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番茄O-乙酰丝氨酸硫醇裂解酶家族基因的鉴定与功能分析

2020-12-08阅读(737)

番茄O-乙酰丝氨酸硫醇裂解酶家族基因的鉴定与功能分析

论文摘要

元素硫（S）对于植物来说,是一个重要的营养元素,参与植物许多生物进程,植物将自然界中的硫元素吸收同化为半胱氨酸等含硫化合物以提供植株生长发育的基本营养并参与植物本身的各种代谢过程。半胱氨酸是植物硫同化过程中产生的第一个含硫有机物,在植物纷繁复杂的生命活动中发挥关键作用,同时半胱氨酸本身及其衍生物也是植物体内重要的信号分子。在植物体内,半胱氨酸合成主要依赖两种酶,O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶（O-acetylserine（thiol）lyase,OASTL）和丝氨酸乙酰转移酶（Serine acetyltransferase,SAT）,这两种酶组成半胱氨酸合酶复合物,在植物体内合成半胱氨酸,并且维持硫素的平衡。其中OASTL蛋白催化半胱氨酸合成的最后一步,在半胱氨酸的生物合成过程中具有重要作用。番茄是我们日常生活中很重要的一类蔬果,同时也是植物学研究领域中的一种重要模式植物,在番茄中研究OASTL家族基因的功能对于我们深度解析番茄中的硫代谢过程,发掘更多番茄品质和抗逆性相关基因具有重要指导意义。在本论文中,我们主要以番茄MicroTom这一品种作为研究材料,从生物信息学、生物化学、分子和细胞生物学等方面对番茄中OASTL家族基因进行了系统的研究。主要研究结果如下:1.克隆得到了8个番茄OASTL基因的编码区（SlOAS2-SlOAS9）,在这八个基因中,SlOAS3与数据库中的预测不同,保留了所有的内含子,生物信息学分析结果表明SlOAS3编码若干小肽,不编码功能性的OASTL蛋白。蛋白序列分析结果表明该基因家族在PLP结合位点是保守的,都含有PLP结合所必需的氨基酸;SlOAS9基因编码的蛋白序列较长,与同家族其它蛋白相比较相似性较低,同时在底物结合位点（TSGNT）存在突变;系统发育分析进一步表明SlOAS9不属于任何已报道的OASTL亚家族,同时番茄OASTL家族成员可能已经丢失S-磺基半胱氨酸合酶的（SSCS）功能。2.亚细胞定位结果表明番茄OASTL家族蛋白在细胞中分布各异。SlOAS2、SlOAS4和SlOAS6定位于细胞膜,细胞核和细胞质中;SlOAS5定位于叶绿体中;SlOAS7与自噬体共定位;SlOAS8在线粒体表达,而SlOAS9在过氧化物酶体中表达。3.酵母双杂交结果表明SlOAS5和SlOAS6可以与SAT发生互作;同时转录自激活活性分析结果表明SlOAS7具有转录自激活活性。蛋白酶活分析结果显示SlOAS5和SlOAS6具有合成半胱氨酸的能力,这与酵母双杂交结果一致;SlOAS2、SlOAS4、SlOAS5和SlOAS6具有催化H2S生成的能力;同时SSCS活性在番茄OASTL家族中已丢失。4.表达模式分析结果显示SlOAS家族各基因在植物的不同组织部位表达模式不尽相同,暗示这些基因在番茄生长发育过程中的功能各异。综上所述,在本研究中我们对番茄OASTL家族成员进行了系统的研究,对其功能进行了初步的分析与预测,这些结果为后续进一步研究该家族基因功能以及番茄中硫代谢过程的深入解析奠定基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 硫元素对植物的影响及其代谢过程
  •     1.1.1 硫对植物生长发育的影响
  •     1.1.2 硫的代谢过程
  •   1.2 半胱氨酸
  •     1.2.1 半胱氨酸对植物生长发育的影响
  •     1.2.2 半胱氨酸合成及代谢
  •   1.3 OASTL蛋白研究进展
  •     1.3.1 OASTL蛋白的结构与催化机制
  •     1.3.2 OASTL蛋白的催化活性
  •     1.3.3 OASTL蛋白在植物生长发育过程中的功能研究
  •   1.4 本研究的意义
  • 第二章 番茄OASTL家族基因的克隆与序列分析
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 植物材料的培养与获得
  •     2.1.2 所用到的各种试剂与仪器
  •     2.1.3 主要培养基和溶液的配制
  •     2.1.4 引物列表
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 番茄总RNA提取及c DNA序列的获得
