刘信力[1]2007年在《烟碱样乙酰胆碱受体门控机制的动力学研究》文中进行了进一步梳理自从20世纪70年代,分子动力学模拟首次在蛋白质分子应用以来,尤其在生物科学领域变得越来越普遍。它提供了一种用计算机在原子水平上动态地研究分子内和分子间反应的途径。直到今天,不仅是模拟体系的规模一直在快速增长,而且分子动力学方法本身也一直在发展。例如,拉伸分子动力学(steered molecular dynamics,SMD)作为分子动力学的一个分支,20世纪90年代以来在研究配体的结合/解离过程中起到了重要的作用。在本文中共有叁部分的工作。首先,用长时间(30纳秒)的常规分子动力学模拟了探索烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)的门控机制,并且我们发展了一种新的方法——拉伸转动分子动力学(steered rotation moleculardynamics,SRMD),来模拟在生理时程里发生的运动。接着,为了进一步研究在上面工作中揭示的烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)的细胞外结构区域转动的成因,我们使用自己设计的叁个拉伸模型,分别使用拉伸分子动力学在可以作为烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)的细胞外结构区域的唯一替代物的乙酰胆碱结合蛋白(acetylcholine bindingprotein,AChBP)上模拟研究。最后,我们提出了一种改进的拉伸分子动力学方法,并应用在解离细胞色素P450 3A4-甲吡酮的复合物上,比较结果显示优于传统的拉伸分子动力学方法。论文由五个部分组成,概述如下:第一章概述了分子动力学理论和配体门控离子通道(ligand-gated ion channel)的发展现状和基本概念。此外,也简要地陈述了本文的主要工作和发现。第二章作为预备知识,介绍了分子动力学的理论和应用。首先是回顾了分子动力学的简史,并提到了牛顿方程、原子间势函数和有限差分算法。拉伸分子动力学和自由能对计算也包括在这一章中。接着总结了使用和发展分子动力学的原因,并且对力场和算法的进展都做了介绍。在这一章的最后部分,回顾了在生物科学领域内分子动力学已取得的成果,并展望了在生物大分子模拟中分子动力学的前景。烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)是在中枢神经系统和外围突触中信号传导的关键分子。虽然已经对它做了大量计算研究和实验研究,但是仍然不清楚它在门控机制下的结构的动态变化。在第叁章中我们对嵌入在磷脂双层分子和水分子的烟碱样乙酰胆碱受体,使用了常规分子动力学模拟和拉伸转动分子动力学模拟,来研究它的门控的力学基础。为了模仿乙酰胆碱(ACh)的推动作用,我们提出并使用了一种非平衡的分子动力学模拟——拉伸转动分子动力学。结果不仅证实了由30纳秒的常规分子动力学和正态模式分析所得到的运动,还显示出通道可能经历着一种张开—闭合的运动。分子动力学模拟不仅探究了在门控过程中受体的结构的动态变化,而且在原子水平上对乙酰胆碱受体的门控机制提供了新的观察。配体的结合/解离过程对于理解烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)和乙酰胆碱结合蛋白(AChBP)的药理学作用都很重要。在第四章中,拉伸分子动力学模拟来提供了了解激动剂尼古丁分子的解离过程。叁个不同的拉伸模型——径向、切向和混合模型,被设计用来寻找可能的解离途径。在这叁个模型中,切向拉伸模型最终也没使尼古丁从配体结合口袋中解离。混合拉伸模型比起切向拉伸模型,拉伸作用力的效率高,C-loop的张开程度小。对于类胆碱的激动剂尼古丁来说,进入或离开结合口袋的最合适的途径就是沿一条曲线的轨迹穿过主结合侧面。需要指出的是,已经观察到了尼古丁的解离伴随着蛋白-配体的复合物的一种整体转动,这可能由配体和蛋白在切向上相互作用引起的。第五章是本文最后一章。在这一章中,一种带有拉伸方向优化的拉伸分子动力学方法被用来从受体中解离配体小分子。使用基于信息熵的多种群遗传算法来搜索最优的拉伸方向。通过在传统的拉伸分子动力学模拟中加入一个优化阶段,对于深埋的活性位点可以得到一个更好的底物出口通道。新方法应用在细胞色素P450 3A4-甲吡酮的复合物的解离上,结果显示比传统的方法,得到的通道具有更低的能垒、需要更少的解离时间和更短的运动轨迹;甚至对于传统方法不能解离的拉伸方向,新方法通过优化和调整也可以找到一个合理的出口。
