张立成[1]2003年在《AEV结构蛋白基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达》文中进行了进一步梳理根据已发表的禽脑脊髓炎病毒1143株特异性结构蛋白VP0、VP1、VP3基因序列,分别设计叁对引物,利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在体外从AEVVan-Roekel株感染的SPF鸡胚胚脑和内脏器官组织中成功扩增出各结构基因片段。将其回收、纯化后,以VP0、VP1、VP3基因连接到线状克隆载体PMD18-Teasy Vector,转化JM109感受态细胞。在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,扩大培养,提取质粒,经酶切和PCR鉴定,取阳性质粒用Sangers双脱氧末端终止法对核酸序列进行测定,推算其氨基酸序列;并将其与已发表的AEV 1143株相关基因以及小RNA病毒科其它病毒属在对应位置的核苷酸和氨基酸的同源性进行比较、分析。 将VP0基因克隆到原核高效表达载体PET30α,构建重组表达质粒PET30α-VP0,转化PET30α表达宿主菌BL21;经IPTG和42℃升温诱导表达,收获菌体沉淀,经菌体全细胞裂解和提取包涵体后进行SDS-PAGE和Western-blot电泳分析表明,重组质粒能在大肠杆菌中获得表达,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体中。蛋白印迹试验检测表达蛋白分子量PET-VP0为52Ku;经薄层扫描测定,蛋白相对含量为26.3%。上述表达产物能与AEV阳性血清发生特异性反应。
刘丽华[2]2003年在《关于禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株基因组的研究》文中研究表明禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus,AEV)是一种小RNA病毒。侵害鸡的中枢神经系统和其它实质性器官，该病毒通过口-粪途径传播，具有水平和垂直传播的能力。由于它极大的稳定性，被污染的区域可能长期保持传染性。鸡胚适应株Van Roekel是高度嗜神经的，并且在鸡的肠道内不能有效的生长，而野毒株却是嗜肠道型的。尽管这样，野毒株和Van Roekel株的病毒多肽具有一致的抗原性。幼鸡感染该病毒后，引起麻痹、头颈震颤甚至共济失调，而成鸡常呈亚临床感染或导致产蛋量和孵化率下降。病毒的感染性不受氯仿、低pH、胃蛋白酶、胰酶和脱氧核糖核酸酶的影响，镁离子可增强病毒对热的稳定性，病毒的浮密度为1.31g／ml，直径为22-30nm，该病毒主要在鸡胚中增殖，在大多数细胞培养物中不生长。 1932年Jones首次报道了在1930年美国新英格兰地区幼鸡群爆发的禽脑脊髓炎。随后十年中，在欧洲、加拿大、日本和澳大利亚都有此病的报道。八十年代，该病传入我国。AEV一直被认为是最重要的禽病病原之一，尽管它很重要，但有关其基础生物学，发病机理的了解却较少。本项研究，旨在利用分子生物学的技术手段，搞清楚AEV基因组的序列和结构，从而探讨基因结构与功能的关系。 本研究共分四个部分：第一部分为AEV的增殖，纯化和电镜观察，用1:5倍稀释的AEV-NH937株和阴性对照PBS分别经卵黄囊接种于6dSPF鸡胚，继续孵化10d后，收集尿囊液。比较接种组和健康对照组鸡胚的大小，结果显示，健康对照组鸡胚明显大于接种组。分离、提纯AEV，把纯化的病毒在电镜下观察，证明确有大量AEV病毒粒子存在，说明AEV在鸡胚中成功扩增；第二部分是AEV-NH937基因组的序列测定工作。根据Calnek疫苗株序列设计了9对引物，利用反转录聚合酶链式反应，成功地扩增了AEV-NH937毒株的全基因。把它们分段克隆在pUCm-T载体上，经序列分析，获得了AEV-NH937毒株的基因组全序列及推导的氨基酸序列，基因组全长为7055个核苷酸，与calnek疫苗株具有94.3％的同源性，编码一个含2134个氨基酸的多聚蛋白。这是国内首次对AEV基因组全序列的分析；第叁部分：AEV外壳蛋白VP_1基因在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性研究。将VP_1基因编码区的810bp片段插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒，然后转化大肠杆菌BL_(21)，经IPTG诱导后，用聚丙稀酰氨凝被电泳分析。结果表明，表达产物为53KD的融合蛋白。经超声波裂解，用尿素溶解包涵体，电泳纯化后，利用ELISA检测VP_1 外壳蛋白，表明具有一定抗原性；第四部分：应用原位杂交检测 AEV i用 D i g 标记的探针与sd、10d、20d的攻毒鸡脑组织杂交，来检测那V的RNA。结果 显示，sd、10d、20d的攻毒脑组织切片均有阳性杂交信号，阴性对照却没有 杂交信号，该方法与其它检测方法具有良好的平行关系。
