基募集宿主hBMSCs的能力显着强于空白培养基,略高于包含有前炎症因子的炎性培养基；经炎性处理的hBSMCs募集hBMSCs的能力显着强于未经炎症微环境刺激的hBMSCs;半定量细胞因子抗体芯片结果显示hBMSCs经炎症微环境刺激后,11种趋化因子的表达量显着增加,包括CXCL16(CXC chemokine ligand 16, CXC趋化因子配体16)、骨保护素、GRO(growth-regulated oncogene,生长调节致癌基因)、ENA78(epithelial neutrophil-activating peptide-78,上皮细胞来源的中性粒细胞活化肽78)、MIP-1δ(monocyte chemoattractant protein-1δ,巨噬细胞炎性蛋白1δ)、MCP-1、MCP-2、MCP-3、GCP-2(granulocyte chemotactic protein-2,粒细胞趋化蛋白2)、IL-6和IL-2Ra(interleukin-2 receptor a,白介素2受体α)。定量细胞因子抗体芯片进一步证实炎症微环境可刺激hBMSCs分泌更多的趋化因子,其中21种趋化因子表达量显着增加。(3)采用双面静置接种法构建的组织工程骨细胞上架率高,扫描电镜观察结果显示接种后第10天,细胞紧密粘附于支架材料内表面生长,并分泌大量的细胞外基质；利用本课题组自行设计的小鼠股骨内固定钢板构建的双侧临界骨缺损模型手术时间短,术后动物很快恢复日常活动；钼靶X线证实建模成功,组织工程骨成骨修复效果显着优于对照的pDBM支架,Micro-CT, HE染色和OCN表达量测定的结果进一步证实了此现象；利用GFP+转基因小鼠,我们发现在组织工程骨介导的新生骨组织中,宿主细胞的贡献比例约为90.42%,远高于外源性细胞。(4)小动物活体成像系统观察显示组织工程骨和pDBM支架区荧光强度随时间增加,在术后第7天和第10天,组织工程骨内荧光强度显着高于pDBM支架。激光共聚焦显微镜观察结果证实术后第7天,组织工程骨内宿主细胞数量显着多于pDBM支架内细胞数量,此差异在术后第10天仍然存在。免疫荧光染色结果显示,移植术后组织工程骨内CD73+和CD90+宿主细胞数量均随时间延长而增加,且组织工程骨内CD73+和CD90+宿主细胞数量显着多于pDBM支架内细胞数量；移植术后第3天,组织工程骨内CD14+宿主细胞数量相比术后第1天有所减少,且少于pDBM支架内细胞数量,术后第7天,组织工程骨内出现大量CD14+宿主细胞,其数量显着高于pDBM支架内细胞数量,此差异在术后第10天仍然存在；移植术后,组织工程骨内CD31+宿主细胞数量显着多于pDBM支架内细胞数量,组织工程骨内CD31+宿主细胞数量在术后第10天达到最大值,之后逐渐减少。进一步的RT-PCR (real-time polymerase chain reaction,实时定量荧光多聚酶链反应)结果显示,移植术后第7天和第10天,组织工程骨内SDF-1和CXCR4 mRNA表达水平均显着高于pDBM支架,与之一致的是CD34 mRNA表达量的差异；移植术后第7天,组织工程骨内MCP-1、CCR2和CD 14 mRNA表达水平显着高于pDBM支架,术后第10天,组织工程骨内MCP-1和CD 14 mRNA表达水平仍显着高于pDBM支架。研究结论：(1)采用密度梯度离心结合细胞贴壁法和全骨髓细胞贴壁法分别分离培养的人和小鼠骨髓间充质干细胞具有成纤维样细胞形态,体外增殖能力强,具有多向分化潜能,表达多种间充质干细胞表面抗原标志物,可以作为本研究的研究对象和实验材料；(2)在体外培养过程中,hBMSCs可自发分泌多种细胞因子,这些因子可促进宿主hBMSCs的迁移；炎症微环境的刺激可显着增强hBMSCs分泌趋化因子的能力,进而增强hBMSCs募集宿主hBMSCs的能力；在炎症微环境刺激hBMSCs分泌的众多趋化因子中,GRO表达量最高,可能在一定程度上影响宿主hBMSCs的迁移；(3)采用双面静置接种法构建的组织工程骨满足本研究的要求；构建的小鼠双侧股骨临界骨缺损模型稳定、可重复性好,支持影像学、分子生物学、组织形态学等检测手段,适用于骨组织工程基础研究应用；组织工程骨修复骨缺损效果显着优于空白支架,说明种子细胞在成骨修复过程中发挥重要作用,但最终的新生骨中外源性细胞所占比例很低,新骨形成主要依赖于宿主来源成骨相关细胞的贡献。(4)在骨缺损修复早期炎症反应阶段,组织工程骨内MSCs可募集更多的宿主细胞至骨缺损处促进成骨修复,募集的宿主细胞种类包括MSCs,单核细胞和内皮祖细胞,SDF-1/CXCR4和MCP-1/CCR2两条轴在宿主细胞的募集过程中发挥重要作用。