潘志远[2]2014年在《胆碱和阿司匹林协同抗炎作用及其药理学机制的研究》文中认为关节炎、脓毒症、溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化等一系列慢性进展性炎性疾病严重威胁人类健康。随着世界人口老龄化等问题的凸显，此类顽固性疾病的发病率也逐年升高，形势非常严峻，这已经成为非常令人关注的公共卫生问题之一。由于炎症反应涉及众多细胞因子和炎症介质的参与，目前针对此类疾病的治疗仍然是一个非常棘手的问题。非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs）由于具有确切的镇痛抗炎作用，一直是各国推荐用于治疗关节炎的一线用药。但它们仅能改善炎症症状，并不能延缓疾病的进展，而且严重的胃肠道副作用限制了其临床应用。更为不幸的是，目前所有的抗炎药物用于治疗脓毒症这种失控性全身炎症反应的效果均被证明是无效的。因此，临床上可用的抗炎药物还远远不能满足治疗顽固性炎性疾病的需求，寻找新的抗炎靶点，研发更加安全有效的抗炎技术途径具有重要的价值。已经公认，激活α7烟碱样乙酰胆碱受体（α7受体）是治疗一系列难治性炎症疾病的重要策略。因为采用药理学途径激活α7受体可以显着抑制免疫细胞/内皮细胞合成和释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素、和高迁移率族蛋白1（HMGB1）等促炎细胞因子。在“靶向α7受体抗炎通路”这一研究领域内，胆碱是其中一个非常有发展前景的候选药物。因为胆碱是天然的α7受体选择性激动剂。同时，胆碱是机体必需的营养物质之一，是细胞膜卵磷脂和鞘磷脂的重要组成部分，是体内合成乙酰胆碱的前体物质和重要的甲基来源，口服安全无毒。有研究报道胆碱在不同的炎性疼痛模型上具有镇痛作用；在实验性脓毒症模型上也证实其具有保护作用；此作用与其激活α7受体有关。然而，胆碱对非感染性急性炎症是否具有抗炎性肿胀作用还不清楚；胆碱对于脓毒症的防治效果尚缺乏系统的研究。以临床上抗炎疗效确切的药物为基础，采用药物联用的方案，是开发新的抗炎技术途径的现实手段之一。阿司匹林是经典的NSAIDs。虽然阿司匹林大剂量使用会导致胃肠道副作用，但小剂量的阿司匹林却一直广泛用于防治伴有炎症和血液高凝状态的心血管疾病病人，而且业已证明其长期服用的有效性和安全性。值得关注的是，近年来的研究表明阿司匹林在抗炎方面比其他NSAIDs可能具有更多的治疗学优势。一方面，阿司匹林可以通过环氧合酶依赖和非依赖的分子途径发挥抗炎作用，表现在：（1）促进抗炎物质Aspirin-triggered lipoxins（ATLs）的释放，增加了巨噬细胞的吞噬功能；（2）对各种免疫细胞均具有免疫调节作用，有利于治疗具有自身免疫反应特点的疾病等。另一方面，高选择性环氧合酶-2抑制剂的抗炎效果非但并不优于阿司匹林，而且有增加致死性心血管事件的风险。因此，阿司匹林在NSAIDs中仍占有重要地位。寻找一种具有不同作用机制的抗炎药物与阿司匹林联用将有可能达到增强其抗炎疗效，降低其使用剂量，从而降低剂量相关副作用的目的。由于胆碱可以通过激活α7受体抑制多种促炎细胞因子的释放，而阿司匹林也具有多条抗炎分子途径，理论上二者联用能够发挥更好的抗炎作用。有趣的是，本实验室前期研究表明，在不同的炎性疼痛模型上，胆碱能增强低剂量的阿司匹林的镇痛效应。因此，我们推测胆碱与低剂量阿司匹林具有协同抗炎作用，这可能是一个更加安全有效的抗炎途径。围绕这一工作假设，本论文第一章在角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀模型上，以肿胀度为指标，评价了胆碱在急性非感染性局部炎症反应模型上的抗炎作用，并采用等辐射分析法研究了胆碱和阿司匹林联用的交互作用类型及其与α7受体的关系。本论文第二章在LPS诱导的小鼠脓毒症模型（全身失控性炎症反应模型）上，以生存时间和存活率为指标，系统研究了胆碱对全身炎症反应/脓毒症防治作用的最佳疗效；研究了胆碱与阿司匹林联用对脓毒症小鼠的防治效果及其与α7受体的关系；并探讨了二者联用对细胞因子和炎症介质释放的影响。主要研究结果如下：1.胆碱以及胆碱和阿司匹林联用抑制λ-角叉菜胶所致足趾炎性肿胀的药理学特征小鼠足趾底部注射1%λ-角叉菜胶后1,2,3,4,5,和6h，足趾肿胀度（%，mean±S.E.M）分别为12.7±1.3%,17.5±1.5%,22.1±2.1%,19.8±2.0%,17.2±1.8%,和16.0±2.2%。角叉菜胶注射后1~3h为急性炎性肿胀的发展期，4~6h为缓慢消退期，其中角叉菜胶注射后3h小鼠足趾肿胀达峰值。因此，选择角叉菜胶注射后1~3h为主要观测时间，并以3h这一时间点的肿胀度来计算药物作用的ED50值。阿司匹林11.25~200mg/kg腹腔注射预防1h可以剂量依赖性抑制足趾肿胀的程度。在角叉菜胶注射后3h，以模型组的平均肿胀度为100%，则阿司匹林11.25，22.5，45，100，和200mg/kg给药后的相对肿胀率分别为：94.6%，93.8%，72.0%，54.8%，和43.7%；ED50为136.73mg/kg（95%可信区间：87.41~213.87）。胆碱12.5~80mg/kg腹腔注射预防3h也可以剂量依赖性抑制小鼠足趾炎性肿胀程度。在角叉菜胶注射后3h，以模型组的平均肿胀度为100%，则胆碱12.5，25，50，和80mg/kg给药后的相对肿胀率分别为：91.1%，73.9%，70.5%，和66.9%；ED50为＞200.31mg/kg（95%可信区间：75.07~534.48）。