郝华芳[3]2012年在《禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立》文中研究说明禽脑脊髓炎(avian encephalomyelitis， AE)是由禽脑脊髓炎病毒（avianencephalomyelitis virus，AEV）引起的以侵害雏鸡中枢神经系统为主的传染病。该病于1930年在美国首次发现，20世纪80年代初传至我国，随后在广东、河南、河北、内蒙古等地造成流行。陕西省自1997年报道AE以来，近年来疫情有上升的趋势。AE主要引起雏鸡发生运动失调和头颈部的快速震颤等症状，病死率为10%~70%；产蛋鸡感染后主要表现为产蛋突然下降，降幅为16%~43%，给养禽业造成了很大危害。市场上出售IDEXX公司的AEV抗体检测试剂盒，其价格昂贵，不适合我国基层的大批量检测；国内虽有研究但没有商品化试剂盒在市场上供应。因此寻求特异性强、灵敏度高、简单快速、适合于大批样品检测的方法势在必行。本研究从临床疑似AE的发病鸡群中分离到一株禽脑脊髓炎病毒（YL株），对AEV陕西分离株SX和YL株的VP1基因进行了克隆与分析，对SX株的VP1蛋白进行表达，以纯化的蛋白作为抗原初步建立了AEV抗体的ELISA检测方法。主要获得以下结果：1.从陕西杨凌地区的临床疑似禽脑脊髓炎的发病鸡群中分离到1株病毒，通过琼脂扩散试验、人工感染试验等鉴定，初步判定所分离的病毒株（YL）为禽脑脊髓炎病毒。根据GenBank中发表的AEV VP1基因序列，设计合成1对特异性引物，采用RT-PCR方法扩增AEV SX株和YL株的VP1基因，将其克隆到pMD18-T载体上，进行序列测定，然后与已知的AEV毒株序列进行比较，应用DNAStar生物软件对其进行分析。结果表明，AEV SX株和YL株的VP1基因全长均为810bp，编码270个氨基酸残基；两毒株与参考毒株VP1基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为88.5%~99.8%和89.3%~99.4%，两毒株仅存在部分碱基的突变，没有缺失和插入；系统进化树结果表明SX株、YL株均与1143、L2Z参考毒株的亲缘关系较近，与VR株、HB株、SD株和NH937株亲缘关系较远。2.将AEV SX株的VP1基因经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，连接到原核表达载体pET-32a(+)上，构建原核表达质粒pET32a-VP1，将其转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，用IPTG诱导表达，优化表达条件，经His亲和层析柱纯化。酶切鉴定及基因测序结果表明VP1基因成功连入表达载体中；VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达，确定的pET32a-VP1最佳诱导温度为37℃，最佳的IPTG诱导浓度为0.1mmol/L，最佳诱导时间是5h，SDS-PAGE结果可见分子量约为50ku的融合蛋白。Western blot结果分析，融合蛋白能够和AEV阳性血清发生特异的反应，且具有很好的反应原性。按确定好的条件大量诱导重组蛋白，经His亲和层析柱纯化得到380μg/mL的目的蛋白。3.以纯化的VP1融合蛋白作为抗原包被ELISA酶标板，建立AEV抗体的间接ELISA检测方法，并对反应的条件进行优化。结果通过筛选确定的最优ELISA工作条件为：重组抗原的包被浓度3.8μg/mL，37℃2h后4℃过夜包被，封闭液选择1%的BSA，封闭条件为37℃2h，待检血清的稀释倍数为1:50，37℃孵育0.5h，酶标抗体的最佳稀释倍数为1:4000，最佳工作条件为37℃作用30min，底物的显色选择为37℃5min。在此基础上对24份阴性血清进行测定，确定的临界值为0.360；建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高；临床检测180份样品，与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率达到91.9%。该方法可用于临床样品的大批量检测。综上所述，AEV SX株、YL株的VP1基因均与1143株、L2Z株的亲缘关系较近，与其他已知毒株亲缘关系较远，表明SX株、YL株与已知AEV毒株在进化方面存在一定程度的差异；AEV SX株VP1基因在原核表达系统中获得了高效表达，产物为50ku的可溶性融合蛋白，表达蛋白具有很好的反应活性；将纯化的蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好，适用于临床样品的大批量检测。