汪华清[10]2015年在《miR-125b调控人骨髓间充质干细胞成骨机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的随着国内人口年龄结构逐渐步入老龄化,许多老龄化相关的疾病日渐引起医学界的广泛重视。骨质疏松作为一种老年人群高发的疾病,尤其重度骨质疏松具有较高的骨折风险,同时此类骨折发生后容易迁延不愈,是严重影响老年人健康和生活质量的一类骨科门急诊常见病。世界卫生组织已将骨质疏松、糖尿病与心血管病一起列为影响中老年人健康的“叁大杀手”。此外,临床上因严重暴力所致的大段骨缺损、骨折后不愈合以及骨不连一直以来都是创伤骨科中的治疗难点。以上疾病的发生和发展均与机体内骨代谢失衡,成骨能力受损密切相关。因此,对成骨机制的研究和探索,将可能为这些临床问题的解决提供支持。人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)作为成骨细胞重要的一种前体细胞,在骨的形成和成骨分化上都起着重要的作用。随着对间充质干细胞成骨机理的研究不断深入,将有助于我们更好地理解多种骨病的病理过程,为此类疾病的治疗寻找新的思路。此外,hBMSCs具有较强的增殖能力和多向分化潜能,是骨组织工程领域最重要的种子细胞来源,同时在干细胞移植领域也具有广泛的应用前景。microRNA(miRNAs)是一类广泛存在于真核生物细胞内的非编码单链小分子RNA,它能够与靶基因的3’非翻译区部分碱基互补结合,继而调控基因的表达,在生物体内众多基本的生理和病理过程中都扮演着重要的角色。近年来,越来越多的研究表明miRNAs在成骨细胞和破骨细胞的动态平衡中起着重要的调控作用,并且直接参与了诸多骨病如骨质疏松、关节炎等疾病的发生和发展过程。有研究发现,miR-125b在成骨过程中下调,但具体的调控机制尚不完全明了。本研究选定miR-125b作为研究对象,希望通过对miR-125b调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究。进一步丰富干细胞成骨定向分化的理论体系,同时可加深对骨骼发生、发育的分子机制认识,为骨质疏松防治,骨折治疗,骨缺损修复寻找新的治疗思路并提供理论支持。研究方法1.人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定使用密度梯度离心的方法,从健康成年志愿者捐献的骨髓中分离获取hBMSCs,通过传代、培养、纯化,获取稳定的干细胞来源。培养过程中注意观察贴壁细胞形态变化,使用MTT法检测其增殖活力。经流式细胞术检测细胞表面抗原对细胞属性进行鉴定,通过成骨、成脂、成软骨诱导分化,对hBMSCs的多向分化能力即干性进行鉴定。2.miR-125b对hBMSCs成骨分化的影响用慢病毒转染的方式对细胞进行干预。首先将人工合成的miR-125-pre和miR-125b-inhibitor核酸序列构建到慢病毒载体并转染hBMSCs。对转染后的细胞转染效率和增殖能力进行观察检测。然后,采用Real Time RT-PCR技术检测转染后细胞内miR-125b表达量的变化。最后,使用Real Time RT-PCR和Western Blot对间充质干细胞成骨分化过程中重要的成骨因子包括ALP,Runx2,OSX以及OCN的表达情况进行核酸和蛋白水平上的检测,观察其表达变化情况。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,通过细胞显色情况鉴定其成骨分化能力。3.miR-125b调控hBMSCs的作用靶点预测及验证首先,选用生物信息学的方法,使用Target Scan,miRanda及Pic Tar作为靶基因预测工具,对可能与miR-125b结合的靶基因序列进行筛选预测,选择可能与其结合的潜在靶点BMPR1b作为研究对象。