单独给予胆碱12.5mg/kg和阿司匹林11.25mg/kg均无显着的抗肿胀作用，但两者联用时可以显着抑制足趾肿胀的程度，提示两者可能具有协同作用。在两药联用时的量-效关系研究中，我们根据等辐射分析法的原则，在维持两药这一固定剂量比例的条件下，采用剂量分别倍增/倍减的方式，设计了如下5个剂量组，即胆碱3.125mg/kg+阿司匹林2.8mg/kg、胆碱6.25mg/kg+阿司匹林5.625mg/kg、胆碱12.5mg/kg+阿司匹林11.25mg/kg、胆碱25mg/kg+阿司匹林22.5mg/kg、和胆碱50mg/kg+阿司匹林45mg/kg。结果表明，两药联用可以剂量依赖性抑制足趾肿胀的程度。以模型组的平均肿胀度为100%，联合给药各剂量组在角叉菜胶注射后3h小鼠的足趾相对肿胀度分别为83.2%、71.5%、59.7%、46.3%、和34.7%，据此计算得到两药联用时胆碱和阿司匹林的ED50分别为21.31mg/kg（19.73~23.04）和19.19mg/kg（17.76~20.73）。采用CalcuSyn2.0软件分析得出胆碱和阿司匹林联用的量-效曲线较分别单用时显着左移，提示两药联用既可以降低使用剂量，又可以提高抗炎效应。胆碱和阿司匹林联用时，在ED50，ED75，和ED90处的联合用药指数（Combination index，CI）值分别为0.25,0.32,和0.44。由于CI值<0.9为协同效应，<0.5为强协同效应，因此判断两药联用具有很强的协同抗炎效应。选择性α7受体拮抗剂MLA5mg/kg腹腔注射预防给药并不影响λ-角叉菜胶所致的足趾肿胀，但可以完全拮抗50mg/kg的胆碱对足趾肿胀的抑制作用。MLA2mg/kg可以拮抗胆碱12.5mg/kg和阿司匹林11.25mg/kg联用时对足趾肿胀的协同抑制作用。这表明单独给予胆碱抑制炎性肿胀的机制主要由激活α7受体介导；同时α7受体的激活参与了胆碱和阿司匹林的协同抗炎效应。2.胆碱以及胆碱和阿司匹林联用对抗LPS诱导的脓毒症的药理学特征50mg/kg的LPS静脉注射能成功建立失控性全身炎症反应（重度脓毒症）小鼠模型，动物在24小时内死亡率接近100%。单次预防给予胆碱10~50mg/kg对脓毒症小鼠生存时间和死亡率均无显着影响；胆碱60，70，和80mg/kg给药后可显着延长小鼠的中位生存期，存活率分别为30%，20%，和20%；其中以胆碱60mg/kg预防给药效果最佳。单次预防给予阿司匹林10和20mg/kg对脓毒症小鼠的生存曲线并无明显影响；预防给予阿司匹林40和60mg/kg后，脓毒症小鼠的中位生存期显着延长；阿司匹林10~60mg/kg预防给药后，模型动物的存活率分别为0%，10%，10%，10%；提示阿司匹林仅能减轻炎症反应，延缓死亡，但在提高脓毒症小鼠的存活率方面效果甚微。当阿司匹林的剂量高达100mg/kg时，其保护作用则完全消失，与文献报道一致。单用阿司匹林20mg/kg和单用胆碱40mg/kg对脓毒症小鼠均无显着影响，但两者联用却可以显着提高存活率（60%），利用Cox比例风险回归模型进行统计分析表明，二者存在显着的交互作用，提示两药预防联用时具有协同增强效应。采用正交设计的方法得到胆碱治疗脓毒症的最佳方案为40mg/kg间隔2h给药3次，但存活率也仅能提高到30%。而阿司匹林7.5~100mg/kg单用治疗的结果跟预防给药的结果类似。虽然胆碱最佳治疗方案和阿司匹林联合用药治疗脓毒症小鼠时并未发现协同作用，但在存活率方面，两药联用均高于单用，提示两药联用治疗脓毒症时有迭加作用。预防给予2mg/kg MLA本身并不影响模型小鼠的生存时间和存活率，但可以完全阻断60mg/kg胆碱对模型小鼠的保护作用，说明胆碱对脓毒症小鼠的治疗作用是通过激活α7受体介导的。2mg/kg MLA可以拮抗胆碱40mg/kg和阿司匹林20mg/kg联用的抗脓毒症效果，证明α7受体的激活参与了两药的协同保护作用。文献报道，无论是角叉菜胶还是LPS所致的炎症反应，在病理生理机制上均归咎于促炎细胞因子和炎症介质的大量释放。因此，我们研究了胆碱40mg/kg和阿司匹林20mg/kg单用或联用对LPS所致全身炎症反应小鼠血清细胞因子和炎症介质的影响。胆碱40mg/kg可以显着抑制LPS诱导的血中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影响IFN-γ和抗炎细胞因子IL-10的含量。而阿司匹林20mg/kg可以显着抑制IL-1β、IL-6、IL-10、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影响IFN-γ、TNF-α和HMGB1的含量。值得注意的是，两者联用时可以显着抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高。两药联用较分别单用可以更有效地抑制IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1和PGE2的释放，表明胆碱和阿司匹林联用时能更好地抑制LPS所致促炎细胞因子和炎症介质的释放，更有效地控制机体的过度炎症反应。