鞠美芳[4]2012年在《狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区原核表达及单克隆抗体的制备》文中指出狂犬病又称恐水病，是急性、烈性、自然疫源性人兽共患传染病，其病原体是狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)。目前狂犬病仍然在世界多个国家和地区广泛流行，主要发生在亚洲和非洲的一些发展中国家，我国也是狂犬病的高发区，连续8年狂犬病人报告病死数一直居我国37种法定报告传染病之首。单克隆抗体的诊断方法灵敏性高、特异性强、操作简单、价格低廉，所以在临床上很多疾病的检测和治疗中得到广泛应用。本研究利用单克隆抗体制备技术，以狂犬病毒aG株为研究材料，通过基因克隆、序列分析、密码子优化、原核表达、蛋白纯化以及单克隆抗体的制备，为建立检测狂犬病毒抗原和抗体的ELISA检测试剂盒奠定基础。本文首先从狂犬病毒aG株组织毒中成功克隆出糖蛋白膜外区片段，测序结果显示糖蛋白膜外区长1317bp，编码440个氨基酸。测序结果用NCBI中的blast软件比对分析，与GenBank中4aG株、PG株、中国疫苗株、334株的核苷酸序列相似性在99%以上，与国际标准攻毒株（CVS）的核苷酸序列相似性为93%，与日本犬用疫苗株Nishigahara株的核苷酸序列相似性为97%。由于外源基因在大肠杆菌中表达时，可能含有大肠杆菌的转录终止信号，所以本研究用稀有密码子计算器（RACC）分析目的片段，将序列中39组大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子，然后合成基因并与原核表达载体pET-28a(+)连接，转化到表达菌Rosseta（DE3）后进行IPTG诱导表达。研究表明，重组菌在30℃IPTG终浓度为0.6mM，诱导6h后，重组蛋白表达量最多。Western boltting检测证明表达产物具有较好的反应原性。用默克公司的His·Tag蛋白亲和层析纯化重组蛋白。间接ELISA法确定了检测犬RV抗体的抗原最佳包被量是1.725μg/mL，血清的最佳稀释度为1:200，HRP标记的二抗的稀释度为1:50000。将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂乳化，免疫Balb/c小鼠3次，然后用重组蛋白加强免疫1次，取免疫小白鼠的脾细胞与sp2/0细胞融合后经过叁次亚克隆和间接ELISA实验进行筛选，最终获得两株稳定分泌阳性单抗的杂交瘤细胞株(4B7和1F10）。ELISA实验证明，2株杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型分别为lgG2b和IgM；杂交瘤细胞的染色体数目分别约为95和103条；纯化后腹水效价均为1：25600；McAb特异性良好，有较高的稳定性；为后续RV抗原检测试剂盒的研发做好铺垫。
王秋娟[5]2006年在《禽脑脊髓炎病毒VP1基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备》文中研究指明禽脑脊髓炎(Avian encephalomyelitis, AE)是一种由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的以侵害幼禽中枢神经系统为主要特征的接触性传染病,以病禽共济失调、震颤和非化脓性脑脊髓炎为主要特征,鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑均可感染。1930年首先在美国发现该病,现已遍及世界大多数国家。我国自1980年以来,先后在广东、江苏、辽宁、黑龙江、河北、内蒙古、福建、上海等省市区发生,对养禽业造成很大危害。禽脑脊髓炎病毒(AEV)的培养较为困难,从而影响了对该病的深入研究。目前一般都采用免疫学方法,如免疫荧光( IFA )和酶联免疫吸附法( ELISA )来直接检测抗原,但费时费力;国外也有用AEV单克隆抗体建立的免疫组化、间接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色等方法检测AEV抗原的成功报道。本研究的目的是运用基因工程技术克隆出AEV结构蛋白VP1基因,并以重组蛋白为抗原制备特异性抗体,为快速大量制备AE的检测抗原提供了条件,也为建立快速诊断和检测AEV的特异性方法奠定了基础。为此,主要有如下工作:1. AEV结构蛋白VP1基因的克隆和原核表达以初步纯化的AEV VR株提取的RNA为模板,根据已发表的AEV 1143株结