  •     2.2.2 番茄OASTL基因片段的克隆
  •     2.2.3 番茄OASTL家族基因结构,蛋白序列以及系统进化分析
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 番茄OASTL家族基因的克隆
  •     2.3.2 SlOAS家族基因的基因结构分析
  •     2.3.3 SlOAS蛋白序列分析以及系统进化分析结果
  •   2.4 讨论
  • 第三章 番茄OASTL家族蛋白的亚细胞定位研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 植物材料的获得以及用到的载体及菌株
  •     3.1.2 各种试剂、仪器以及耗材
  •     3.1.3 各种溶液以及培养基的配制
  •     3.1.4 引物列表
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 亚细胞定位载体构建
  •     3.2.2 亚细胞定位
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 番茄OASTL家族蛋白的亚细胞定位分析
  •   3.4 讨论
  • 第四章 番茄OASTL家族蛋白与SAT家族蛋白的互作分析
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 实验所用的菌株和质粒
  •     4.1.2 实验所用到的试剂仪器
  •     4.1.3 培养基以及相关试剂的配制
  •     4.1.4 引物列表
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 酵母双杂交载体构建
  •     4.2.2 酵母转化
  •   4.3 实验结果
  •   4.4 讨论
  • 第五章 番茄OASTL家族蛋白的酶活分析
  •   5.1 实验材料
  •     5.1.1 实验所用的载体以及菌株
  •     5.1.2 实验所用到的试剂以及仪器
  •     5.1.3 培养基与相关溶液的配制
  •     5.1.4 引物列表
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 番茄OASTL家族基因原核表达载体的构建
  •     5.2.2 番茄OASTL家族基因的表达纯化
  •     5.2.3 蛋白胶的制备
  •     5.2.4 番茄OASTL家族基因的酶活分析
  •   5.3 实验结果
  •     5.3.1 番茄OASTL家族蛋白原核表达载体的构建
  •     5.3.2 番茄OASTL家族蛋白的原核表达与纯化结果
  •     5.3.3 番茄OASTL家族基因的酶活分析结果
  •   5.4 讨论
  • 第六章 番茄OASTL家族成员的表达模式分析
  •   6.1 实验材料
  •     6.1.1 植物材料的获取
  •     6.1.2 实验所用到的试剂耗材
  •     6.1.3 仪器
  •     6.1.4 引物列表
  •   6.2 实验方法
  •     6.2.1 番茄RNA提取及cDNA的获得
  •     6.2.2 番茄OASTL家族基因的组织特异性表达分析
  •     6.2.3 qRT-PCR数据分析
  •   6.3 实验结果
  •     6.3.1 番茄OASTL家族基因的组织特异性表达分析结果
  •   6.4 讨论
  • 结论
  • 展望
  • 参考文献
  • 硕士期间发表的论文
  • 致谢
  • 个人简况及联系方式

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 卢娟娟

    导师: 刘旦梅

    关键词: 番茄,乙酰丝氨酸硫醇裂解酶,半胱氨酸,亚细胞定位,酵母双杂交,酶活分析

    来源: 山西大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 山西大学

    基金: 国家自然科学基金:(31501772),山西省青年科学基金:(201601D021097)

    分类号: Q943.2

    DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000062

    总页数: 95

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