在离体培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上，我们进一步探讨了如下两个问题：（1）阿司匹林是否增强胆碱对细胞因子TNF-α的抑制作用；（2）胆碱是否增强阿司匹林对花生四烯酸代谢的抑制作用。LPS（100ng/ml）刺激培养的RAW264.7细胞可致上清液中TNF-α的含量显著升高，胆碱（1~50mmol/L）可以剂量依赖性抑制TNF-α的释放，与文献报道一致；但100μmol/L的阿司匹林与50mmol/L的胆碱联用时却并不增强胆碱对TNF-α的抑制作用，提示两药联用的机制可能不是通过抑制TNF-α这一分子途径。LPS（1μg/ml）刺激培养的RAW264.7细胞可导致上清液中TXA2和PGI2的显着升高，阿司匹林（0.1~30μmol/L）可以剂量依赖性抑制TXA2和PGI2的释放；但胆碱（0.1~10mmol/L）并不影响TXA2和PGI2的含量；而且1mmol/L胆碱和阿司匹林联用并不影响阿司匹林对TXA2和PGI2释放的抑制作用。这提示胆碱并不直接抑制环氧合酶的活性，也不增强阿司匹林对环氧合酶活性的抑制作用。由于阿司匹林的抗血小板作用源于其对TXA2的抑制作用而阿司匹林的胃肠道副作用源于其对PGI2的抑制作用，而胆碱本身并不直接影响TXA2和PGI2的代谢，也不影响阿司匹林对TXA2和PGI2的抑制作用，提示两药联用的情况下，胆碱在提高阿司匹林的抗炎效果和降低使用剂量的同时，既不会增加阿司匹林所致的胃肠道副作用也不会增加出血倾向，表明胆碱和低剂量阿司匹林联用是更为安全有效的抗炎技术途径。综上所述，本研究得出如下结论：1.胆碱通过激活α7受体对局部和全身炎症反应发挥显着的抗炎作用。2.胆碱和低剂量阿司匹林联用具有协同抗炎作用，α7受体参与了二者的协同效应。3.胆碱和阿司匹林单独用于防治脓毒症效果有限，但二者预防联用具有协同增强效应，这与其能更有效地控制促炎细胞因子和炎症介质的释放密切有关。上述结果为临床上采用胆碱和低剂量阿司匹林联合用药的方案治疗炎性疾病提供了新的实验证据。
沈磊, 崔文玉, 陈汝筑, 汪海[3]2012年在《海马神经元α7型烟碱样乙酰胆碱受体的失敏特征》文中进行了进一步梳理目的研究大鼠海马神经元α7型烟碱样乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的失敏特征。方法在培养大鼠海马神经元上,以胆碱作为工具药,采用膜片钳全细胞记录方式研究胆碱诱发α7型烟碱样乙酰胆碱受体失敏的电生理学特征。结果在培养大鼠海马神经元上,喷射胆碱可诱发出一内向电流,能被α7-nAChR选择性拮抗剂methyllycaconitine(10 nmol.L-1)和α-bungarotoxin(100 nmol.L-1)明显阻断;延长高浓度胆碱(10 mmol.L-1)的给药时间不影响α7-nAChR的失敏和失敏态的恢复,但可以延长其处于完全失敏态的时间;灌流低浓度胆碱(50、100μmol.L-1)可以使α7-nAChR缓慢失敏,失敏程度与胆碱浓度有关。结论高浓度胆碱诱发α7-nAChR的快速失敏及恢复与给药时间无关,低浓度胆碱诱发受体的缓慢失敏及恢复与浓度有关。
罗王倩[4]2009年在《宾赛克嗪拮抗神经元N受体的药理学特征》文中提出神经元N受体(neuronal nicotinic acetylcholine receptors, NNRs)是由至少12种亚基(α2 ?α10,β2 ?β4)通过不同搭配组成的五聚体,理论上可组成的亚型种类众多,并且不同亚型分布有别,电生理学特性各异,由此形成丰富而复杂的功能特征。近年来,NNRs由于其在高级脑功能中所扮演的角色,以及与神经退行性疾病等多种病理状态的相关性,已成为药物研究中的重要靶标。深入研究NNRs不同亚型的电生理学特征,不仅有助于对不同生理和病理状态下胆碱能信号传递在时间、空间和强度上变化规律的认识,也对靶向胆碱能神经系统功能紊乱相关疾病的药物研究大有裨益。宾赛克嗪是本实验室发展的一种兼具抗M和抗N作用的速效强效有机磷毒物(orgnaophosphorus, OP)抗毒剂。前期研究发现:1、在OP中毒过程中,NNRs失敏后并非如传统观点所言处于一种无功能状态,而是能够通过易化M受体对激动剂的敏感性而增强OP的毒性作用,这为宾赛克嗪抗N作用研究的重要性提供了理论依据;2、前期在配体结合实验中发现宾赛克嗪对M受体的亲和力远弱于阿托品,而在动物抗致死实验中发现宾赛克嗪作用强于阿托品,这为宾赛克嗪抗N作用研究的重要性提供了实验依据。因此,研究宾赛克嗪对NNRs的拮抗特征不仅对于阐明其抗毒分子机制及优化新一代抗毒剂的研发具有重要意义,同时也可能为其它胆碱能神经系统功能紊乱相关疾病提供新的干预策略。在上述理论依据与实验依据的基础上,本课题采用膜片钳全细胞记录技术,在转染表达脑内分布最广、表达最多的α4β2亚型,与学习记忆等高级脑功能密切相关的α7亚型以及在很多重要脑区均有丰富表达的α4β4亚型这叁种具有代表性的NNRs亚型的SH-EP1细胞株上,首先研究NNRs叁种亚型不同功能状态的电生理学特征,并在此基础上重点评价新型胆碱受体拮抗剂宾赛克嗪对该叁种NNRs亚型拮抗作用的药理学特征,探讨其在叁种受体亚型上可能的作用位点,最后在最主要的NNRs亚型α4β2上探索性的尝试一种新的胆碱能药物评价方法,即考察药物对NNRs不同功能状态的影响。