王艳娇[6]2017年在《柑橘脉突病毒侵染性克隆构建及其基因沉默抑制子鉴定》文中研究表明柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV)是黄矮病毒科(Luteoviridae)豌豆耳突花叶病毒属(Enamovirus)的一种正义单链RNA病毒,引起柑橘脉突病及木瘤病。目前,CVEV在西班牙、南非、澳大利亚、巴西、印度、美国、秘鲁和土耳其等多个国家均有发生,在我国主要分布于浙江黄岩地区。由于该病毒能由多种蚜虫传播,因而具有一定的传播流行风险。为保障我国柑橘产业安全,本研究在建立CVEV实时荧光定量RT-PCR检测方法的基础上,构建CVEV全长cDNA克隆,分析其侵染性,并开展了CVEV基因沉默抑制子的鉴定,以期为CVEV的流行监控、分子生物学及致病机理研究奠定基础。所取得的主要研究结果如下:1.CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立本研究通过设计特异性引物(EVqF4/EVqR4),优化反应条件,建立了CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;灵敏度较高(为常规RT-PCR的100倍);标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率为101.8%;检测组间和组内变异系数均不超过2.85%,重复性较好,适用于检测田间样品。2.CVEV在代代酸橙植株中的时空分布应用所建立的实时荧光定量RT-PCR检测体系对CVEV在代代酸橙中的时空分布进行检测。结果表明,CVEV在代代酸橙根中,无论春季、夏季或者秋季,其含量相对于其它部位最高,其次是嫩皮;另外,嫩叶、嫩皮和老皮中CVEV含量在春季最高,春、夏、秋依次减少。3.构建CVEV全长cDNA克隆及其序列分析本研究建立了CVEV全基因组一步法RT-PCR扩增体系,并成功获得其全长cDNA克隆36个。序列比对结果显示,本研究所获CVEV全长基因组序列(命名为CVEV-XSH)与已报道的VE-1分离株基因组序列相似度最高,为98.61%;与豌豆耳突花叶病毒-1(Pea enation mosaic virus-1,PEMV-1)和紫花苜蓿耳突病毒(Alfalfa enamovirus-1,AEV)曼菲蒂分离株序列进行比对,其一致性分别为90.46%和90.26%,表明CVEV-XSH基因序列相对保守。根据全基因组序列构建的进化树显示,CVEV-XSH与VE-1、PEMV-1、AEV曼菲蒂分离株聚为一簇,与序列相似性分析结果一致。4.CVEV全长cDNA克隆侵染性分析采用农杆菌介导的本生烟接种法,对获得的36个CVEV全长cDNA克隆进行了侵染实验。生物学观察以及分子检测结果显示未获得侵染性克隆。为此,本研究进一步设计实验,旨在发掘影响其侵染性的因素。首先,利用5'Race技术获得末端序列,并对其变异情况进行分析;结果显示,CVEV 5'端序列保守性极高,未发现变异存在。其次,采用与CVEV全长cDNA克隆相同的方法构建PVX全长cDNA克隆,成功获得PVX全长cDNA侵染性克隆,说明本研究所用双元表达载体pXT1以及构建方法均有效。第叁,为避免重组质粒在大肠杆菌中存在不稳定现象而造成侵染失败问题,本研究将CVEV全长基因PCR产物与表达载体pXT1连接后,直接转化农杆菌初步得到4个阳性克隆,接种后经分子检测仍未筛选出侵染性克隆。第四,筛选其它草本寄主,即采用毒源叶片汁液摩擦接种豌豆、蚕豆、芸豆、昆诺藜等草本植株,结果显示均未表现出侵染性。综上表明,CVEV全长cDNA克隆侵染失败并非5'末端序列变异、表达载体以及构建方法所致,而针对重组质粒在大肠杆菌中不稳定以及寄主影响,或者其它原因造成的侵染失败,还需进一步分析探究。5.CVEV基因沉默抑制子的初步鉴定本研究在克隆CVEV 5个开放阅读框(Open reading frame,ORF)编码基因的基础上,构建其重组双元表达载体,并利用农杆菌介导的病毒微型复制子(p35miniBYV-eGFP)共浸润鉴定法开展了沉默抑制子鉴定试验。结果显示:CP表达载体共注射本生烟植株各重复均出现绿色荧光,其荧光强度较负对照强,但与正对照HC-Pro相比较弱,说明CP具有一定的基因沉默抑制作用。其它ORF表达载体共注射植株与负对照相比无明显差异;进一步经实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,CP表达载体共注射本生烟叶片中GFP相对表达量高于负对照1倍左右,低于正对照,其它基因与负对照相比表达差异不大,CP可初步认定为弱抑制子。
