导读:本文包含了同种异体角膜缘移植论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:角膜,细胞,干细胞,大鼠,穿透性,树突,模型。
同种异体角膜缘移植论文文献综述
汪飞[1]（2018）在《苦参碱在大鼠同种异体角膜移植手术中对CD4~+CD25~+调节性T细胞的影响》一文中研究指出在角膜移植手术中,受体能够识别进入其体内的“非己”器官并产生免疫排斥反应,移植后的排斥反应是造成角膜移植失败的主要原因。如今,对免疫排斥反应的研究已经成为角膜移植的一个重要方向。目前临床上常用的免疫抑制药物不仅价格昂贵而且毒性大,对机体有着不良反应。由豆科植物苦参的干燥根、植株、果实经有机溶剂提取制成的苦参碱对移植后的急性排斥反应在一定程度上具有免疫抑制的作用,同时苦参碱廉价易得而且毒副作用小,苦参碱的药用价值越来越得到大家的研究。本实验将通过苦参碱对大鼠角膜移植手术后的免疫排斥反应进行研究,探讨苦参碱作为免疫抑制剂作用对CD4+CD25+调节性T细胞的作用机制。本实验以Wistar大鼠作为研究对象,并建立大鼠角膜移植模型,通过对移植后的大鼠给予不同浓度的MT来研究实验大鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞的变化。将大鼠随机分为对照组与实验组,在大鼠角膜移植模型建立成功后,对照组腹腔注射生理盐水,实验组分别注射5mg/kg MT、10mg/kg MT、15mg/kg MT和10mg/kg的环孢素A,连续给药7天。根据角膜免疫排斥反应的评分标准,判断角膜移植后植片的生长情况。术后7天采集对照组和实验组大鼠的外周血和脾脏进行流式细胞仪检测。在术后的第7d收集对照组和实验组大鼠的外周血进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。对移植后的植片观察可以发现,实验组角膜植片的浑浊程度、水肿程度和新生血管指数比对照组都要低。流式细胞术检测结果中发现,在术后7天外周血和脾脏中实验组5mg/kg MT大鼠中的CD4+CD25+调节性T细胞的含量比对照组要高。同时通过对大鼠外周血的检测可以发现,实验组的IL-10和TGF-β1的水平比对照组要高。结果可以表明,在角膜移植模型建立后腹腔注射一定浓度的苦参碱能够提高大鼠体内的CD4+CD25+调节性T细胞的含量,并提高体内IL-10和TGF-β1的含量。一定浓度的苦参碱能够抑制移植后机体的免疫排斥反应。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-06-01）
韩玉萍[2]（2017）在《脂多糖（LPS）诱导的抑制性CD11b+细胞在同种异体角膜移植中的保护作用》一文中研究指出目的骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)是重要的免疫调节细胞群体,其对T细胞介导的免疫反应具有显着的抑制作用。它们除了在癌症发展过程中具有负向调节作用外,还对移植和自身免疫具有很强的调节作用。CD11b+Gr1+髓源抑制细胞能够使小鼠和人类产生同种异体移植物耐受已有广泛报道。然而,MDSCs的诱导因子,详细表型和功能分子等在各种移植模型中显着不同。它们在慢性移植排斥中的治疗作用尚不明确。本实验试图通过建立脂多糖(LPS)诱导小鼠脓毒血症的模型,采用免疫组化、流式细胞术、免疫磁珠分选等方法分离MDSCs,确定其细胞数量,并检测其细胞表型以及细胞功能。通过尾静脉注射的方法将MDSCs过继转移给同种异体角膜移植受体小鼠体内,观察角膜移植术后移植片的存活情况,从而探讨MDSCs在角膜移植中的作用。方法1.将6-8周雄性C57BL/6(H-2b)小鼠,随机分为对照组(PBS组)和实验组(LPS处理组),每组各5只。实验重复2次。2.5mg/kg LPS腹腔内注射给C57BL/6小鼠,每日一次,共7天。对照组采用同样方法给予腹腔内注射相同剂量的PBS。每日观察生命体征,绘制生命曲线,7天后处死小鼠。2.制备小鼠脾脏、骨髓及外周血单细胞悬液,取50ul上述各组单细胞悬液于流式管中,加入FITC-CD11b抗体,PE-CY5-Gr-1抗体,以FITC、PE/CY5通路圈门MDSCs,流式分析软件分析、成图。将上述制备的各组单细胞悬液离心去上清液后的细胞沉淀中加入0.4ml PBS及0.1ml抗Gr-1生物素,4°C冰箱反应10分钟。离心,弃上清,以2ml PBS重悬,摇匀。将单细胞悬液滴入MDSCs免疫磁珠分选柱中,分选出CD11b+Gr-1 MDSCs,用流式细胞学技术检测MDSCs分选纯度。同样的方法进行CD4+T细胞免疫磁珠分选,用流式细胞学技术检测CD4+T细胞分选纯度。3.将分离的CD11b+细胞加入PBS缓冲液调整浓度为1×106/ml,各取100ul分别加入10ul FITC标记的Ly6C、CD40、CD80、CD86、CD273、CD275、TLR2、TLR4、MHC-II抗体,每组抗体均设有同型对照组,室温避光孵育15分钟。加入PBS缓冲液离心洗涤抗体,上流式细胞仪检测。实验数据进行统计学分析。4.分离的CD11b+细胞重新混悬后,加入终末浓度1mg/ml FITC结合的OVA(OVA-FITC),或者相同比例的CD4+T细胞和CD11b+T细胞,然后进行流式细胞仪测定。取LPS腹腔注射7天组小鼠骨髓细胞分选出的CD11b+细胞与CFSE染色后的小鼠脾CD4+T细胞共培养,将T细胞以1×105/孔的密度接种到96孔板中,CD4+T细胞与CD11b+细胞按1:1、1:2、1:4以及1:8比例接种,检测CD11b+细胞对CD4+T淋巴细胞增殖的抑制能力。留出部分CFSE染色的CD4+T细胞不加CD11b+细胞作为阳性对照;每一孔加入1ul鼠抗CD3/28增殖磁珠刺激,将未加CD3/28增殖磁珠刺激的细胞作为阴性对照。流式细胞仪分别检测各个细胞亚群及其不同比例的混合管CD4+T细胞的CFSE荧光强度,以反映其增殖情况;flowjo软件分析,计算抑制率。5.小鼠行同种异体角膜移植,并随机分为实验组和对照组(n=10),在实施穿透角膜移植手术后即刻予小鼠尾静脉注射1×106 LPS诱导小鼠提取的CD11b+Gr1+细胞,对照组注射等量的PBS。每日通过裂隙灯显微镜观察角膜植片情况。观察每组的植片存活率8周以上。根据角膜移植片混浊、水肿、新生血管叁项指标进行评分。当植片的评分达到6或6以上,或者植片混浊一项达到3时,即认为发生免疫排斥反应。由2人同时观察计分并取平均值。通过描绘Kaplan-Meier存活曲线记录植片存活率,组间比较采用log-等级分析。结果1.本研究采用适当剂量(2.5mg/kg)LPS腹腔内连续注射的方式,成功复制了脓毒症小鼠的模型。小鼠注射LPS 12小时后,开始出现病态反应,3-4天达死亡高峰,至7天时病死率约为30%。PBS注射组小鼠7天内未见死亡。随后第8天分析测定LPS诱导模型体内CD11b+Gr1+细胞的表达,脾脏、血液和骨髓中CD11b+Gr1+细胞增加。对照组脾脏中CD11b+Gr1+细胞数目增加了2.9%,而LPS诱导小鼠组为15.8%。同样,LPS诱导小鼠骨髓中CD11b+Gr1+细胞由5.4%增加到29.4%;血液中为0.3%增加到9.3%.这些结果表明在脓毒血症小鼠脾脏、血液和骨髓中CD11b+Gr1+细胞明显增加。