上述研究获得的主要结果如下:一、SH-EP1细胞株转染表达神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型不同功能状态的电生理学研究本部分研究旨在建立NNRs不同亚型不同功能状态的电生理学研究技术平台,在此基础上对比性研究NNRsα4β2、α4β4和α7叁种亚型多种功能状态的电生理学特点,为此平台用于药物评价及其作用机制的研究奠定基础。1.转染表达神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型SH-EP1细胞株的鉴定首先在本实验条件下建立了SH-EP1细胞株的传代培养方法,其形态学特征与文献报道一致;其次通过RT-PCR实验证实了上述叁种细胞株分别表达相应N受体亚基的mRNA;最后通过N受体特异性激动剂在叁种细胞株上分别诱发出相应受体亚型介导的内向电流,各亚型电流特征均与文献报道一致,表明细胞株表达了具有功能的上述受体亚型。2.神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型激活态的电生理学特征叁种受体亚型激活态所介导的内向电流均能被快速激活,但随时间的动力学变化过程不同。其中,α7激活速度最快,失活最快;α4β4激活最慢,几乎不失活;α4β2激活速度居中,失活呈先快后慢两个衰减相。向细胞表面喷射不同浓度的相应激动剂,发现叁种亚型的电流幅度均逐渐增大,具有激动剂浓度依赖性。叁种亚型上相应激动剂的EC50分别为:α4β2:烟碱3.1±0.7μmol/L;α4β4:烟碱1.1±0.6μmol/L;α7:胆碱814. 6±209.0μmol/L。叁种亚型激活态的内向电流均具有电压依赖性和内向整流特性。其中,α4β2和α7激活态介导的内向电流内向整流完全,而α4β4虽具有内向整流趋势,但并不完全。进一步统计表明α7的内向整流趋势最强,α4β4最弱,α4β2居中。上述结果提示,在激动剂作用下神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型激活态的形成和转变各具特点,但其介导的内向电流均具有浓度依赖性、电压依赖性和内向整流特性。3.神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型失敏态的电生理学特征持续给予激动剂4 s可诱发出细胞株上相应NNRs亚型的内向电流,但叁种亚型的失敏速度和程度均不同。其中,α7失敏最快,程度最深;α4β4失敏最慢,程度最浅;α4β2失敏速度及程度均居中。反复给予激动剂时,每两次给药间隔3 min,可观察到叁种亚型在激动剂反复作用下失敏的规律有所不同。其中,α4β2电流幅度随给药次数的增加而迅速减小,但自第3次给药起失敏趋势减缓;α4β4和α7电流基本不随给药次数的增加而进行性失敏。上述结果提示,神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型在激动剂持续或反复作用下功能失敏过程各不相同,这可能与它们在有机磷毒物中毒时过度蓄积的乙酰胆碱持续作用、烟草成瘾时烟碱反复作用所介导的不同效应有关。4.神经元N受体α4β2亚型功能失敏后再激活态的电生理学特征本部分研究在α4β2上发现了高浓度激动剂作用下受体失敏后再激活的现象。细胞膜电位钳制在?60 mV,当烟碱浓度低于100μmol/L时,α4β2电流快速激活达到峰值后,呈先快后慢的双相失敏过程。但在烟碱浓度高达1 mmol/L时,电流在激动剂持续作用下迅速失敏至基线附近后当激动剂去除时可再次记录到一内向电流。这提示神经元N受体在不同功能状态间的转化是一个十分复杂的过程,不同状态可能在有机磷中毒过程中发挥不同作用。二、宾赛克嗪拮抗SH-EP1细胞株转染表达神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型的药理学特征第一部分建立的NNRs不同亚型不同功能状态的电生理学研究技术平台上,本部分重点研究了宾赛克嗪对NNRsα4β2、α4β4和α7叁种亚型的作用特征及分子机制。为探讨其可能的作用位点,研究内容包括了宾赛克嗪对叁种亚型失敏的影响、抑制作用的电压依赖性和使用依赖性。1.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流的阻断作用本部分中,观察指标为Ip(峰电流,反映受体对激动剂反应幅度的大小)、Is/Ip (稳态电流和峰电流比值,反映电流衰减的程度)和Tau (衰减时间常数,反映电流衰减速度)。研究发现宾赛克嗪对上述叁种NNRs亚型均具有明确的抑制作用。对于3μmol/L烟碱诱发的α4β2电流,1μmol/L烟碱诱发的α4β4电流和10 mmol/L胆碱诱发的α7电流,宾赛克嗪对Ip抑制作用的IC50分别为4.9、7.5和92.2μmol/L;对Is/Ip抑制作用的IC50分别为0.8、0.5和18.7 mmol/L;对Tau抑制作用的IC50分别为1009.7、0.42和1.08μmol/L。