陈学昭[7]2016年在《松江鲈(Trachdermus fasciatus)肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和Hepcidin基因旳克隆、表达和功能分析》文中指出松江鲈(Trachidermus fasciatus)是一种降海洄游性鱼类,被列为国家Ⅱ级保护动物。为恢复其自然种群,人工养殖目前已成为必然趋势,但养殖过程中日益频发的病害问题成为松江鲈养殖所面临的一大难题。为了寻求预防松江鲈疾病的有效手段,本实验室致力于松江鲈免疫相关基因的研究。肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)是磷酸原激酶家族中的一员,主要功能是催化肌酸与ATP之间高能磷酸键的可逆性转移,为肌肉收缩和其他生命活动提供能量来源。有研究发现,文昌鱼CK具有抗菌活性,在文昌鱼固有免疫中发挥一定的作用。Hepcidin是一类由肝脏分泌的肽类激素,是抗菌肽家族中的一员,在抗菌方面发挥着重要的作用,同时Hepcidin也是铁离子代谢的主要调节者。为了深入了解这两个基因,本实验对松江鲈CK和Hepcidin基因的部分免疫学功能进行了研究。实验通过RACE技术克隆获得了两种基因的cDNA全长,并分别命名为TfM-CK和Tf-Hepcidin;利用荧光实时定量PCR技术分析其在mRNA水平上的组织分布,以及病原体刺激后的免疫相关组织的表达模式变化；同时构建真核、原核表达载体,获得重组蛋白,并对其活性和功能进行体外和体内的检测。1.经体内、体外实验证明肌酸激酶(CK)可能作为免疫因子参与松江鲈的固有免疫TfM-CK的cDNA序列全长为1474 bp,开放阅读框(ORF)为1146 bp,编码381个氨基酸,SMART结构域预测表明,TfM-CK包含两个结构域,一个是N.端的ATP-gua_PtransN结构域,一个是C端ATP-gua_Ptrans结构域。系统发育树结果表明,所有的鱼类M-CK聚为—大支,其他脊椎动物的M-CK聚为一大支, TfM-CK与蚰形目的无备平鲇(Sebastes inermis)的M-CK关系最近=qRT-PCR结果显示,TfM-CK广泛表达于松江鲈各个组织,但存在一定的组织差异性,其中在肌肉中表达量最高,血液次之。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后,松江鲈的皮肤、头肾、肌肉和脾脏中的TfM-CK均上调表达。TfM-CK聚糖(Peptidoglycans, PGN)、脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)和脂磷壁酸(Lipoteichoic acid, LTA)叁种糖结合、凝集多种细菌、一定程度上抑制巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的生长,且在鲤鱼(Cyprinus carpio)致死实验中鲤鱼的死亡率降低了65%。2.实验证明Hepcidin作为一种抗菌肽既可以作为效应子又可以作为模式识别受体发挥作用Tf-Hepcidin的cDNA序列全长为988 bp,开放阅读框(ORF)为273 bp,编码90个氨基酸。信号肽预测表明从1-24位氨基酸为信号肽,25-64位氨基酸为前肽,65-90位氨基酸为最终的成熟肽,且成熟肽蛋白中有8个保守的半胱氨酸残基。系统发育树结果表明所有的鱼类Tf-Hepcidin聚为一大支,其他脊椎动物的Tf-Hepcidin聚为一大支, Tf-Hepcidin与鲈形目的舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)的Hepcidin关系最近。qRT-PCR结果显示,Tf-Hepcidin广泛表达于松江鲈各组织中,在肝脏中的表达量最高,而在其他组织中表达量都较低。LPS和重金属刺激后松江鲈的肝脏、皮肤、鳃、脾脏、血和脑组织中的Tf-Hepcidin表达量均上调。管碟法抑菌实验表明,Tf-Hepcidin可以抑制大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌的生长。Tf-Hepcidin可以和PGN、LPS和LTA叁种糖结合,且可以抑制和凝集多种细菌,且在鲤鱼致死实验中鲤鱼的死亡率降低了70%。因此,我们推测TfM-CK和Tf-Hepcidin在松江鲈体内可能作为模式识别受体(Pattern recognition receptor, PRR)和效应子参与机体免疫反应。