其在骨髓中的增加幅度最大。2.CD11b+Gr1+细胞的表型:采用流式细胞分析仪检测了不同的细胞表面标志的表达。LPS诱导小鼠产生的CD11b+Gr1+细胞表面的共刺激分子CD80/CD86、CD40、免疫抑制分子PD1L/PD-1以及TLR4的表达与对照组相似,但Ly6C、TLR2以及MHC-Ⅱ的表达明显增强。3.CD11b+细胞与CD4+T细胞和OVA共培养的结果表明超过98%CD11b+细胞6小时后与可溶性Ag OVA结合,而67%和72%的CD4+T细胞在12小时和24小时后分别产生反应。当CD11b+/T细胞比例为1:2时,CD4+T细胞的增殖抑制达到52%。当二者比例为1:8时,LPS诱导小鼠组的抑制率为30%,而对照组未观察到抑制效果。4.在对实施穿透角膜移植手术后即刻予小鼠尾静脉注射1×106 LPS诱导小鼠提取的CD11b+Gr1+细胞,观察小鼠角膜植片存活情况的同时观察小鼠全身状况。注射小鼠全身均未见明显异常反应,表明LPS诱导的CD11b+细胞过继转移是安全的。CD11b+细胞治疗组的植片存活率明显高于对照组(P=0.02)。CD11b+细胞处理组的平均存活时间为21.4天,而对照组为10.9天。结论实验结果表明LPS诱导后CD11b+Gr1+细胞在脾脏、血液和骨髓显着增加,而且能够抑制活化的CD4+T细胞。骨髓中MDSCs的高表达TLR2表明内毒素感染和非内毒素感染模型之间的表型差异。脂多糖诱导的CD11b+细胞可以发挥抑制性APCs的作用,能够抑制CD4+T细胞的增殖,提高角膜植片的存活率。因而MDSCs参与延迟移植排斥和移植免疫耐受的诱导,预测其将来可用于临床细胞转移治疗移植排斥。(本文来源于《天津医科大学》期刊2017-05-01）
吕婷婷[3]（2016）在《雷公藤甲素在大鼠同种异体角膜移植手术中对CD4+CD25+调节性T细胞的影响》一文中研究指出雷公藤甲素(Tripolide,TP)是从中国草本植物雷公藤中提取出来的一种环氧二萜内酯化合物,既是雷公藤主要活性成分,也是其主要的毒性成分,临床和实验的器官移植术中都证明了雷公藤提取物能够有效地延长移植物存活时间并且能够预防移植物抗宿主病的发生。然而,这些提取物包括TP在调节免疫抑制中对CD4+CD25+调节性T细胞的作用机制还没有被充分的研究。随着对雷公藤的研究加深,TP的药用价值也逐渐的得到了大家的关注。本文将针对TP对穿透性角膜移植术后机体抗免疫排斥方面的作用进行研究与探讨,本研究也将为治疗穿透性角膜移植术后的免疫排斥反应提供部分理论依据。本实验采用单因素试验设计方案,以Wistar大鼠为实验对象,通过建立大鼠穿透性角膜移植模型,来分析TP在大鼠同种异体角膜移植手术中对CD4+CD25+调节性T细胞及相关细胞因子的影响。本实验中,将48只Wistar大鼠分为两组每组24只,其中16只为受体,8只为供体。两组分别为,大鼠穿透性角膜移植空白对照组(A组),给予TP的大鼠穿透性角膜移植实验组(B组)。A组在进行同种异体角膜移植的前七天和后叁天每天给予2ml/kg的生理盐水作为对照,B组在进行同种异体角膜移植的前七天和后叁天每天给予200ug/kg的TP配置液作为实验组。术后每天对实验大鼠进行观察与评价,在术后的7天、10天、14天分别使用心脏采血的方式采集A、B两组实验动物的外周血进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。在术后的第十四天,收集A、B两组实验动物的外周血、淋巴结、脾脏进行流式细胞仪检测。从术后对角膜的观察和各项指标的评价中我们发现,与对照组相比实验组的大鼠角膜植片的混浊程度、水肿程度、新生血管长入程度都较低,且恢复较为良好。通过在第7、10、14天对大鼠的外周血进行检测,我们发现与对照组相比实验组的IL-10的水平有明显的上升,特别在第14天上升的更加的明显,而与实验预期相反的,TGF-β1的水平则发生了明显的下降。在流式细胞检测的结果中我们发现,术后14天实验组的CD4+CD25+n Treg水平相较于对照组在外周血、脾脏、淋巴结中都有明显的升高。综上所述,术前术后共十天腹腔注射TP可以提高穿透性角膜移植后大鼠体内的CD4+CD25+调节性T细胞的百分比,并提高体内的IL-10含量,但对TGF-β1的分泌会产生抑制作用。(本文来源于《吉林大学》期刊2016-04-01）
王博[4]（2015）在《探讨熊果酸对大鼠同种异体角膜移植排斥反应的实验研究》一文中研究指出角膜移植术后免疫排斥反应是由多种免疫细胞和免疫分子共同参与的复杂的免疫反应过程。虽然角膜自身具有前房相关性免疫偏离与免疫赦免的特点,但移植术后的排斥反应仍是造成角膜移植失败的主要原因。长期以来,防治免疫排斥反应成为研究角膜移植的重要方向。目前临床上普遍采用的非特异性免疫抑制疗法,只是“治标”的方法,疗效有限且毒副作用大。近年来,应用某些药物可以更有效抑制角膜移植排斥反应的发生,从而延长角膜植片的存活时间,成为研究角膜移植术后排斥反应的方向之一。研究背景熊果酸,又名乌索酸、乌苏酸、α-香树脂醇,是一种弱酸性五环叁萜类化合物,能够从多种天然植物提取的功能成分。纯品一般为白色针状结晶(乙醇中结晶),味略微苦,基本骨架是由多氧蒎的五环母核所构成的。化学名3-Hydroxy-12-ursen-28-oic acid,分子式C30H11803,相对分子质量456.68,熔点285-291℃,可溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮,略溶于丙酮,微溶于苯、氯仿、乙醚,易溶于二氧六环、吡啶,不溶于水和石油醚。熊果酸不仅仅对多种恶性肿瘤的增殖具有明显的细胞毒作用,而且能够诱导细胞分化及抑制新生血管的形成,还对多种致癌促癌物质造成的细胞癌变具有抵抗作用。另一方面,能够抑制肿瘤细胞增殖和血管内皮细胞形成,有抗菌、抗糖尿病、抗新生血管、抗溃疡、降低血脂、抗组织氧化及增强机体免疫功能等多种生物学作用和药理活性。在角膜移植术后的免疫排斥反应过程中,主要是由CD4Th1细胞起作用的。核因子NF-κB是一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子KB序列特异结合的蛋白因子,是在B细胞核提取物中发现的。研究发现,不仅能够大量存在于真核细胞内,而且能够与多种细胞基因的启动子序列或增强子序列的特定位点发生特异性结合,从而促进其转录和表达。另外,NF-κB在炎症、肿瘤、过敏反应等疾病的发生、发展过程中具有重要的作用,能够与细胞的增生、转化和凋亡,以及炎症、免疫应答反应等重要的病理生理过程紧密联系。NF-κB可上调T细胞表面B7共刺激分子与MHC-Ⅱ勺表达,刺激Thl细胞因子IL-2与IFN-γ的产生。熊果酸抑制NF-κB的活性,从而下调IL-2、IFN-γ分子的表达情况,延长移植物存活时间。熊果酸是通过PKC-lκ-Bα-NF-κB信号通路介导免疫抑制的,抑制IK-Ba磷酸化和核因子NF-KBp65核转录,导致由PKC磷酸化的NF-κB活化抑制。NF-κB是炎症和免疫反应过程中重要的调节因子,能够调节T细胞活化、增殖与基因转录。由p50、p65两个异质二聚体构成,与抑制亚基单位Iκ-Bα结合,存在于未活化状态的胞液中。通过Iκ-B激酶,使抑制亚基单位κ-Bα的丝氨酸32、36部位磷酸化,磷酸化的作用在于泛素化与降解。