随后,构建BMPR1b的荧光素酶报告载体,使用双荧光素酶报告的方法对所预测的靶基因进行初步验证。最后,将hBMSCs分别转染miR-125b的上调和下调慢病毒载体,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测当细胞内miR-125b表达水平变化时,BMPR1b的mRNA和蛋白表达变化。4.miR-125b抑制hBMSCs成骨分化的机制首先使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测hBMSCs成骨过程中BMPR1b的表达变化。随后,采用RNAi技术,将BMPR1b的siRNA载体转染hBMSCs,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测Runx2,OSX以及OCN的mRNA和蛋白表达变化。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,鉴定成骨分化能力。最后,将miR-125b-inhibitor与si-BMPR1b共转染hBMSCs,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测Runx2,OSX以及OCN的mRNA和蛋白表达变化。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,鉴定成骨分化能力。5.miR-125b调控hBMSCs成骨分化的体内研究首先,建立裸鼠股骨原位骨缺损模型。随后,将miR-125b-inhibitor转染hBMSCs,将细胞复合至DBM后进行成骨诱导,再通过手术的方式将DBM移植至裸鼠体内,利用micro CT观测新骨生成状况,采用组织切片,HE染色和Masson染色,从细胞的微观角度评估成骨能力。研究结果1.本实验所采用的密度梯度离心法分离获取hBMSCs,培养过程中细胞各项指标表明hBMSCs细胞形态正常,具有较强的增殖活力。hBMSCs的阳性表面抗原CD73,CD90,和CD105阳性率均在95%以上,而阴性抗原CD34,CD45,CD14,CD19,HLA-DR阳性率在5%以下。符合hBMSCs鉴定标准。此外,分离培养的hBMSCs具备成骨、成软骨和成脂的多向分化能力,具备良好的干性。2.在hBMSCs向成骨分化的过程中,miR-125b处于低水平表达的状态。慢病毒载体对hBMSCs转染效果较好,且对细胞的增殖不产生影响。在hBMSCs成骨分化过程中,上调miR-125b表达能够抑制成骨。相反地,下调miR-125b则能够促进hBMSCs的成骨分化。3.生物信息学预测出BMPR1b基因可能是miR-125的作用靶点。双荧光素酶报告实验证实miR-125b在细胞内能与BMPR1b的3’UTR部分碱基序列存在结合位点。在hBMSCs中,上调miR-125b能够抑制BMPR1b的mRNA和蛋白表达。相反,下调miR-125b则能够增加BMPR1b的mRNA和蛋白表达量。4.hBMSCs成骨分化过程中,BMPR1b呈高表达状态。沉默BMPR1b的基因后,hBMSCs的成骨能力下降。miR-125b-inhibitor与si-BMPR1b共转染hBMSCs后,hBMSCs的成骨分化能力同样受到抑制。5.对miR-125b调节成骨分化的体内研究发现,转染miR-125b-inhibitor后的hBMSCs,micro CT和组织切片染色其体内成骨能力强于阴性对照组。结论1.本实验所分离培养的hBMSCs增殖活跃,符合间充质干细胞的一般形态学特点。干细胞特性明显,经不同条件诱导,能向成骨、成脂以及成软骨细胞分化。纯度较高,干细胞来源稳定可靠。2.miR-125b能够负向调控hBMSCs成骨分化。3.miR-125b通过与靶基因BMPR1b的3’UTR部分碱基互补结合,从而抑制BMPR1b的表达。4.miR-125b通过抑制其靶基因BMPR1b的表达,进而抑制hBMSCs的成骨分化。5.复合hBMSCs的DBM骨移植材料,能够在体内较好地修复骨缺损。下调miR-125b的表达后,能够进一步提高h BMSC在体内的成骨能力。
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