周鹏[8]2009年在《若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达》文中提出以大黄鱼(Larimichthys crocea)性腺为材料,采用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术和DSN (duplex-specific nuclease)处理构建了大黄鱼性腺线性化cDNA文库,并从文库中随机挑取了3961个克隆进行测序,共获得3535条高质量的表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)。序列经聚类分析后共得到2916条Unigene,包括415条contigs和2501条singletons。初步分析结果表明：该线性化文库的库容为4.3×106pfu/mL,文库重组率达95.8%,EST的非冗余率为82.49%, Unigene的平均长度为355 bp。经生物信息学分析,1785个为已知基因占总ESTs的61.21%；其中与性腺发育相关的基因66个,占已知基因的3.70%。微卫星分析发现共有129条EST序列含有149个微卫星重复序列,包括6条与性腺发育相关的ESTs。利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术分析了11个与性腺发育相关基因在大黄鱼性腺的表达情况。结果显示精巢特异性LRR基因(testis-specific LRR)只在大黄鱼精巢中表达(P<0.05)；雄性特异性致死3样1基因(MSL3L1),雄激素相互作用受体核蛋白激酶基因(ARINPK),精子发生凋亡相关蛋白基因(SARP),热休克蛋白70(HSP70)和细胞周期蛋白A1基因(cyclin A1)在精巢中的表达量高于卵巢(P<0.05)；相反,组织蛋白酶C基因(Cathepsin C),核自身抗原精蛋白基因(NASP)和细胞周期蛋白B1 (cycli B1)在卵巢中的表达量高于精巢(P<0.05)；促分裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)和泛素C末端水解酶L5 (UCH-L5)在精巢和卵巢中表达没有显着差异(P>0.05)。在上述结果的基础上,利用SMART-RACE技术或RT-PCR技术克隆了大黄鱼性腺发育相关基因cyp19a、cyp19b、cyclin B1、CDC2、UBE2D和UBC9全长cDNA序列,其长度分别为1805 bp、2268 bp、1882 bp、1151 bp、798 bp和846 bp,可分别编码518、500、397、303、147和148个氨基酸的前体蛋白。利用qRT-PCR技术分析这些基因在大黄鱼各器官的表达情况,结果显示：cyp19a在卵巢中的表达量显着高于精巢(P<0.01),且cyp19a在精巢和卵巢中的表达均极显着高于其它各器官(P<0.01); cyp19b在端脑、中脑、下丘脑、脾和肝有较高表达量,在雄性大黄鱼的血中表达量最高。在性腺表达量极低。cyclin B1和CDC2基因在性腺中的表达量极显着高于其它各器官(P<0.01),且在卵巢中的表达量较精巢高(P<0.05)。UBE2D在脾脏和性腺中表达量较高,其它器官表达量较低,在性腺中的表达极显着高于其它各器官(除脾脏外)(P<0.01)。UBC9在性腺中表达量较高,且极显着高于其它各器官(P<0.01)。
毛娅卿[9]2014年在《禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析》文中研究说明禽白血病(Avian leukosis)是制约养禽业发展的主要禽类传染病,以垂直传播为主,免疫污染禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)的活疫苗也是引发该病的重要原因之一。目前主要通过定期对鸡群进行ALV血清学监测,采取淘汰净化的方法控制该病。我国开展ALV血清学监测通常使用美国IDEXX等公司的检测试剂盒,检测成本高、推广范围窄。因此,研究开发具有自主知识产权的ALV检测试剂盒,降低ALV检测成本,扩大鸡群检测范围,对我国防控本病有重要的实际应用意义。另外,ALV-J在临床上自报道以来一直处于不断的变异中,当前尚无确切证据证明ALV-J在我国鸡群中致病作用有多样性的机制,而病毒准种的多样性很有可能是ALV-J致病作用多样性的机制之一。因此,开展ALV准种研究对于从分子水平上解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性具有重要的理论意义。本研究通过原核表达ALV p27蛋白,制备抗p27蛋白多克隆抗体,建立了ALV抗原ELISA检测方法和ALV抗体ELISA检测方法。