Iκ-Bα降解可导致活化单位的p50、p65的释放并结合到细胞核,结合到特定的启动子区域,编码炎症细胞因子。另外,熊果酸可明显抑制新生血管的生成,减轻免疫排斥的炎症反应；降低由CD3/CD8诱导的T细胞表面标志CD25、CD69与IL-2的表达含量,抑制NF-κB核因子转录与T细胞活性,而非通过上调CD4 CD25 Foxp3T细胞,诱导宿主的特异性免疫耐受；能够抑制B细胞、T细胞、巨噬细胞的活化,增殖与细胞因子的分泌。抑制丝裂霉素诱导的ERK、JNK的磷酸化与免疫调节转录因子NF-κB、 NF-AT与AP-1的活化,明显降低IL-2、IL-4、IL-6及IL-17的含量,降低T细胞表面CD25、CD69、CD134、CD80及CD86的含量；呈剂量依赖性地抑制T细胞的活化与增殖,能够明显降低T细胞表面活性标志CD25、CD69与CD71的含量,降低NF-κB的表达,从而抑制T细胞活性。因此,本实验拟应用“熊果酸抑制NF-κB的活性,延长角膜移植存活时间”方案,经腹腔内注射至同种异体大鼠角膜移植模型(SD→Wistar)的受体体内,探讨熊果酸对诱导角膜移植免疫耐受的影响,为临床进行有效治疗、抑制角膜移植术后的排斥反应提供重要的理论依据。材料与方法1、实验动物供体为SD大鼠；受体为Wistar大鼠。鼠龄6-8周,体重180-220g,雌性。分4组：A：空白对照组(n=8)；B：自体角膜移植组(n=8)；C：同种异体角膜移植组；D：熊果酸组(n=8),建立大鼠同种异体角膜移植模型,术后观察角膜移植排斥反应及按Larkin等人评分标准评分,术后14天取材。2、病理组织切片HE染色术后第14天,分别于各组中取大鼠角膜植片进行组织病理学检测,标本经4%多聚甲醛溶液固定、脱水、常规石蜡包埋,制备成5μm厚的连续切片,经苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察角膜植片病理学变化。3、Real Time PCR (RT-PCR)检测取大鼠角膜,置于1mL Trizol的离心管中,采用Trizol一步法提取总RNA,行琼脂糖凝胶电泳检测；以焦碳酸二乙酯(DEPC)水为空白对照,应用Nanodrop测定RNA浓度,同时记录各组的RNA浓度及其OD260/OD280值；按照逆转录试剂盒的说明书,逆转录反应合成cDNA。提取的DNA样品直接用于qPCR实验或者-20℃保存。引物序列为：GAPDH上游：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'下游：5'-TCCACCACCCT GTTGCTGAT-3'IL-2上游：5'-TGATGGACCTACAGGAGCTCCTGAG-3'下游：5'-GAGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3'VEGF上游:5'-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3'下游：5'-TGAACTTCACCACTTGGCAT-3'IFN-γ上游:5'-GGAGGAACTGGCAAAAGGATGGT-3'下游：5'-TTGGGACAATCTCTTCCCCAC-3'ICAM-1上游：5'-GCTACATCCACACTGACGCT-3'下游：5'-CAGGGAATGAGTAGACCTCCA-3'NF-KBp65上游：5'-CCGTGGAGTACGACAACATC-3'下游：5'-CCTCTTCCAGCTGCTATGTG-3'RT-PCR反应体系如下：反应总体积(Total)为20μl:SYBR@ (R) PrimxEx Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2x) 10.0μl, PCR Forward Prime (10μM) 0.8μl、PCR Reverse orword Prime (10μM) 0.8μl、ROX reference Dye (50x)、DNA模板2μ1、dH2O(灭菌蒸馏水)6μ1。反应条件：95℃30s预变性,95℃5s,60℃34s,40个循环,重复3次。4、Western Blotting检测取大鼠角膜植片,采用冰冻的RIPA裂解液裂解角膜组织,PBS缓冲液进行洗涤,加入蛋白酶抑制剂,提取核蛋白；SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离,转移至硝酸纤维素膜；室温下用封闭液(5%脱脂奶)封闭1h；兔抗NF-κBp65多克隆抗体、兔抗IκB-α多克隆抗体(1：4000),鼠抗ICAM-1单克隆抗体4℃孵育过夜；洗涤与封闭后,与相应的Ⅱ抗(1：10000)结合,定影、显影、曝光,化学发光法显示免疫条带。GAPDH作为内参抗体。采用凝胶成像分析系统对条带进行定量分析。5、统计学分析方法应用SPSS 16.0统计软件,对实验数据进行分析处理。应用Kaplan-Meier检验比较各组植片的平均存活时间。实验数据采用x±s表示,所有数据进行方差齐性检验后,采用单因素方差分析及两样本均数比较的t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.与同种异体角膜移植组相比,熊果酸组的角膜植片存活时间明显延长,P<0.05,两组间的差异有统计学意义。2.各组(正常对照组、自体角膜移植组、同种异体角膜移植组及熊果酸组)取眼球组织行病理组织切片检查,结果显示：正常角膜组织结果清楚,未见异常；自体角膜移植组中角膜各层结构清楚,未见明显异常,仅基质层中见少量新生血管与炎性细胞浸润；同种异体角膜移植组角膜各层组织中大量单核巨噬细胞及淋巴细胞浸润,基质层可见新生血管形成,部分新生血管的管腔中亦可见散在的少量淋巴细胞；熊果酸组的角膜结构基本保持正常,植片基质层仅有个别淋巴细胞浸润,植床处可见少量新生血管。3.各组(正常对照组、自体角膜移植组、同种异体角膜移植组及熊果酸组)取角膜移植片行RT-PCR检测,各组角膜植片中NF-KBp65, IL-2, VEGF, IFN-y, ICAM-1的相对含量(RQ值表示)在mRNA水平上有差异,B组、C组在角膜移植术后,IL-2, IFN-γ, NF-κBp65, VEGF, ICAM-1的含量会明显升高,D组,即熊果酸组,用药之后,相应的炎症指标明显下降。应用单因素方差分析,先进行方差齐性检验,F值依次为236.991,414.224,24.931,32.164,21.383,采用LSD检验进行两两比较,正常组与自体角膜移植组之间的差异无统计学意义；C组与D组之间,NF-κBp65的相对含量差异无统计学意义(P>0.05),其余各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。4.各组(正常对照组、自体角膜移植组、同种异体角膜移植组及熊果酸组)取角膜移植片行Western Blotting检测,各组角膜植片中NF-κBp65,IκB-α的相对含量(用1A表示)在蛋白表达水平上有所差异,自体角膜移植组、熊果酸组在角膜移植术后,NF-κBp65,κB-α的相对含量变化趋势一致；与同种异体角膜移植组相比,熊果酸组NF-κBp65的相对含量明显下降,而κB-α的含量升高。结论1.同种异体大鼠角膜移植术后,熊果酸组角膜植片的存活时间明显延长；病理组织切片显示：熊果酸组的淋巴细胞浸润与新生血管情况,均较同种异体角膜移植组明显好转；说明熊果酸对移植术后排斥反应具有一定的抑制作用。2.RT-PCR检测结果显示：在mRNA水平上,各组角膜植片中IL-2、IFN-γ、 NF-κBp65、VEGF、ICAM-1的相对含量有差异,用药之后,相应的炎症指标明显下降；Western Blotting检测结果表明,熊果酸组NF-KBp65的相对含量明显下降,而κ-Bα的含量升高,熊果酸可能通过抑制NF-κB通道蛋白的表达,抑制角膜移植排斥反应的。因此,本实验为熊果酸的临床应用提供实验依据。(本文来源于《南方医科大学》期刊2015-03-20）
