与大豆SGF14l相互作用的MYB转录因子的鉴定及功能分析

论文摘要

大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）MYB转录因子家族作为一类重要的转录因子家族,在大豆的生长发育、代谢调节等诸多方面发挥着重要的作用。其中R2R3MYB转录因子作为植物中主要的MYB转录因子家族成员,广泛参与到植物胁迫响应、激素信号传导及调节植物株型等生命活动中。14-3-3蛋白广泛存在于真核生物中,其结构高度保守,主要与其靶标蛋白互作从而发挥功能。前人的研究指出,14-3-3蛋白可以通过与MYB转录因子发生相互作用,进一步发挥其功能。本研究在实验室前期工作的基础上,筛选得到与大豆SGF14l相互作用的MYB转录因子,并对其进行生物信息学分析及初步功能分析,主要研究结果如下:1.通过酵母双杂交实验,在候选的5个MYB转录因子基因中鉴定发现GmMYB81能够与SGF14l发生相互作用,而其他4个转录因子不能与SGF14l发生相互作用。并通过在烟草体内进行的双分子荧光互补实验,进一步验证了二者的互作关系,发现其互作发生在细胞核中。同时,研究发现GmMYB81不仅能够形成同源二聚体,还能与GmMYB176形成异源二聚体,并且这种异源二聚体也形成于细胞核内。2.通过对GmMYB81在大豆不同组织以及不同非生物胁迫、激素处理下的表达模式分析得知:对于各组织中的表达模式而言,GmMYB81在根瘤中的表达水平最高,在根以及花中的表达量较低;在不同时期的种子中,GmMYB81表达量随着种子的成熟而逐渐升高;在不同非生物胁迫处理下,GmMYB81对于盐处理的响应程度最为明显,表现为先小幅度下降后持续上升的趋势;而冷处理以及干旱处理的响应模式均表现为先上升后下降最后保持平稳。激素处理方面:对ABA、MeJA及SA的处理,均有一定响应但受SA诱导明显。3.在大豆中克隆长度为1512bp的GmMYB81启动子序列,通过PlantCARE网站对其序列所包含的顺式作用元件进行分析,发现在该启动子中存在着与光反应、干旱响应以及生长素响应等顺式作用元件;利用Gateway技术,将克隆得到的启动子片段构建至pMDC162载体上,并利用花浸法转化拟南芥,获得T2代后通过GUS染色对该启动子所驱动的GUS基因在不同组织、萌发过程以及甘露醇模拟干旱胁迫条件下的表达模式进行了分析。4.将GmMYB81在拟南芥中进行异源过表达,观察表型,发现GmMYB81过表达株系存在着植株整体株型小、分枝增多及顶端优势减弱的特征。并且抽薹时间较野生型晚,但抽薹时莲座叶数无明显差别,整体寿命较野生型更长。转录组测序结果显示差异基因主要集中在植物激素调节通路等方面,并且通过qRT-PCR验证发现AtSMXL8以及AtIAA29的表达量均有所下降,而15个WRKY转录因子的表达水平均发生了上调。5.对野生型和GmMYB81过表达株系分别进行盐胁迫、旱胁迫处理发现:GmMYB81过表达株系在盐胁迫条件下的萌发率和绿苗率均高于野生型,但其在幼苗期的根伸长率与野生型未存在明显差异,说明GmMYB81的过表达对于提高拟南芥在萌发阶段的耐盐性有明显的作用;在干旱胁迫条件下,转基因株系在种子萌发阶段同样具有更高的耐受性,即GmMYB81过表达提高了种子萌发阶段植物对干旱胁迫的耐受性。6.对AtWRKY28,AtWRKY53,AtWRKY60,AtWRKY70,AtSMXL8及AtIAA29这6个基因上游2000bp启动子区域序列进行分析,发现在这6个基因上游2000bp左右启动子区域内均包含MYB转录因子预测的结合位点,主要为MRE结合位点以及MBS结合位点。克隆得到包含MYB预测结合位点的6个基因启动子片段,并通过酵母单杂交实验进行检验,发现GmMYB81仅与WRKY28pro-1片段发生互作,初步说明GmMYB81可以直接结合于AtWRKY28的启动子区域。