2.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的可逆性宾赛克嗪对NNRs叁种亚型的抑制作用均具有可逆性。宾赛克嗪100μmol/L对α4β2、α4β4和α7叁种亚型作用后第3、10、20 min分别测量电流峰值,可见其恢复速度较快。药物洗脱3 min后,叁种亚型电流峰值可分别恢复至宾赛克嗪作用前的89.6±6.2、80.4±8.3、86.3±12.0%;20 min后,α4β4和α7可完全恢复,α4β2可恢复至89.2±3.5%。3.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的电压依赖性细胞膜电位分别钳制在?120、?90、?60、?30和0 mV下,观察宾赛克嗪对α4β2、α4β4和α7叁种亚型介导电流峰值的抑制作用。研究发现,宾赛克嗪100μmol/L在?30和0 mV下对α4β2和α4β4的抑制作用与?120 mV下的相比较具有统计学差异,而在各钳制电位下对α7的作用之间均无显着性差异。表明宾赛克嗪对α4β2和α4β4的抑制作用具有电压依赖性,而对α7的抑制作用不具有电压依赖性。4.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的使用依赖性本部分实验设计了两组不同的给药程序以观察宾赛克嗪对α4β2、α4β4和α7叁种亚型抑制作用的使用依赖性。一组持续给予宾赛克嗪100μmol/L条件下,每间隔3 min给予激动剂诱发一次电流,共4次(0,3,6,9 min);另一组相同条件下每间隔3 min诱发一次电流,共2次(0, 9 min)。比较两组中第9 min电流峰值的大小。研究发现α4β2和α4β4两种亚型上述两组结果有统计学差异,α7则无。表明宾赛克嗪对α4β2和α4β4的抑制作用具有使用依赖性,而对α7的抑制作用不具有使用依赖性。叁、宾赛克嗪拮抗SH-EP1细胞株转染表达神经元N受体α4β2亚型不同功能状态的药理学特征第二部分中,我们采用国际公认的实验设计研究了宾赛克嗪对叁种代表性NNRs亚型的拮抗特征并判断了其在不同亚型上可能的作用位点。本部分研究则探索性的尝试了一种新的胆碱能药物作用评价方法:我们在中枢分布最广、表达最丰富的α4β2亚型上侧重考察了宾赛克嗪对其不同功能状态的影响,考察内容包括宾赛克嗪对α4β2亚型激活态、失敏态和再激活态的作用特征。期望通过本部分的研究探索一种描述抗毒剂作用特点的新思路,也为靶向NNRs的药物研究提供新的可能策略。1.宾赛克嗪对α4β2受体静息态的拮抗作用本研究发现,100μmol/L宾赛克嗪与3μmol/L烟碱同时给予,对静息态α4β2受体向激活态转化的抑制可达91.8±3.4 % (n = 5)。宾赛克嗪的该抑制作用具有浓度依赖性,其IC50 = 4.9μmol/L。2.宾赛克嗪对α4β2受体失敏态的拮抗作用本研究还观察了由于被宾赛克嗪阻断而不能由激活态转变为失敏态的受体数量变化,即宾赛克嗪对受体失敏态的拮抗作用。研究发现,0.1μmol/L宾赛克嗪与3μmol/L烟碱同时给予,对失敏态α4β2的抑制可达9.7±4.1 % (n = 5)。并根据宾赛克嗪作用前(标识为灰色)后(标识为黑色)电流图形的对比分析,推导出宾赛克嗪对失敏态受体阻断作用的动力学过程,其函数形式为: N_(open-blocked) / N_(activated) = [(A_1e~(-t/τ_1) + A_2e~(-t/τ_2) + C_1)-(A_3e~(-t/τ_3) + A_4e~(-t/τ_4) + C_2)] / I_P (N_(open-blocked),失敏态受体阻断数量;N_(activated),激活受体总数量;A_1,灰色电流快成分;A_2,灰色电流慢成分;A_3,黑色电流快成分;A_4,黑色电流慢成分;τ_1,灰色电流快衰减常数;τ_2,灰色电流慢衰减常数;τ_3,黑色电流快衰减常数;τ_4,黑色电流慢衰减常数;C_1,灰色电流非衰减参数;C_2,黑色电流非衰减参数;IP,灰(黑)色电流峰值。3.宾赛克嗪对α4β2受体失敏后再激活过程的影响针对第一部分研究中发现的高浓度激动剂作用下受体失敏后再激活的现象,本研究进一步考察了宾赛克嗪对该再激活状态的作用。实验中通过1 mmol/L烟碱持续作用4 s诱发一快速激活后快速失敏至基线附近的内向电流,当烟碱给药结束时,可再次记录到一内向电流,该激活和再激活的电流均可被100μmol/L浓度宾赛克嗪所阻断。宾赛克嗪与烟碱同时给予时,受体激活后电流幅度降为单独给予烟碱时的(56±8)% (P < 0.05, n = 4),而当给药停止时,再激活电流不再出现。表明宾赛克嗪可拮抗α4β2激活后再激活的功能状态。综上所述,本研究结论如下:1.NNRsα4β2、α4β4和α7叁种亚型的激活态均具有激动剂浓度依赖性、电压依赖性和内向整流特性,但具有不同的开放动力学过程,其在激动剂持续和反复作用下的失敏特性也各不相同。2.宾赛克嗪对NNRsα4β2、α4β4和α7叁种亚型均具有可逆性抑制作用。其中,对α4β2、α4β4抑制作用较强,该抑制作用加速其失敏,具有电压依赖性和使用依赖性,其作用位点可能在通道内部,机制可能为开放通道阻断作用;对α7抑制作用较弱,该抑制作用加速其失敏,但不具有电压依赖性和使用依赖性,其作用位点可能在通道外部远离细胞膜的非激动剂结合位点,机制可能为变构调节。3.宾赛克嗪对NNRs最主要的亚型α4β2的静息态、激活态、失敏态和再激活态均具有拮抗作用。