贾亮[5]（2014）在《局部应用鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂1抑制小鼠同种异体角膜移植排斥的研究》一文中研究指出目的：通过手术方法建立小鼠同种异体角膜移植模型，予以局部应用鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂1（S1P1），观察S1P1对小鼠角膜移植片免疫排斥的影响，并与临床常用的眼用免疫抑制剂地塞米松（DXM），雷帕霉素（Rapa）和环孢霉素A（CsA）进行比较，最终明确S1P1抑制小鼠角膜移植排斥反应的效果；通过检测小鼠体内及角膜植片内树突细胞相关的免疫因子水平和蛋白的表达，探索S1P1抑制角膜植片免疫排斥的作用机制；探索局部S1P1联合用药对小鼠角膜移植术后免疫排斥的影响。方法：1、利用经典手术方法建立以雄性C57BL/6小鼠（24只）为供体，雄性BALB/C小鼠（48只）为受体的同种异体角膜移植实验模型，每只小鼠随机选取一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并随机分为六组（A、B、C、D、E和F组），每组8只，A组为不含药物的安慰剂眼液对照组，B组为0.25%S1P1混悬眼液组，C组为0.5%S1P1混悬眼液组，D组为0.1%地塞米松眼液组，E组为0.4%雷帕霉素眼液组，F组为1%环孢霉素A眼液组。各组术后分别采用局部眼表点药，每日4次（8-12-16-20点），持续给药直至角膜植片发生排斥。术后10-11天于手术显微镜下拆除小鼠角膜移植缝线，术后每日观察小鼠角膜植片变化情况，至发生角膜排斥后处死实验动物。2、建立以雄性C57BL/6小鼠（15只）为供体，雄性BALB/C小鼠（30只）为受体的同种异体角膜移植实验模型。每只小鼠随机选取一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并随机分为五组（G、H、I、J和K组），每组6只。G组为不含药物的安慰剂眼液对照组，H组为0.5%S1P1混悬眼液组，I组为0.1%地塞米松眼液组，J组为0.4%雷帕霉素组，K组为1%环孢霉素A眼液组。术后分别给予上述方案分组方案处置，术后10-11天拆除角膜缝线。并于术后14d时处死全部小鼠，取单侧颈部引流淋巴结、外周血、脾脏等行流式细胞学检测，探讨CD11c+、MHC-II+和CD86+DCs细胞的分布和聚集状态。取外周血血清行Elisa检查IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4水平；每组取3只小鼠角膜，提取总RNA，行Realtime-PCR检查各组植片中IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4mRNA的表达情况；每组取3只小鼠角膜分别进行常规H&E染色，了解角膜排斥反应情况，行免疫组化检查了解MHC-II+DCs和CD86+DCs细胞在角膜植片中的的分布及浸润情况。3、建立以雄性C57BL/6小鼠（16只）为供体，雄性BALB/C小鼠（32只）为受体的同种异体角膜移植实验模型，小鼠随机选取一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并随机分为四组（L、M、N和O组），每组8只。L组为不含药物的安慰剂眼液对照组，M组为0.1%地塞米松眼液组，N组为0.5%S1P1混悬眼液联合0.4%雷帕霉素眼液组，O组为0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素眼液组。自手术后第一日开始，分别给予局部眼表点药，每日4次（8-12-16-20点），联合给药组两种眼药给药间隔为10分钟，持续给药至角膜发生排斥。术后10-11天拆除角膜缝线。术后每日对各组小鼠移植后角膜排斥时间进行观察并照相，记录植片情况，绘制生存曲线，至发生角膜排斥后予过量麻醉处死实验动物。结果：1、对48只同种异体角膜移植小鼠术后角膜植片进行统计分析，空白对照组角膜植片平均存活时间为16.8±1.7天(n=8)；0.25%S1P1眼液组角膜植片平均存活时间为17.8±1.9天（p<0.01, n=8）；0.5%S1P1眼液组角膜植片平均存活时间为27.6±3.3天（p<0.01, n=8）；0.1%地塞米松眼液组角膜植片平均存活时间为31.9±4.3天（p<0.01, n=8）；0.4%雷帕霉素眼液组角膜植片平均存活时间为25.1±4.0天（p<0.01, n=8）；1%环孢霉素A组角膜植片平均存活时间为25.8±4.2天（p<0.01, n=8）。2、与空白对照组相比较，0.25%S1P1眼液组植片存活时间有所延长，但无统计学差异（P0.05）；0.5%S1P1眼液组、0.1%地塞米松眼液组、0.4%雷帕霉素眼液组、1%环孢霉素A眼液组植片存活时间明显延长，并且有显着性差异（P<0.01）。与0.5%S1P1眼液组相对比，0.1%地塞米松眼液组植片存活时间明显延长，有统计学差异（P<0.05）;0.4%雷帕霉素眼液组、1%环孢霉素A眼液组植片存活时间无延长，且无统计学差异（P0.05）。3、局部应用0.5%S1P+1眼液可显着增加外周血中MHC-IICD11c+细胞比例（P<0.01），显着降低颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞和MHC-II+CD86+细胞的比例（P<0.05）。4、局部应用0.1%地塞米松眼液可显着增加外周血中MHC-II+CD11c+细胞比例（P<0.01）和显着降低脾脏中MHC-II+CD11c+细胞比例（P<0.05），显着降低颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞和MHC-II+CD86+细胞的比例（P<0.05和P<0.01）。5、局部应用0.4%雷帕霉素眼液可显着降低外周血中和颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞比例（P<0.05），显着增加外周血中MHC-II+CD86+细胞的比例（P<0.01），显着降低颈部淋巴结中MHC-II+CD86+细胞的比例（P<0.01），显着降低脾脏中MHC-II+CD86+细胞的比例（P<0.05）。6、局部应用1%环孢霉素A眼液可显着降低外周血中和颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞和MHC-II+CD86+细胞的比例（P<0.05， P<0.01；分别地），显着增加脾脏中MHC-II+CD86+细胞的比例（P<0.05）。