论文目录

中文摘要

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第1章文献综述

1.1 植物14-3-3 蛋白研究进展

1.1.1 植物14-3-3 蛋白结构及其分类

1.1.2 植物14-3-3 蛋白功能

1.2 植物R2R3-MYB转录因子研究进展

1.2.1 植物R2R3-MYB转录因子结构及其分类

1.2.2 植物R2R3-MYB类转录因子的生物学功能

1.3 本研究的目的和意义

第2章与大豆14-3-3 蛋白SGF14l互作的MYB转录因子的筛选及分子鉴定

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株及载体

2.1.3 主要试剂

2.1.4 引物

2.2 试验方法

2.2.1 目的基因克隆及载体构建

2.2.2 酵母双杂交实验

2.2.3 双分子荧光互补实验

2.2.4 生物信息学分析

2.3 结果

2.3.1 MYB 转录因子基因克隆及酵母双杂交实验

2.3.2 通过BiFC进一步验证蛋白在植物体内的互作关系

2.3.3 生物信息学分析

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 GmMYB81 在大豆各组织中的表达及在非生物胁迫、激素处理下的表达模式分析

3.1 试验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 实时定量PCR引物

3.2 试验方法

3.2.1 大豆样品总RNA提取

3.2.2 反转录获得cDNA及实时定量体系

3.3 结果

3.3.1 Gm MYB81 在大豆各组织特异表达分析

3.3.2 Gm MYB81 在不同非生物胁迫下的表达模式分析

3.3.3 Gm MYB81 在不同激素处理下的表达模式分析

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 GmMYB81 基因启动子表达分析

4.1 试验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 菌株及载体

4.1.3 主要试剂

4.1.4 启动子片段克隆所需引物

4.2 试验方法

4.2.1 Gm MYB81 启动子序列分析

4.2.2 大豆基因组DNA提取（CTAB法）

4.2.3 Gm MYB81 启动子克隆及表达载体构建

4.2.4 拟南芥的遗传转化和转基因拟南芥的筛选

4.2.5 GUS染色

4.3 结果

4.3.1 大豆Gm MYB81 启动子克隆

4.3.2 转基因拟南芥的筛选及鉴定

4.3.3 Gm MYB81 启动子顺式作用元件以及GUS染色分析

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 GmMYB81 在拟南芥中的异源过表达分析

5.1 试验材料

5.1.1 植物材料

5.1.2 菌株及载体

5.1.3 主要试剂

5.2 试验方法

5.2.1 拟南芥的遗传转化和转基因拟南芥的筛选

5.2.2 叶片直接PCR鉴定转基因拟南芥

5.2.3 转基因拟南芥RNA鉴定

5.2.4 转基因植株表型分析

5.2.5 转录组测序

5.3 结果与分析

5.3.1 构建pEG101-GmMYB81 过表达载体

5.3.2 Gm MYB81 在拟南芥中的异源过表达

5.3.3 Gm MYB81 过表达影响WRKY家族基因的表达

5.4 讨论

5.5 小结

第6章 GmMYB81 在盐胁迫以及干旱胁迫下的功能分析

6.1 试验材料

6.1.1 植物材料

6.1.2 主要试剂

6.1.3 培养基配制

6.2 试验方法

6.2.1 盐胁迫条件下的种子萌发分析

6.2.2 盐胁迫条件下拟南芥根长变化分析

6.2.3 土壤盐胁迫条件下转基因拟南芥的表型分析

6.2.4 叶绿素含量测定

6.2.5 甘露醇模拟干旱胁迫条件下种子萌发分析

6.3 结果与分析

6.3.1 盐胁迫条件下的种子萌发分析

6.3.2 盐胁迫条件下拟南芥根长变化分析

6.3.3 土壤盐胁迫条件下转基因拟南芥的表型分析

6.3.4 甘露醇模拟干旱胁迫条件下种子萌发分析

6.4 讨论

6.5 小结

第7章酵母单杂交实验初步证明GmMYB81 能够直接作用于AtWRKY28 启动子区域

7.1 试验材料

7.1.1 植物材料

7.1.2 菌株及载体

7.1.3 主要试剂

7.1.4 引物

7.2 试验方法

7.2.1 启动子片段分析

7.2.2 启动子片段克隆及载体构建

7.2.3 酵母单杂交实验

7.3 结果

7.3.1 启动子片段中MYB结合位点分析

7.3.2 启动子部分片段克隆

7.3.3 载体构建

7.3.4 酵母单杂交实验

7.4 讨论

7.5 小结

第8章结论

参考文献

作者简介

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 金东昊

导师: 李绪彦

关键词: 大豆,蛋白,转录因子,功能分析

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 吉林大学

分类号: Q943.2

总页数: 108

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