郜凌云(黑龙江省哈尔滨市胸科医院150056)
【中图分类号】R521【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)19-0037-02
痰液中查到结核菌是诊断肺结核病的最重要依据。长期以来，在结核病细菌学诊断的传统方法中，临床标本直接涂片镜检抗酸菌，尽管操作技术简便易行。但检出率低，特异性差；而分枝杆菌培养虽能提高阳性率，可是需要很长时间，从而影响结核病的及时诊断．因而我们根据1985年Mulis等创建的聚合酶链反应体外DNA扩增技术，应用于肺结核诊断的研究，以其建立一种快速、敏感、特异的诊断方法，为在结核病临床诊断中逐步推广使用提供参考。现将实验研究结果报告如下：
1材料和方法
1.1标本来源69例结核性痰标本、22例结核性胸水、17例非结核性痰标卒(肺炎9例，支气管扩张3例，肺癌5例)、8例癌性胸水，均来源于本所和市胸科医院病人，根据临床表现，胸部x线检查以及细菌学或病理组织学检查确诊的。
1.2涂片和培养检查临床标本除PCR检测外，同时作涂片和培养检查以资对比。涂片和培养按常规方法进行(1)。涂片在油镜下观察300个视野见到3条以上抗酸菌或在培养基斜面上生长20个以上菌落即判为阳性。
1.3临床标本DNA提取取痰液1～2ml加等量1×Tris.HCL-EDTA溶液后，再加消化液50μl。置80℃水浴30分钟，其间振摇数次,2500～3000rpm离心10分钟。取上清0.5ml加裂解液50μl,置95℃水浴15～20分钟后，分别加等量平衡酚、酚／氯仿、氯仿各抽提一次。再取上清加1/l0体积NaAC溶液和2倍体积无水乙醇混合后，置-20℃冰箱内2小时以上，在4℃10000～12000rpm离心30分钟。弃去上清，风干沉淀，溶于适量TE中备用。胸水标本勿需消化处理，其余步骤与痰标本DNA提取方法相同。
1.4引物合成采用Pao等(2)报道的寡核苷酸序列引物，1．CTAGGTCGGGTGAGGCCAGG，2．CATTGCGAAG
TGATTCCTCCGGAT，由解放军309医院结核病研究室合成和提供。
1.5PcR扩增取临床标本DNA溶液5微升，加入500μI塑料离心管中。顺序加入ddH2O16.5微升，10×buffer2.5微升、4×dNTP2.0微升，Primer2.0微升，DNA2.0微升混匀，95℃变性10分钟，稍冷却后加TagDNA多聚酶0.2～0.5微升，加灭菌液体石蜡40微升，短时离心使之分层良好，置扩增仪94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，重复循环35次，最后72℃延伸7分钟。
1.6扩增产物检测取扩增后样品5～10微升，在2％琼脂糖凝胶中电泳。电压60～80V，30分钟后在紫外线检测仪254nm下观察电泳带，可见165bp扩增带即可判定为PCR检测结核杆菌DNA阳性。
1.7每次PCR扩增均没有人型结核杆菌(H37PV)DNA阳性对照及无模板DNA阴性试剂对照。
2结果
2.1PCR检测结核菌DNA敏感性和特异性的观察本试验将纯化的人型结核菌DNA，由每微升100ng开始l0倍系列稀释到10fg，分别进行PCR检测。结果显示100ng至100fgDNA均可见165bP阳性扩增带，在7种受试抗酸分枝杆菌中，除人型结核菌、中型结核菌和BCGDNA可见165bp特异性扩增带外，其余4种分枝杆菌(鸟、胞内、堪萨斯，瘰疬分枝杆菌)DNA均末见该扩增片段．本实验表明，应用PCR方法检测结核杆菌复合体具有高度的敏感性和特异性，与国内报道一致。
2.2临床标本检测结果本实验116例患者临床标本分别作涂片。培养和PCR检测，17例非结核性痰标本及8例癌性胸水的涂片镜检、培养和PCR检测结果均为阴性、69例结核性痰标本及22例结核性胸水的涂片阳性率分别为：24.6％，4.5％，培养阳性率分别为37.7％，0(末见阳性)，而PCR阳性率分别为73.9％、68.2％，明显高于前两种方法，经统计学处理均有显著差异(P均<0.01)，与文献报道相仿。(见附表)。
附表91例结核性临床标本三种方法检验结果比较
标本例数阳性例数（%）
涂片镜检培养PCR
痰6917（24.6%）26(37.7)51(73.9)
胸水221(4.5%)0(0)15(68.2)
3讨论
本文实验研究结果表明，应用PCR技术可检测出100ng至100fg结核菌DNA，因而具有极高的敏感性，结果也表明，所选择的扩啬靶序列和引物，只有人型结核菌，牛型结核菌和BCGDNA可见165bp特异性扩增片段，其余受试非结核性分枝奸菌均未见任保扩增带，从而显示对结核分枝杆菌复合体具有高度本组116例临床标本中，25例非结核性临床标本采用涂片、培养和PCR等三种方法检查结果均为阴性，91例结核性标本PCR阳性检出率明显高于涂片和培养的传统细菌学检查方法，而且临床标本无需经过培养可直接用于检测，操作方法较为简便，短时间内即可出结果，显著缩短了报告时间。
总之，通过本实验研究证实，应用PCR体外基因扩啬技术诊断结核病具有敏感性高，特异性强、简便和快速等优点，对结核病早期诊断和鉴别诊断以及化疗后排菌情况观察是极为有利的，是值得推广的新技术。
参考文献
[1]刘健,王斌,潘志美,田培坤,张文祥;聚合酶链反应法扩增免疫球蛋白变区基因[J];江西科学;1993.
[2]顾敏杰,左瑾,方福德,陈兰英;聚合酶链反应法扩增大鼠肾素基因第一内含子中串联重复序列[J];基础医学与临床;1993年.