7、外周血血Elisa检查，对比空白对照组，0.5%S1P1眼液组、0.1%地塞米松眼液组、0.4%雷帕霉素眼液组和1%环孢霉素A眼液组的IL-2、IL12、IFN-γ、TGF-β1和CTLA-4水平均无显着性差异（P>0.05）。8、各组植片中，对比空白组，1%环孢霉素A眼液组植片中IL-2mRNA和IFN-γmRNA表达量显着下降（P<0.05）；0.5%S1P1眼液组植片中TGF-β1mRNA和CTLA-4mRNA表达量显着增加（P<0.05），IL-12mRNA表达量显着下降（P<0.05）。9、小鼠角膜植片H&E染色和免疫组化检查提示：空白对照组显着水肿增厚、大量炎性细胞浸润，植片上皮和基质内大量CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增值浸润；0.5%S1P1眼液组上皮轻度水肿，基质层轻度增厚，植片内分布较多炎症细胞，植片上皮内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润；0.1%地塞米松眼液组角膜植片可见上皮轻度水肿，基质层轻度水肿增厚，植片内亦可见较多炎症细胞，植片基质层内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润；0.4%雷帕霉素眼液组上皮中度水肿，基质层无明显水肿，植片内亦可见较多炎症细胞，植片上皮层和浅层基质层内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润；1%环孢霉素A眼液组角膜植片可见上皮轻度水肿，基质层无明显水肿，植片内散在分布少量炎症细胞，角膜植片上皮层内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润。10、0.5%S1P1眼液联合用药实验中，空白对照组角膜植片平均存活时间为16.5±2.3天（n=8）；0.1%地塞米松眼液组角膜植片平均存活时间为32.7±4.0天（p<0.01, n=8）；0.5%S1P1+0.4%雷帕霉素眼液组角膜植片平均存活时间为31.8±3.8天（p<0.01, n=8）；0.5%S1P1+1%环孢霉素A眼液组角膜植片平均存活时间为33.1±3.9天（p<0.01, n=8）。11、0.5%S1P1眼液联合用药实验中，与空白对照组相比，0.1%地塞米松眼液组，0.5%S1P1混悬眼液联合0.4%雷帕霉素眼液组，0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液组均可延长植片的平均存活时间，且具有显着性差异（P<0.01）；叁个治疗组相比，在角膜植片术后平均生存时间方面，0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液组优于0.1%地塞米松眼液组，而0.1%地塞米松眼液组优于0.5%S1P1混悬眼液联合雷帕霉素眼液组，但是叁组在统计学上无显着性差异（P>0.05）。结论：1、在同种异体小鼠角膜移植模型中，局部使用0.5%S1P1眼液，0.4%雷帕霉素眼液和1%环孢霉素A眼液均可显着延迟小鼠角膜植片的平均存活时间，但叁治疗组之间无统计学差异。2、同以上叁个治疗组相比，0.1%地塞米松眼液组可以更好地延迟小鼠角膜植片的平均存活时间，并且有统计学差异。3、0.5%S1P1眼液显着增加外周血中成熟DCs比例，减少颈部引流淋巴结中的成熟DCs的比例。0.5%S1P1眼液可以显着降低DCs的抗原提成能力。4、0.5%S1P1眼液对外周血清中IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4等细胞因子水平无影响。5、0.5%S1P1眼液显着上调小鼠角膜植片内的TGF-β1和CTLA-4mRNA的表达量，显着下调IL-12mRNA的表达量。6、0.5%S1P1眼液显着减少角膜植片基质层和内皮层的炎症细胞的浸润；0.5%S1P1眼液能显着减少角膜植片中成熟DCs的浸润。7、在同种异体小鼠角膜移植术后联合用药方案中，0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液组小鼠角膜植片平均存活时间最长，两者具有协同免疫抑制作用。8、0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液可以替代0.1%地塞米松眼液抗同种异体小鼠角膜移植术后排斥。(本文来源于《中国人民解放军医学院》期刊2014-05-22）
罗媛媛,高玉,柳林[6]（2014）在《自然杀伤细胞在大鼠同种异体角膜移植排斥反应中作用的研究》一文中研究指出目的:检测大鼠同种异体角膜移植术后,随排斥反应发生发展,不同时间外周血及房水中自然杀伤细胞(Nature Killed cell)计数以及相关因子表达的变化,初步揭示NK细胞角膜移植排斥反应早期的作用。方法:选用远交系Wistar大鼠为受体与SD大鼠为供体建立同种异体角膜移植模型,于PO2、PO4、PO6、PO8、PO10、PO12对实验组20只大鼠,对照组20只大鼠,收集房水及外周血,进行NK细胞的流式细胞计数,观察术后不同时间,NK细胞(本文来源于《第十四届国际眼科学学术会议、第十四届国际视光学学术会议、第叁届国际角膜塑形学术大会论文集》期刊2014-03-28）
孙璐,赵海霞[7]（2013）在《CD_(40)-CD_(40)L和CD_(28)-B7共刺激信号在同种异体角膜移植免疫排斥反应中的研究进展》一文中研究指出角膜移植在器官移植手术中的成功率很高,而术后免疫排斥反应是导致移植失败的主要因素之一。目前已知角膜移植后免疫排斥反应的主要原因是T淋巴细胞介导的免疫排斥反应,而T淋巴细胞的激活是共刺激信号协同作用的结果。CD40-CD40L和CD28-B7共刺激信号在同种异体角膜移植免疫排斥中具有重要意义,而且两者具有协同作用,同时阻断这两个信号比单独阻断任一信号可延长移植物的存活时间。该文对CD40-CD40L和CD28-B7的生物学特性、免疫学功能以及两者的关系进行综述。(本文来源于《医学综述》期刊2013年22期）
