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长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达

2020-12-08阅读(461)

长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达

论文摘要

长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）来源的普鲁兰酶（GenBankNo.JN872757.1）在高温、酸性环境条件下有较好的耐受性,满足淀粉工业中糖化过程的要求,可以提高淀粉质原料的利用率,提高工业生产的效率。枯草芽孢杆菌是食品级生产菌株,具有完善的蛋白转录翻译和分泌系统。因此,本研究通过同源重组,将长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因整合在枯草芽孢杆菌基因组中进行表达,构建了分别包含组成型启动子PHpaⅡ和诱导型启动子PsacB的枯草芽孢杆菌表达系统,并对酶活较高的重组菌进行了发酵优化,主要内容如下:（1）从以往构建的穿梭质粒pMA0911-PHpaⅡ-pul中获得普鲁兰酶基因表达框PHpⅡ-pul,构建了枯草芽孢杆菌整合载体pDL-PHpaⅡ-pul,并将普鲁兰酶基因分别整合在B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的基因组中实现胞外表达,经过72 h发酵,重组菌B.subtilis WB800-PHpaⅡ-pul（以下简称8H）和B.subtilis WB600-PHpa Ⅱ-pul（以下简称6H）的胞外酶活分别为30.32U·mL-1和18.83U·mL-1。对于包含组成型启动子PHpaH的枯草芽孢杆菌表达系统,选择酶活较高的菌株进行发酵条件的优化,8H在最佳发酵条件下即接种量2%（v·v-1）,培养基初始pH7.0,培养温度30℃,摇床转速250r·min-1,酶活最高达到60.85 U·mL-1,约为优化前重组菌8H胞外酶活的2倍;（2）从以往构建的穿梭质粒pMA0911-PsacB-pul中获得普鲁兰酶基因表达框PsacB-pul,并构建了枯草芽孢杆菌整合载体pDL-PsacB-pul,并将普鲁兰酶基因分别整合在B.subtilisWB600和B.subtilis WB800的基因组中实现胞外表达,经过72 h蔗糖诱导,重组菌B.subtilis WB600-PsacB-pul（以下简称6S）和B.subtilis WB800-PsacB-pul（以下简称8S）的胞外普鲁兰酶酶活分别为5.34 U·mL-1和13.19 U·mL-1。对于包含诱导型启动子PsacB的枯草芽孢杆菌表达系统,选择酶活较高的菌株进行蔗糖诱导条件的优化,8S在最佳诱导条件下即蔗糖诱导剂终浓度2%（w·v-1）,初始诱导OD600为0.4,诱导温度20℃,酶活最高达到48.59 U·mL-1,约为优化前重组菌8S胞外酶活的3.7倍。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 普鲁兰酶概述
  •   1.2 普鲁兰酶的研究进展
  •     1.2.1 普鲁兰酶的产酶微生物及其酶学性质
  •     1.2.2 普鲁兰酶异源表达的研究进展
  •   1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
  •     1.3.1 概述
  •     1.3.2 枯草芽孢杆菌宿主菌株
  •     1.3.3 枯草芽孢杆菌的启动子
  •   1.4 枯草芽孢杆菌整合载体
  •     1.4.1 枯草芽孢杆菌整合载体的整合机理
  •     1.4.2 枯草芽孢杆菌整合载体的整合方式
  •   1.5 本课题的立题意义与研究内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 供试菌株,质粒与引物
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 培养基与溶液
  •     2.1.4 主要仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 枯草芽孢杆菌整合质粒的构建
  •     2.2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化
  •     2.2.3 重组菌株的筛选与鉴定
  •     2.2.4 重组菌株生长曲线和发酵曲线的测定
  •     2.2.5 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化
  •     2.2.6 普鲁兰酶表达的SDS-PAGE分析
  •     2.2.7 普鲁兰酶酶活的测定
  • 第三章 结果与讨论
  • HpaⅡ-pul和pDL-PsacB-pul的构建'>  3.1 整合质粒pDL-PHpaⅡ-pul和pDL-PsacB-pul的构建
  •     3.1.1 普鲁兰酶基因表达框的扩增
  • HpaⅡ-pul的构建'>    3.1.2 整合质粒pDL-PHpaⅡ-pul的构建
  • sacB-pul的构建'>    3.1.3 整合质粒pDL-PsacB-pul的构建
  •   3.2 枯草芽孢杆菌整合菌株的筛选与鉴定
  •     3.2.1 氯霉素筛选枯草芽孢杆菌转化菌株浓度的确定
  •     3.2.2 枯草芽孢杆菌整合菌株基因组的鉴定
  •   3.3 组成型重组菌株的表达与发酵优化
  •     3.3.1 重组菌普鲁兰酶的表达分析
  •     3.3.2 重组菌8H发酵条件的优化
  •     3.3.3 最佳发酵条件下的发酵过程曲线
  •   3.4 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化
  •     3.4.1 蔗糖诱导型重组菌株的表达
  •     3.4.2 蔗糖诱导表达条件的优化
  •     3.4.3 最佳诱导条件下的发酵过程曲线
  • 主要结论与展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王越

    导师: 聂尧

    关键词: 普鲁兰酶,枯草芽孢杆菌,整合载体,同源重组,发酵优化

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 江南大学

    基金: 国家自然科学基金项目“基于多结构域和柔性结构特征的普鲁兰酶识别淀粉分支结构的分子机制与性能调控”,项目号31872891,江苏省六大人才高峰计划项目“淀粉糖质资源高效利用的普鲁兰酶开发研究”,项目号2015-NY-007

    分类号: Q78

    总页数: 44

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