试验结果表明,建立的两种检测方法与禽常见传染病病毒或其阳性血清、大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性；两种方法的批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,具有良好的可重复性；ALV抗原ELISA检测方法与IDEXX公司的ALV抗原检测试剂盒敏感性相当,符合率达到98.9%；ALV抗体ELISA检测方法比IDEXX公司的ALVA/B和J亚群抗体检测试剂盒相对于间接免疫荧光试验(IFA)有更高的符合率。利用本研究建立的抗原ELISA检测方法对918批不同疫苗进行了ALV检测,结果检测出63批外源性ALV污染疫苗。从2006年-2009年间污染的FPV. NDV和IBDV活疫苗中分别分离和鉴定到叁株ALV,并对这叁株ALV进行全基因组序列测定与分析。结果显示,叁株ALV的gp85氨基酸序列与A亚群ALV参考毒株的gp85氨基酸序列同源性最高,为88.3%-97.7%,并且他们的全基因组整体同源性均较高；叁株ALV与2009年分离自海兰褐祖代鸡的A亚群ALV中国分离株SDAU09C3同源性最高,显示它们很可能有共同的来源,也说明疫苗ALV污染是导致临床上鸡群发病的原因之一。从山东省某地方品系鸡疑似白血病发病鸡群分离到自然感染的血管瘤型ALV-J,并采用本研究建立的ALV抗原／抗体ELISA检测方法进行了抗原和抗体验证,同时选取LY1201株对其env基因进行了比较分析。结果证明ALV-J单一病毒株中存在差异极大的不同准种,发现gp85在氨基酸位点210-219发生10个连续的氨基酸缺失的准种,该缺失在此前我国ALV-J野毒株中均未发现,该研究说明可通过gp85序列测定进行ALV准种分析研究。在此基础上,将ALV-J LY1201株在DF-1细胞上连传3代后,扩增其gp85基因并对其20个阳性克隆子进行测序和准种分析,结果发现在20个克隆中gp85缺失的突变准种已经完全消失,原来的优势准种比例由33.3%上升为85.0%成为绝对优势准种。这表明ALV-J在适应细胞复制过程中病毒的准种组成是不断变化的,且发生突变的准种只有其复制能力高于原优势准种才可能具备竞争性优势。综上所述,本研究建立的ALV抗原/抗体ELISA检测方法,可用于ALV病毒检测和血清学监测,对于控制我国禽用病毒类活疫苗质量,加强禽白血病防控和净化具有重要的意义。目前本研究建立的ALV抗原ELISA检测方法已作为国家标准用于禽用病毒类活疫茁外源病毒检验。从禽用病毒类活疫苗中分离到污染的ALV,提示加强疫苗中ALV等外源病毒监测的重要性。同时,本研究建立的ALV-J准种分析方法,对于解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性提供了理论与技术支持。
张俊芳[10]2013年在《香蕉果皮带毛突变相关基因的分离和功能研究》文中提出香蕉是世界重要的热带水果,因其多为叁倍体,长期以来,香蕉育种多以筛选突变体为主,然而,人们对香蕉自发突变的分子机理知之甚少。研究突变机理,可以更好的了解突变的规律,为更好的利用突变进行有效的育种提供指导。香蕉果皮带毛突变体由“巴西”香蕉突变而来,其花梗、果实、雄花苞片等部位均表现有毛特征,花期提前。本研究以香蕉果皮带毛突变体为试材,构建突变体／野生型SSH库,筛选与突变有关的候选基因,同时,进一步优化香蕉遗传转化条件,为更好的验证香蕉基因功能奠定基础。主要研究结果如下：利用抑制性差减杂交(SSH)技术,分别以香蕉果皮带毛突变体和野生型为"tester"和‘'driver",构建正反双向两个差减cDNA文库,共获得591个基因片段,其中来自正向文库的325个,来自反向文库的266个。所得序列经BLAST比对分析结果显示：正向文库中206条序列与NCBI数据库中已知功能基因有较高同源性,7条序列与未知功能基因具有同源性,112条序列未能找到同源基因；反向文库中238条序列与NCBI数据库已知功能基因有较高同源性,9条序列与未知功能基因具有同源性,19条序列未能找到同源基因。通过gene ontology (GO)功能推测及归类,可将这些基因分为21亚类。根据前人关于植物表皮毛发育调控的研究结果和差减cDNA文库中筛选到的基因的功能推测,本研究选取4组22个可能与表皮毛发育相关的基因,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法分析它们在野生型与突变体中的表达差异及在果实表皮毛发育过程中的表达变化。