王君怡[8]（2012）在《以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术后供体细胞的命运变化研究》一文中研究指出第一部分兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型的建立、评价及病理改变的研究目的：建立能够模拟临床过程的兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型,为研究碱烧伤造成的角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency, LSCD)提供科学、易行的研究模型。方法：兔碱烧角膜缘干细胞缺乏模型的建立及评价：(1)模型建立：将浸有1mol/L NaOH溶液的内径10mm,外径18mm的环形滤纸片置于新西兰雌性大白兔右眼角膜表面(包括角膜缘)30s,去除滤纸,同时在结膜囊内滴入1%NaOH1滴,0.9%生理盐水500m1冲洗结膜囊,建立兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型。伤后抗生素眼膏点眼1次/晚,常规饲养,定期裂隙灯下观察、照相；(2)模型评价：伤后30天,待炎症稳定后,对兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型进行评价：裂隙灯照相、评分；②印迹细胞学检查角膜结膜化程度；③活体共聚焦显微镜检查角膜缘及角膜各层结构及病理改变；④泪液分泌试验检测碱烧伤后泪液分泌情况；(3)病理学检查：板层切除伤后30d新生血管化的角膜,进行石蜡包埋后HE染色行组织病理学检查。结果：兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型的建立及评价：(1)模型建立情况：伤后即见球结膜缺血,角膜缘苍白,中央角膜轻度混浊；伤后14d见球结膜水肿、缺血,角膜混浊、水肿,虹膜纹理欠清,角膜缘新生血管长入；伤后30d,可见角膜混浊、新生血管长入、角膜上皮结膜化。(2)模型评价情况：①裂隙灯检查：根据化学伤临床评分标准对伤后30d的模型进行评分,其中86%(43眼/50眼)临床评分在6-10分,8%(4眼/50眼)临床评分<6分,2%(1眼/50眼)>10分,2%(1眼/50眼)角膜穿孔,2%(1眼/50眼)发生眼内炎；②印记细胞学检查示：角膜结膜化,可见杯状细胞存在；③活体共聚焦显微镜检查示：角膜缘栅栏结构消失,角膜上皮缺失,纤维组织覆盖,残存的角膜上皮细胞形态不规则,大量炎症细胞浸润,角膜上皮层及基质内见大量新生血管。④泪液分泌实验显示碱烧伤眼泪液分泌量较正常眼显着降低(p=0.000<0.05)；(3)病理学检查：切除的板层角膜组织表面粗糙不平,由异常增生的结膜上皮细胞覆盖,基质内可大量炎细胞浸润,新生血管丛生结论：碱烧伤是构建角膜缘干细胞缺乏模型的有效途径,利用碱液烧伤角膜缘可以成功的构建角膜缘干细胞缺乏模型,其方法易行、模型稳定,可以很好的模拟临床上碱烧伤造成的角膜缘干细胞缺乏症,为进一步研究提供了良好的基础。第二部分以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术后供体细胞的命运变化目的：1.以羊膜为载体构建同种异体角膜缘上皮干细胞膜片,并移植到兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型眼表,建立兔碱烧伤眼表重建模型；2.术后不同时间点检测移植的供体细胞存活情况,并在体追踪供体细胞移植后的命运变化,为临床治疗提供参考。方法：1.以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片的构建：(1)细胞培养：取新西兰大白兔雄兔角膜缘组织,通过消化法获取角膜缘上皮干细胞,以去上皮羊膜为载体培养角膜缘上皮干细胞膜片。待细胞长满羊膜并复层,进行CM-DiI标记。(2)细胞状态分析：①细胞增殖能力检测：将角膜缘干细胞接种至96孔板,利用MTT法检测培养1-7天的角膜缘干细胞增殖能力；②细胞标志物检测：将少部分培养好的角膜缘上皮干细胞膜片进行HE染色、免疫荧光化学检测角膜缘干细胞标志物ABCG2、p63及角膜上皮标志物CK3表达情况；PCR检测ABCG2、p63及CK3基因表达情况；③细胞衰老、凋亡及坏死检测：将培养好的角膜缘上皮干细胞膜片进行铺片,通过p-半乳糖苷酶染色法、TUNEL法及台盼蓝-茜素红染色分别检测细胞衰老、凋亡及坏死情况。2.同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术及术后供体细胞变化情况：(1)兔眼表重建模型建立：对碱烧伤角膜缘干细胞缺乏的模型兔进行血管膜切除+同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术,术后缝合睑裂,按照临床常规用药,建立兔碱烧伤眼表重建模型；(2)术后供体细胞存活情况检测：术后7,30,60,90d取角膜,进行冰冻切片,荧光显微镜下观察标记有CM-DiI的供体细胞的位置和数量；PCR检测Y染色体性别决定基因(SRY)表达情况,追踪供体细胞的存活情况。(3)术后供体细胞变化情况：术后1,3,7,30,60,90d通过组织病理学检测、免疫荧光化学及PCR等方法检测供体细胞分化、衰老、凋亡及坏死情况：①细胞分化检测：PCR检测ABCG2、p63、CK3的基因表达情况；②细胞衰老、凋亡及坏死情况检测：术后不同时间点通过β-半乳糖甘酶染色、TUNEL法及台盼蓝-茜素红染色分别检测移植术后供体细胞的衰老、凋亡及坏死情况。结果：1.以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片构建：(1)细胞培养：细胞接种后可在去上皮羊膜上粘附生长,并逐渐铺满羊膜表面,气-液界面培养(air-lifting)后可复至4-5层；(2)角膜缘上皮干细胞状态分析：①细胞增殖能力检测：MTT法检测角膜缘干细胞接种后3d增殖能力显着增加,6d达到顶峰,随后增殖能力下降；②细胞标志物检测：HE染色可见细胞结构清晰,着色好,显微镜下可见羊膜胶原纤维上角膜缘上皮干细胞生长,可复至4-5层,细胞结构完整,形态正常,与羊膜连接紧密；免疫组织化学检测见ABCG2、 p63、CK3表达阳性；PCR检测ABCG2、p63、CK3基因均呈阳性表达；③细胞衰老、凋亡及坏死检测：羊膜铺片可见羊膜表面极少量衰老、凋亡及坏死细胞,细胞生存状态良好。2.同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术及术后供体细胞变化情况：(1)兔眼表重建模型建立：对18例临床评分在6-10分之间的碱烧伤模型进行了移植手术,术毕5例(27.8%)羊膜荧光素钠染色阳性；(2)术后供体细胞存活情况：术后7,30,60d均可检测到表达红色荧光的供体细胞,SRY基因亦均有表达；术后90d时,1例移植成功的角膜中仍可检测到标记红色荧光的供体细胞,PCR可检测到角膜组织中SRY基因的表达,2例移植失败的角膜中未检测到标记红色荧光的供体细胞,亦未检测到SRY基因的表达。(3)术后供体细胞变化情况：术后1d见羊膜表面出现大量凋亡细胞,衰老及坏死细胞少见；术后3d羊膜表面凋亡、坏死及衰老细胞数量明显增加,通过DAPI复染细胞核发现,这些凋亡、衰老及坏死的细胞以炎细胞为主,仅少量为移植的供体细胞,上皮细胞数量较前增多,位于表层的细胞成团分布,有逐渐连接成片的趋势；术后7d时羊膜表面凋亡、坏死及衰老细胞均较3d时略有减少,炎细胞亦有所减少,上皮细胞数量及层数明显增加,大部分区域上皮细胞连接成片；术后30d大部分模型可形成相对完整的角膜上皮,但再生的角膜上皮与正常角膜上皮形态不同,细胞层数减少,明显变薄,基底部缺乏立方形上皮细胞,以扁平细胞为主,同时羊膜下炎细胞浸润,浅基质结构紊乱,大量凋亡、衰老细胞存在于此区；术后60d部分角膜出现再次新生血管化,荧光显微镜下仅可见少量红色荧光标记的供体细胞存在于角膜上皮基底层中,且部分发生凋亡／坏死,未血管化的角膜可见1-3层扁平的角膜上皮细胞,羊膜下仍有炎细胞浸润；术后90d时绝大部分角膜发生再次血管化,羊膜下炎细胞浸润明显,仅有1例在术后90d时仍维持角膜透明,眼表稳定,组织内无炎细胞,未见凋亡及衰老细胞。