宫泽辉[5]1997年在《中枢烟碱样乙酰胆碱受体的分子药理学研究进展》文中研究指明烟碱样乙酰胆碱受体（ｎＡＣｈＲ）是第一个被分离纯化的、具有五聚体的跨膜受体。但由于中枢ｎＡＣｈＲ的多样性和药理学反应的复杂性，至今尚未清楚其在中枢的结构和功能。随着生物基因工程的发展，中枢ｎＡＣｈＲ的研究也发生了突破性进展。仅不到５年的时间，就确定了ｎＡＣｈＲ的基因序列及其结构特点；并从鸡、大鼠、小鼠和人的脑组织中至少提取和克隆了１２ 个中枢ｎＡＣｈＲ的亚单位，建立了ｎＡＣｈＲ的基因库。随后在体外，将各受体亚单位的ｍ ＲＮＡ配对注入爪蟾卵母细胞内，所有的排列组合都可以表达出完整的功能性受体蛋白，但不同亚单位组成的受体亚型药理学特性明显不同，从而揭示了中枢ｎＡＣｈＲ的多样性和药理学反应复杂性的物质基础
刘跃[6]2004年在《烟碱样乙酰胆碱受体的药理学研究》文中指出目的 探讨药物处理对海马神经元表面α7受体数目的影响及相关机制。材料与方法 海马神经元经烟碱、胆碱、或MLA处理7天。结果 与对照组相比,α7受体数目显着增加。烟碱的有效浓度为10、100μM;胆碱的有效浓度为0.001μM-1μM,10-1000μM无效;MLA为10、100μM。蛋白合成抑制剂Cychycloheximide(Cyc)显着降低受体数目。在Cyc抑制蛋白合成的前提下,烟碱、胆碱、MLA仍可上调α7受体数目;但可抑制抑制叁者上调受体数目的幅度。Foskolin1-100μM对受体数目无影响。结论 烟碱、胆碱、MLA可上调海马神经元表面α7受体数目,这种上调与配体和受体结合后,使受体降解减慢以及新蛋白合成增加有关;蛋白磷酸化对α7受体数目无影响。
王越[7]2005年在《脑烟碱样乙酰胆碱受体α_7亚型的实验研究》文中研究指明烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)α_7亚型属于配体门控型离子通道受体,是脊椎动物脑中分布最广的两类nAChRs亚型之一。利用分子克隆等多项先进技术研究发现,nAChRs α_7亚型在分子构成,生物学特性等方面与其它nAChRs亚型如α_4β_2间存在明显不同,而这种差异使α_7受体具有其独特的生理学功能并在许多疾病的发生发展及治疗过程中扮演着重要角色。本论文就以α_7受体为研究对象,首次系统的阐述了该受体在配体长期作用下同源性上调的特征及其机制,证实了该受体在急性热痛中的镇痛作用,发现了脑内α_7受体与内皮细胞上α_7受体的异同,并在此基础上筛选出与不同组织α_7受体具有较高亲和力的化合物,作为下一步研究的对象。全文摘要如下: 第一部分:脑α_7受体同源性上调的特征及其机制研究 在靶向α_7受体的疾病治疗过程中,α_7受体不可避免地要长期暴露于其配体中。传统观点认为,受体在激动剂长期作用下会发生保护性调节导致其数目的降低;相反,拮抗剂长期暴露则会诱发受体数目的上行性调节,如毒蕈碱样乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptors)等。但是对nAChRs α_4β_2等亚型的研究却发现了相反的现象,即:激动剂和拮抗剂长期作用后都可显着增加α_4β_2受体的数目,但受体增加后功能反而降低。α_7受体在其选择性配体长期作用后,是否也会发生如同α_4β_2受体的数目和功能变化呢?目前尚无明确答案。 为此我们选取新生大鼠的海马为研究对象,在体外进行分散培养,分别给予不同浓度的α_7受体选择性激动剂胆碱(Choline)、选择性拮抗剂甲基牛扁亭(Methyllycaconitine,MLA)以及nAChRs激动剂烟碱(Nicotine)长期孵育后,一部分与不同浓度的~(125)I标记的α银环蛇毒素
温晓明[8]2006年在《淋巴细胞非神经性胆碱能受体药理学特征的研究》文中研究表明尽管胆碱受体是最早发现的受体，但随着淋巴细胞非神经性胆碱能系统的发现，让我们对于传统问题有了新的疑问。胆碱受体分为nAChRs和mAChRs两大类，分别隶属于与离子通道相偶联和与G蛋白相偶联的受体超级家族，神经元的胆碱能受体存在交叉调节作用，免疫系统的nAChRs和mAChRs是否可以相互支配尚不清楚。同一受体在不同的组织器官分工各异，而AChRs的药理学特征是否具有组织选择性还没有阐明。之前对于香烟、槟榔的危害主要集中在神经系统上，但其中所含的胆碱能激动剂烟碱和槟榔碱是否同时作用于淋巴细胞的AChRs还需要进一步研究；临床常用的胆碱能药物治疗神经性退行性疾病有效，而mAChRs在淋巴细胞的存在，是否会造成药物靶向的不确定性，为人们提出一个新的研究课题。淋巴细胞非神经性胆碱能系统的研究工作仅开展了十几年，AChRs对淋巴细胞的调节作用有待进一步深入研究。