4组基因如下：(1)3个可能的关键转录因子：①MYB在表皮毛快速发育过程中,野生型中的表达量明显高于突变体中；②WD40在表皮毛发育的初始阶段在突变体中的表达量较高；③B-ZIP在表皮毛发育的成熟期及后期在突变体中的表达量稍高；(2)9个与激素信号相关的基因：①ARP(auxin repressed protein)在表皮毛快速生长期,突变体中表达量高于野生型；②ILR (IAA-amino acid hydrolase ILRl)在果实表皮毛发育过程中表现为折线状,虽然在两种表型中的趋势一致,但在表达量上还有一定差异：③2个ABAR(abscisic acid8'-hydroxylase)表达模式不同,编号M49在突变体和野生型中的表达差异不大,M286在表皮毛发育初期在野生型中的表达明显高于突变体；④4个ARF (auxin response factor)表达趋势各异,但总体表现为在表皮毛快速生长期,野生型中的表达高于突变体；⑤P2/ERF在野生型中的表达量始终高于突变体；(3)4个MAPK基因中,其中1个片段表现为表皮毛发育期在野生型中的表达量较高,另外3个在表皮毛发育期在两种表型差异不大；(4)与细胞分裂有关的6个基因,在两种表型中的变化趋势大体相同,基本上表现为随着果实及其表皮毛的发育表达量逐渐降低。可见,突变引起一系列基因的表达出现变化。MaERF基因在果实表皮毛发育过程中,在野生型中的表达量始终大于在突变体中的表达量。为了深入了解其功能,通过RACE技术获得其cDNA全长,对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,认为该基因属于ERF亚家族的B2亚群,含有一个AP2/ERF保守结构域,多个亲水区和疏水区,但无跨膜结构,为非分泌蛋白：MaERF基因在基因组中低拷贝存在,含有一个内含子。RT-PCR分析表明,MaERF在香蕉各组织中均有表达,在生殖器官中的表达量较高。MaERF在拟南芥中的超表达研究显示,转基因植株表型没有明显变化,可能与表皮毛发育关系不大。MaMYB基因在突变体和野生型香蕉果皮中表达也有明显差异,通过RACE技术获得其cDNA全长,对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,认为该基因属于R2R3MYB基因亚族,含有两个保守结构域,多个亲水区和疏水区,但无跨膜结构,为非分泌蛋白；MaMYB基因在基因组中低拷贝存在,含有一个内含子。RT-PCR分析表明,MaMYB在香蕉各组织中均有表达,其中在生殖器官中的表达量较高。MaMYB基因在拟南芥中的超表达研究显示,转基因植株叶片表皮毛减少,花器官表皮毛缺失,根系加长,果夹较野生型短,表明MaMYB可能参与了调控果皮表皮毛的发育,同时还可能与果实发育有关。为了更好的利用功能基因进行香蕉生物技术育种,对“巴西”香蕉胚性悬浮细胞遗传转化体系进行了优化,结果表明悬浮细胞对卡那霉素有一定抗性,适合作为筛选剂的抗生素为潮霉素和除草剂(Basta),浓度分别为10mg/L和5mg/L；悬浮细胞每2周继代一次,以继代5-6d的悬浮细胞为试材,以bar基因为筛选标记,悬浮细胞与菌液共培养6h后直接进行筛选培养,再生植株的转化率较高,可达到75%,阳性植株抗除草剂能力明显提高。
参考文献：
[1]. AEV结构蛋白基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达[D]. 张立成. 西北农林科技大学. 2003
[2]. 关于禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株基因组的研究[D]. 刘丽华. 内蒙古农业大学. 2003
[3]. 禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立[D]. 郝华芳. 西北农林科技大学. 2012
[4]. 狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区原核表达及单克隆抗体的制备[D]. 鞠美芳. 中国农业科学院. 2012
[5]. 禽脑脊髓炎病毒VP1基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备[D]. 王秋娟. 扬州大学. 2006
[6]. 柑橘脉突病毒侵染性克隆构建及其基因沉默抑制子鉴定[D]. 王艳娇. 西南大学. 2017
[7]. 松江鲈(Trachdermus fasciatus)肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和Hepcidin基因旳克隆、表达和功能分析[D]. 陈学昭. 山东大学. 2016
[8]. 若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达[D]. 周鹏. 集美大学. 2009
[9]. 禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析[D]. 毛娅卿. 中国农业大学. 2014
[10]. 香蕉果皮带毛突变相关基因的分离和功能研究[D]. 张俊芳. 海南大学. 2013
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