结论：以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片可在一定程度上改善碱烧伤眼表微环境,重建眼表功能。移植后7d内是供体细胞生存的关键时期,部分供体细胞因微环境改变而发生凋亡、衰老及坏死,其中凋亡是细胞死亡的主要形式。7-30d是供体细胞的抗击打适应期,生存下来的供体细胞可逐渐在受体眼表存活并分化,形成再生上皮,再生上皮较正常上皮层数减少,抵抗力差,大部分模型在术后60d时即出现角膜再次血管化,供体细胞逐渐减少并失活,少部分至术后90d时仍维持角膜透明,供体细胞可在受体眼表稳定的存活。眼表慢性炎症微环境可能是导致供体细胞死亡的重要因素,术前及术后积极抗炎治疗是提高移植成功率的关键。第叁部分以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞移植术后免疫排斥反应研究目的：检测培养的同种异体角膜缘上皮干细胞移植术后的免疫排斥反应的发生时间、特点,并观察抗排斥药物治疗效果方法：建立兔碱烧伤眼表重建模型,并根据手术及用药的不同分为四组：A、免疫抑制剂(环孢素眼液)点眼组；B、免疫抑制剂(环孢素缓释药)结膜下植入组；C、无免疫抑制剂组；D、自体角膜缘上皮干细胞移植组。术后裂隙灯观察各组免疫排斥反应的发生情况,并根据化学伤临床评分标准进行评分。取术后14,30,60d角膜,进行冰冻切片,利用免疫荧光化学方法检测各组角膜组织中CD4+、D8+T淋巴细胞表达情况；PCR检测CD4、CD8基因表达情况。结果：免疫排斥反应主要发生于术后30-60d,术后14d时各组均无免疫排斥发生。A、B组分别于术后30d和60d各发生1例免疫排斥,C组发生3例免疫排斥,其中2例于术后30d,1例于术后60d,D组无免疫排斥反应发生。A、B、C、D各组均可检测到角膜基质内不同程度的CD4+T淋巴细胞浸润,A、B、C组可检测到少量的CD8’T淋巴细胞,而D组未检测到CD8’T淋巴细胞。PCR显示C组术后30d时CD4及CD8基因表达量显着上调,与其他叁组比较均有显着性差异。术后30d时A组CD4及CD8基因表达量均高于B组,差异有统计学意义。结论：尽管与角膜/角膜缘移植相比,体外培养的同种异体角膜缘上皮干细胞移植术引发的免疫排斥反应时间晚,症状轻,但仍是影响供体细胞存活的重要因素。免疫抑制剂的应用有利于提高手术预后,其应用的关键时期为术后14-90d。CsA缓释药结膜下植入是一种安全、有效的抗免疫排斥治疗手段,但随缓释药物的吸收,免疫排斥反应几率升高,应及时补充免疫抑制剂。(本文来源于《武汉大学》期刊2012-04-01）
马瑞芳[9]（2011）在《同种异体角膜移植的护理体会》一文中研究指出角膜病是我国主要致盲性眼病之一,只有通过穿透性角膜移植才能获得一定视力。术前术后护理也是保证角膜移植片成功的重要组成部分。本研究中35例患者中无一例出现感染症状,无缝线脱落,伤口裂开、植片移位等并发症,术后恢复良好,大大提高了患者的生活质量。(本文来源于《中国医药科学》期刊2011年09期）
罗媛媛[10]（2011）在《大鼠同种异体角膜移植排斥反应动物模型的建立及NK细胞在角膜排斥反应中作用的研究》一文中研究指出角膜疾病是眼科临床工作中最常见的疾病之一,其致盲率在我国盲目流行病学调查中排名第二,仅次于白内障。且角膜损伤的瘢痕修复及角膜内皮细胞的不可再生性都严重影响角膜病的治疗和预后,因此,对于治疗角膜盲,角膜移植是临床上唯一可靠、有效的复明手段,与其他脏器移植比较.角膜移植有明显的免疫学特点即免疫特惠,尽管如此,随着现代显微手术和角膜保存技术的发展,移植术后的免疫排斥反应已成为角膜移植失败的主要原因。所以,建立合适的角膜移植动物模型,对进一步模拟人的角膜移植排斥反应,进行更加深入的基础研究具有非常重要的意义。角膜移植排斥反应的机制是多种免疫细胞和免疫分子参与的复杂的免疫反应过程,有效地防治角膜移植术后免疫排斥反应的发生是降低角膜移植排斥率的实际问题,大量研究依据辅助T淋巴细胞(helper t lymphocyte, Thl/Th2)学说探讨各类免疫细胞及细胞因子参与角膜移植排斥反应的调控机制,现今的研究和临床药物大多数针对T淋巴细胞系统,而近来实验证明剔除T淋巴细胞的动物角膜移植模型,仍然会发生排斥反应。自然杀伤细胞(Nature Killed Cell,NK细胞)是一类独立的淋巴细胞群,有报道提出NK细胞具有对异体抗原的识别,然后释放细胞因子来激活不同的效应细胞的作用,而国内关于NK细胞在角膜移植排斥反应中作用的研究尚未有相关报道。研究目的：建立大鼠同种异体角膜移植模型,观察角膜排斥反应的临床表现及进行排斥反应的病理学研究,分析手术中注意事项及操作技巧、术后并发症的原因及对策,提高大鼠角膜移植模型的成功率。初步研究NK细胞在大鼠同种异体角膜移植排斥反应中的作用。主要方法：1.大鼠同种异体穿透性角膜移植动物模型的建立1.1实验组：Wistar雌性大鼠40只,SD(Sprague-Dawley)雌性大鼠40只,用直径3.5mm的环钻钻取SD大鼠右眼角膜,作为同种异体角膜移植植片,用直径3.0mm的环钻钻取Wistar大鼠右眼角膜作为植床,用10-0尼龙线将角膜植片间断缝合于角膜植床上,为同种异体角膜移植组。1.2对照组：(?)(?)istar雌性大鼠40只,用3.0mm环钻钻取右眼角膜,于12：00位做标记,旋转180°后,用10-0尼龙线原位间断缝合于植床上,为同体角膜移植对照组。1.3术后观察：观察术后角膜移植排斥反应发生的进程,于术后不同时间对实验组及对照组大鼠角膜植片情况进行排斥反应评分。2.大鼠同种异体角膜移植排斥反应发生的病理学研究及并发症的分析实验组及对照组分别于PO6、PO8、PO12、PO24、PO45各取4只术眼眼球,10%甲醛固定,石蜡包埋,HE染色。观察随着排斥反应的发生发展,角膜植片可出现基质细胞浸润,植片厚度,植片新生血管,植片内皮细胞数目等方面变化。观察记录和总结术中术后并发症的发生和预防方法。3.自然杀伤细胞在大鼠同种异体角膜移植排斥反应中作用的研究分别于PO2、PO4、PO6、PO8、PO10、PO12等不同时间点,取实验组及对照组大鼠外周血,应用CD3-CD161+的NK细胞特异性抗体标记外周血内NK细胞,行流式细胞仪计数,分析NK细胞术后不同时间在淋巴细胞中所占比例的变化。实验结果1.SD大鼠与Wistar大鼠间同种异体角膜移植组与Wistar大鼠自体角膜移植组之间角膜排斥反应指数(Rejection Value RV值)存在明显差异,实验组排斥反应发生率为100%,异体移植片存活时间为(9.65+0.77)天。2.同种异体角膜移植组与自体角膜移植组大鼠植片病理切片中,在角膜植片基质浸润、植片厚度、新生血管等方面存在显着差异,两组共80例动物模型中术后出现虹膜前粘连6例,白内障4例,眼内感染3例,虹膜脱出3例。3.同种异体角膜移植组术后早期大鼠外周血中NK细胞占淋巴细胞比例明显高于对照组,结果有显着差异,NK细胞计数峰值出现在术后第(4.4±0.82)天。结论1.大鼠角膜主要组织相容性抗原的表达与人类角膜相似,且排斥反应发生率高,作为较理想的角膜移植动物模型,为模拟人角膜移植排斥反应,进行深入实验研究提供基础条件。选用远交系大鼠、偏中心植片及保留缝线等方法可增加角膜排斥反应的发生率2.熟练的显微技术、锐利的手术器械、充分的扩瞳及术后前房的形成是减少术后并发症的关键。3.NK细胞在大鼠同种异体角膜移植早期排斥反应起到一定作用。(本文来源于《第二军医大学》期刊2011-05-01）