基于以上疑惑，我们设计了以下实验进行探讨研究。选用AChRs激动剂和拮抗剂对小鼠免疫系统的影响，研究淋巴细胞非神经性胆碱能系统中AChRs的药理学特征及调节作用，揭示它参与功能的调节，以期能对上述问题给出满意答案。1．胆碱能激动剂和拮抗剂对脾淋巴细胞增殖反应的影响利用MTT比色法检测AChRs激动剂和拮抗剂对刀豆蛋白A诱导的离体小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。结果发现，激活淋巴细胞非神经性mAChRs和nAChRs，可产生促进增殖和抑制增殖的双向调节作用。其中α7-nAChRs参与介导烟碱和胆碱抑制增殖反应。结果提示：乙酰胆碱以自分泌或旁分泌的方式参与淋巴细胞的增殖反应。传统的胆碱能激动剂和拮抗剂也可以作用于淋巴细胞非神经性胆碱能受体。2．胆碱能激动剂和拮抗剂对免疫功能的影响随机BALB／c小鼠分为7组，山莨菪碱组(2mg／kg)、东莨菪碱组(0.2mg／kg)、槟榔碱组(2mg／kg)、阿托品(1mg／kg)+槟榔碱组、烟碱组(1.5mg／kg)和美加明(1mg／kg)+烟碱组。连续4周使用临床剂量的药物后，比较药物组与对照组的脾指数、血清溶血素、淋巴细胞转化以及白细胞介素-2的变化。结果显示，所使用的激动剂和拮抗剂对免疫功能都有一定的影响，槟榔碱和烟碱分别通过mAChRs和nAChRs介导反应。这是本实验的创新点，第一次提出非神经性mAChRs参与槟榔碱对免疫系统的抑制作用。实验结果提示：胆碱能药物治疗神经退行性疾病的同时，也可能通过淋巴细胞非神经性胆碱能受体而参与免疫功能的调节。3．烟碱对淋巴细胞α7-AChRs和M3-AChRs基因表达的调节作用正常BALB／c小鼠取出脾脏分离淋巴细胞，分别给予不同的药物：(1)对照组(PBS代替药物)；(2)刀豆蛋白A组(5μg／mL)；(3)烟碱组(10~6mol／L)；(4)刀豆蛋白A(5μg／mL)+烟碱组(10~6mol／L)。48h孵育后提取总RNA，RT-PCR方法合成dsDNA，比较药物组和生理盐水组之间淋巴细胞α7-AChR和M3-AChR基因表达的改变。结果显示，四组均有α7受体及M3受体mRNA目的条带的表达(分别为213bp，278bp)。但生理盐水组和药物处理组的α7受体及M3受体mRNA转录水平没有明显差异。小鼠予以1.5mg／kg的烟碱皮下注射，连续用药2，3，4周后取脾，提取总RNA，RT-PCR方法合成dsDNA，比较烟碱组和生理盐水组之间淋巴细胞a7-AChR和M3-AChR基因表达水平的改变。结果显示，生理盐水组和烟碱组均检测到特异性a7受体、M3受体mRNA目的条带的表达。烟碱组的a7和M3 mRNA表达量均低于生理盐水组，但只有在给药4周后，烟碱组与生理盐水组的a7受体mRNA呈显着性差异。结果提示：淋巴细胞a7受体的表达调控可能与中枢神经系统不一致，同一受体在不同细胞组织中存在结构的多样性。
孙秀兰, 胡刚, 汪海[9]2003年在《失敏态烟碱样受体》文中研究表明烟碱样受体属于配体门控性离子通道受体 ,参与调节体内许多生理过程。激动剂反复作用可以诱导N受体失敏 ,许多因素参与调节烟碱样受体的失敏 ,如受体亚单位、信号转导系统、细胞微环境的变化等都会影响受体的失敏过程。失敏态N受体并非处于无功能状态 ,它们可能参与调节递质的释放、调节突触可塑性等过程
杨东仁[10]1997年在《毒物对神经肌接头烟碱样乙酰胆碱受体的作用》文中指出本文就神经肌接头烟碱样乙酰胆碱受体的分子结构、生物学性质及毒物的作用进行了综述，并分析了毒物的作用机制。神经肌接头作为毒物作用的特异靶位点，是评价周围神经系统毒性的有效模型。
参考文献：
[1]. 烟碱样乙酰胆碱受体门控机制的动力学研究[D]. 刘信力. 大连理工大学. 2007
[2]. 胆碱和阿司匹林协同抗炎作用及其药理学机制的研究[D]. 潘志远. 中国人民解放军军事医学科学院. 2014
[3]. 海马神经元α7型烟碱样乙酰胆碱受体的失敏特征[J]. 沈磊, 崔文玉, 陈汝筑, 汪海. 中国药理学通报. 2012
[4]. 宾赛克嗪拮抗神经元N受体的药理学特征[D]. 罗王倩. 中国人民解放军军事医学科学院. 2009
[5]. 中枢烟碱样乙酰胆碱受体的分子药理学研究进展[J]. 宫泽辉. 国外医学.药学分册. 1997
[6]. 烟碱样乙酰胆碱受体的药理学研究[D]. 刘跃. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[7]. 脑烟碱样乙酰胆碱受体α_7亚型的实验研究[D]. 王越. 山东大学. 2005
[8]. 淋巴细胞非神经性胆碱能受体药理学特征的研究[D]. 温晓明. 中国协和医科大学. 2006
[9]. 失敏态烟碱样受体[J]. 孙秀兰, 胡刚, 汪海. 中国药理学通报. 2003
[10]. 毒物对神经肌接头烟碱样乙酰胆碱受体的作用[J]. 杨东仁. 国外医学(卫生学分册). 1997
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