同种异体角膜缘移植论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)是重要的免疫调节细胞群体,其对T细胞介导的免疫反应具有显着的抑制作用。它们除了在癌症发展过程中具有负向调节作用外,还对移植和自身免疫具有很强的调节作用。CD11b+Gr1+髓源抑制细胞能够使小鼠和人类产生同种异体移植物耐受已有广泛报道。然而,MDSCs的诱导因子,详细表型和功能分子等在各种移植模型中显着不同。它们在慢性移植排斥中的治疗作用尚不明确。本实验试图通过建立脂多糖(LPS)诱导小鼠脓毒血症的模型,采用免疫组化、流式细胞术、免疫磁珠分选等方法分离MDSCs,确定其细胞数量,并检测其细胞表型以及细胞功能。通过尾静脉注射的方法将MDSCs过继转移给同种异体角膜移植受体小鼠体内,观察角膜移植术后移植片的存活情况,从而探讨MDSCs在角膜移植中的作用。方法1.将6-8周雄性C57BL/6(H-2b)小鼠,随机分为对照组(PBS组)和实验组(LPS处理组),每组各5只。实验重复2次。2.5mg/kg LPS腹腔内注射给C57BL/6小鼠,每日一次,共7天。对照组采用同样方法给予腹腔内注射相同剂量的PBS。每日观察生命体征,绘制生命曲线,7天后处死小鼠。2.制备小鼠脾脏、骨髓及外周血单细胞悬液,取50ul上述各组单细胞悬液于流式管中,加入FITC-CD11b抗体,PE-CY5-Gr-1抗体,以FITC、PE/CY5通路圈门MDSCs,流式分析软件分析、成图。将上述制备的各组单细胞悬液离心去上清液后的细胞沉淀中加入0.4ml PBS及0.1ml抗Gr-1生物素,4°C冰箱反应10分钟。离心,弃上清,以2ml PBS重悬,摇匀。将单细胞悬液滴入MDSCs免疫磁珠分选柱中,分选出CD11b+Gr-1 MDSCs,用流式细胞学技术检测MDSCs分选纯度。同样的方法进行CD4+T细胞免疫磁珠分选,用流式细胞学技术检测CD4+T细胞分选纯度。3.将分离的CD11b+细胞加入PBS缓冲液调整浓度为1×106/ml,各取100ul分别加入10ul FITC标记的Ly6C、CD40、CD80、CD86、CD273、CD275、TLR2、TLR4、MHC-II抗体,每组抗体均设有同型对照组,室温避光孵育15分钟。加入PBS缓冲液离心洗涤抗体,上流式细胞仪检测。实验数据进行统计学分析。4.分离的CD11b+细胞重新混悬后,加入终末浓度1mg/ml FITC结合的OVA(OVA-FITC),或者相同比例的CD4+T细胞和CD11b+T细胞,然后进行流式细胞仪测定。取LPS腹腔注射7天组小鼠骨髓细胞分选出的CD11b+细胞与CFSE染色后的小鼠脾CD4+T细胞共培养,将T细胞以1×105/孔的密度接种到96孔板中,CD4+T细胞与CD11b+细胞按1:1、1:2、1:4以及1:8比例接种,检测CD11b+细胞对CD4+T淋巴细胞增殖的抑制能力。留出部分CFSE染色的CD4+T细胞不加CD11b+细胞作为阳性对照;每一孔加入1ul鼠抗CD3/28增殖磁珠刺激,将未加CD3/28增殖磁珠刺激的细胞作为阴性对照。流式细胞仪分别检测各个细胞亚群及其不同比例的混合管CD4+T细胞的CFSE荧光强度,以反映其增殖情况;flowjo软件分析,计算抑制率。5.小鼠行同种异体角膜移植,并随机分为实验组和对照组(n=10),在实施穿透角膜移植手术后即刻予小鼠尾静脉注射1×106 LPS诱导小鼠提取的CD11b+Gr1+细胞,对照组注射等量的PBS。每日通过裂隙灯显微镜观察角膜植片情况。观察每组的植片存活率8周以上。根据角膜移植片混浊、水肿、新生血管叁项指标进行评分。当植片的评分达到6或6以上,或者植片混浊一项达到3时,即认为发生免疫排斥反应。由2人同时观察计分并取平均值。通过描绘Kaplan-Meier存活曲线记录植片存活率,组间比较采用log-等级分析。结果1.本研究采用适当剂量(2.5mg/kg)LPS腹腔内连续注射的方式,成功复制了脓毒症小鼠的模型。小鼠注射LPS 12小时后,开始出现病态反应,3-4天达死亡高峰,至7天时病死率约为30%。PBS注射组小鼠7天内未见死亡。随后第8天分析测定LPS诱导模型体内CD11b+Gr1+细胞的表达,脾脏、血液和骨髓中CD11b+Gr1+细胞增加。对照组脾脏中CD11b+Gr1+细胞数目增加了2.9%,而LPS诱导小鼠组为15.8%。同样,LPS诱导小鼠骨髓中CD11b+Gr1+细胞由5.4%增加到29.4%;血液中为0.3%增加到9.3%.这些结果表明在脓毒血症小鼠脾脏、血液和骨髓中CD11b+Gr1+细胞明显增加。其在骨髓中的增加幅度最大。2.CD11b+Gr1+细胞的表型:采用流式细胞分析仪检测了不同的细胞表面标志的表达。LPS诱导小鼠产生的CD11b+Gr1+细胞表面的共刺激分子CD80/CD86、CD40、免疫抑制分子PD1L/PD-1以及TLR4的表达与对照组相似,但Ly6C、TLR2以及MHC-Ⅱ的表达明显增强。3.CD11b+细胞与CD4+T细胞和OVA共培养的结果表明超过98%CD11b+细胞6小时后与可溶性Ag OVA结合,而67%和72%的CD4+T细胞在12小时和24小时后分别产生反应。当CD11b+/T细胞比例为1:2时,CD4+T细胞的增殖抑制达到52%。当二者比例为1:8时,LPS诱导小鼠组的抑制率为30%,而对照组未观察到抑制效果。4.在对实施穿透角膜移植手术后即刻予小鼠尾静脉注射1×106 LPS诱导小鼠提取的CD11b+Gr1+细胞,观察小鼠角膜植片存活情况的同时观察小鼠全身状况。注射小鼠全身均未见明显异常反应,表明LPS诱导的CD11b+细胞过继转移是安全的。CD11b+细胞治疗组的植片存活率明显高于对照组(P=0.02)。CD11b+细胞处理组的平均存活时间为21.4天,而对照组为10.9天。结论实验结果表明LPS诱导后CD11b+Gr1+细胞在脾脏、血液和骨髓显着增加,而且能够抑制活化的CD4+T细胞。骨髓中MDSCs的高表达TLR2表明内毒素感染和非内毒素感染模型之间的表型差异。脂多糖诱导的CD11b+细胞可以发挥抑制性APCs的作用,能够抑制CD4+T细胞的增殖,提高角膜植片的存活率。因而MDSCs参与延迟移植排斥和移植免疫耐受的诱导,预测其将来可用于临床细胞转移治疗移植排斥。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
同种异体角膜缘移植论文参考文献
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[3].吕婷婷.雷公藤甲素在大鼠同种异体角膜移植手术中对CD4+CD25+调节性T细胞的影响[D].吉林大学.2016
[4].王博.探讨熊果酸对大鼠同种异体角膜移植排斥反应的实验研究[D].南方医科大学.2015
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[10].罗媛媛.大鼠同种异体角膜移植排斥反应动物模型的建立及NK细胞在角膜排斥反应中作用的研究[D].第二军医大学.2011